枯草芽孢桿菌全細(xì)胞催化高效合成α-熊果苷

周祺，呂雪芹，柴雪瑩，劉延峰，李江華，堵國成，劉龍*

1(江南大學(xué)，未來食品科學(xué)中心，江蘇 無錫，214122) 2(糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)

熊果苷是一類天然的糖苷類化合物，由葡萄糖和對苯二酚(hydroquinone,HQ)通過糖苷鍵連接而成，自然界中主要存在于植物果皮及樹葉中。熊果苷具有抗菌[1-2]、抗氧化[3-4]等作用，因而在醫(yī)藥領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用。此外，熊果苷作為亮膚劑被廣泛用于各類化妝品中[5]。由于葡萄糖和HQ之間可形成α-和 β-兩種構(gòu)型的糖苷鍵，因此熊果苷也被分為α-熊 果苷和β-熊果苷兩種。天然存在的熊果苷均是β-型， α-熊果苷可通過有機(jī)合成和微生物轉(zhuǎn)化[6]的方法獲得。相較于β-熊果苷，α-熊果苷在美白功效及安全性方面都更具優(yōu)勢[7-8]。約60年前，日本學(xué)者通過化學(xué)法成功合成了α-熊果苷[9]，但該方法存在產(chǎn)物立體選擇性差、反應(yīng)條件劇烈、產(chǎn)生大量副產(chǎn)物等的不足[10]，因此，更符合綠色環(huán)保發(fā)展理念的生物轉(zhuǎn)化法合成α-熊果苷成了目前研究的熱點(diǎn)。α-熊果苷的生物轉(zhuǎn)化是在一類葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下，將葡萄糖基轉(zhuǎn)移至HQ的酚羥基上，并特異性形成α-糖 苷鍵[11-12]。目前研究發(fā)現(xiàn)的7種微生物來源的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶均以HQ作為受體底物，但不同種類的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶需要不同的供體底物，如蔗糖、麥芽糖、淀粉等[12-13]。

蔗糖磷酸化酶(sucrose phosphorlase，SPase，EC 2.4.1.7)是第一個(gè)被研究用于生物轉(zhuǎn)化合成α-熊果苷的酶，該酶以蔗糖和HQ作為供體和受體底物，特異性合成α-熊果苷。在催化過程中，蔗糖并不需要使用二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)、二磷酸尿苷(uridine diphosphate，UDP)這類昂貴的物質(zhì)作為前體[14]，由此推測該酶可利用蔗糖中糖苷鍵斷裂時(shí)釋放的能量來形成α-熊果苷中的糖苷鍵；此外，該酶的催化活力也不依賴于輔因子[15-16]。KITAO等[17]的研究表明SPase能夠?qū)ⅵ?葡萄糖基轉(zhuǎn)移到23種酚類及其相關(guān)化合物中，且該酶對于α-熊果苷的合成表現(xiàn)出很高的轉(zhuǎn)糖基化效率，摩爾轉(zhuǎn)移率達(dá)到了65%。變異鏈球菌(Streptococcusmutans)來源的蔗糖磷酸化酶(SmSP)穩(wěn)定性較好，對蔗糖具有最高的底物親和力。

本文在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，以枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) WB600和B.subtilisWB800為出發(fā)菌株，對S.mutansUA159來源的蔗糖磷酸化酶(SmSPI336L，在本文中表示為Smut)進(jìn)行異源表達(dá)，通過采用整合表達(dá)、優(yōu)化核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ribosome binding site, RBS)序列和優(yōu)化全細(xì)胞催化條件的策略，獲得了具有高效催化潛力的重組B.subtilisBS8-P43-RBSopt-3Smut，α-熊果苷的產(chǎn)量可達(dá)到 119.44 g/L， 底物HQ的摩爾轉(zhuǎn)化率為96.56%。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

研究使用的菌株、質(zhì)粒見表1。大腸桿菌(Escherichiacoli) JM109用于重組DNA實(shí)驗(yàn)，B.subtilisWB600、B.subtilisWB800為本實(shí)驗(yàn)的出發(fā)菌株。菌株、質(zhì)粒全部保藏在本實(shí)驗(yàn)室。

表1 本研究所用菌株和質(zhì)粒

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

種子培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨12，酵母粉24，KH2PO42.31，K2HPO412.54，甘油 4 mL/L。115 ℃，20 min。

培養(yǎng)基中添加相應(yīng)的抗生素(μg/mL)：氨芐青霉素100、卡那霉素50、壯觀霉素100。

PB緩沖液(20 mmol/L，pH 7.0)：分別配制0.2 mol/L 的NaHPO4和0.2 mol/L的Na2HPO4，從中各取39 mL和61 mL，加入蒸餾水定容至1 L，即獲得20 mmol/L，pH 7.0的PB緩沖液。

HPLC流動(dòng)相：10 mmol/L稀磷酸與甲醇混合，體積比為8∶2。

Prime STAR(max)DNA聚合酶、DNA marker，TaKaRa公司；TaqDNA聚合酶，南京諾唯贊生物科技有限公司；分子操作相關(guān)試劑盒，上海生工生物工程有限公司；α-熊果苷的標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma-Aldrich；其他常規(guī)試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Smut表達(dá)框的構(gòu)建及整合

使用引物yqhB-rh-1F/R，yqhB-rh-4F/R，從B.subtilisWB600基因組上分別擴(kuò)增待整合位點(diǎn)的上下游同源臂各1 000 bp；使用引物yqhB-rh-2F/R，以質(zhì)粒p7S6為模板，擴(kuò)增lox71-spc-lox66序列；使用引物yqhB-rh-3F/R，以質(zhì)粒pP43NMK-Smut為模板，擴(kuò)增帶有P43啟動(dòng)子的目的基因片段P43-smut。

使用引物yqhB-rh-zong-F/R，通過融合PCR技術(shù)將上下游同源臂、lox71-spc-lox66序列和P43-smut序列進(jìn)行融合，獲得待整合表達(dá)框yqhB-P43-smut。所用引物見表2。

將表達(dá)框yqhB-P43-smut片段分別轉(zhuǎn)化B.subtilisWB600和B.subtilisWB800的感受態(tài)細(xì)胞，通過壯觀霉素抗性標(biāo)記來篩選陽性轉(zhuǎn)化子BS6-P43-Smut和BS8-P43-Smut。

1.2.2 Smut表達(dá)框中啟動(dòng)子的替換及表達(dá)框整合

使用引物yqhB-rh-2F和pS10-2R，以質(zhì)粒pS10-566為模板，擴(kuò)增帶有P566啟動(dòng)子序列的lox71-spc-lox66-P566片段；使用引物smut-3F和yqhB-rh-3R，以質(zhì)粒pP43NMK-Smut為模板，擴(kuò)增目的基因smut。

使用引物yqhB-rh-zong-F/R，通過融合PCR技術(shù)將1.2.1中的上下游同源臂、lox71-spc-lox66-P566片段和smut片段進(jìn)行融合，獲得待整合表達(dá)框yqhB-P566-smut。所用引物見表2。

將表達(dá)框yqhB-P566-smut片段分別轉(zhuǎn)化B.subtilisWB600和B.subtilisWB800的感受態(tài)細(xì)胞，通過壯觀霉素抗性標(biāo)記來篩選陽性轉(zhuǎn)化子BS6-P566-Smut和BS8-P566-Smut。

1.2.3 P43-Smut的多位點(diǎn)整合

使用引物yitR-rh-1F/R和yitR-rh-4F/R, amyE-rh-1F/R和amyE-rh-4F/R, ymzB-rh-1F/R和ymzB-rh-4F/R分別擴(kuò)增得到待整合位點(diǎn)yitR,amyE,ymzB的上下游同源臂。使用引物yitR-rh-2F/3R, amyE-rh-2F/3R, ymzB-rh-2F/3R，以1.2.1中構(gòu)建完成的表達(dá)框yqhB-P43-smut為模板，分別擴(kuò)增相應(yīng)的片段。使用引物yitR-rh-zong-F/R, amyE-rh-zong-F/R, ymzB-rh-zong-F/R，通過融合PCR技術(shù)得到待整合表達(dá)框yitR-P43-smut,amyE-P43-smut,ymzB-P43-smut。所用引物見表2。

將3個(gè)表達(dá)框片段依次轉(zhuǎn)化BS8-P43-Smut的感受態(tài)細(xì)胞，通過壯觀霉素抗性標(biāo)記來篩選陽性轉(zhuǎn)化子BS8-P43-2Smut, BS8-P43-3Smut, BS8-P43-4Smut。由于多重抗性標(biāo)記會影響篩選效率，因此在每一輪基因整合之前，都使用cre-lox系統(tǒng)將壯觀霉素抗性標(biāo)記消除。

1.2.4smut基因的RBS序列優(yōu)化及多位點(diǎn)整合

使用RBS預(yù)測網(wǎng)站“RBS calculator”(https://salislab.net/software/predict_rbs_calculator)設(shè)計(jì)smut基因的最優(yōu)RBS序列RBSopt。

使用引物yqhB-rh-1F和smut-RBS-opt-R，smut-RBS-opt-F和yqhB-rh-4R，以1.2.1中構(gòu)建完成的表達(dá)框yqhB-P43-smut為模板，分別擴(kuò)增相應(yīng)的片段。使用引物yqhB-rh-zong-F/R，通過融合PCR技術(shù)將這2個(gè)片段進(jìn)行融合，得到將原始RBS序列替換為RBSopt序列的待整合表達(dá)框yqhB-P43-RBSopt-smut。所用引物見表2。將表達(dá)框yqhB-P43-RBSopt-smut轉(zhuǎn)化B.subtilisWB800的感受態(tài)細(xì)胞，篩選得到重組菌株BS8-P43-RBSopt-Smut。

表2 本研究所用引物

續(xù)表2

使用1.2.3中的方法構(gòu)建整合表達(dá)框yitR-P43-RBSopt-smut和ymzB-P43-RBSopt-smut，然后依次轉(zhuǎn)化BS8-P43-RBSopt-Smut的感受態(tài)細(xì)胞，篩選得到重組菌株BS8-P43-RBSopt-2Smut和BS8-P43-RBSopt-3Smut。

1.2.5 α-熊果苷的全細(xì)胞催化

取重組菌株的單菌落接種于20 mL種子培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)10 h。然后以1% (體積分?jǐn)?shù))的轉(zhuǎn)接比例將種子液轉(zhuǎn)接至30 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)11 h。將發(fā)酵液低溫低速離心15 min以收集細(xì)胞，用pH 7.0，20 mmol/L 的PB緩沖液將細(xì)胞洗滌2次。將細(xì)胞加入含有50 g/L HQ、310.9 g/L蔗糖的催化反應(yīng)體系中，該催化反應(yīng)是在pH 7.0，20 mmol/L的PB緩沖液中進(jìn)行的。催化容器為250 mL搖瓶，反應(yīng)體積為20 mL。催化條件為30 ℃，220 r/min振蕩反應(yīng)22～34 h。

1.2.6 α-熊果苷的HPLC檢測

使用HPLC的方法檢測α-熊果苷的濃度。將Agilent 1200 HPLC配備的紫外檢測器設(shè)置波長281 nm，使用Agilent SB-Aq色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。流動(dòng)相為10 mmol/L的稀磷酸和甲醇，體積比為 8∶2， 流速為0.6 mL/min。控制柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。 樣品處理方法：將全細(xì)胞催化液以最高轉(zhuǎn)速在4 ℃離心10 min后，取上清液用超純水進(jìn)行稀釋，再使用0.22 μm濾膜除去稀釋液中的雜質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蔗糖磷酸化酶Smut的整合表達(dá)及啟動(dòng)子替換

為使Smut在B.subtilis中穩(wěn)定表達(dá)，我們選擇B.subtilisWB600[18]和B.subtilisWB800[19]作為出發(fā)菌株，將P43-smut表達(dá)框分別整合至上述出發(fā)菌株基因組的yqhB位點(diǎn)。同時(shí)，為使Smut高效表達(dá)，我們使用在B.subtilis中能夠高效啟動(dòng)淀粉酶基因bla轉(zhuǎn)錄的P566啟動(dòng)子[19]替換P43啟動(dòng)子。分別得到了BS6-P43-Smut、BS6-P566-Smut、BS8-P43-Smut和BS8-P566-Smut這4株重組菌株，如圖1-a、圖1-b所示。然后將這4株重組菌株進(jìn)行全細(xì)胞催化合成α-熊果苷，以驗(yàn)證Smut在不同啟動(dòng)子的調(diào)控下及在不同的宿主中表達(dá)時(shí)α-熊果苷的合成情況，如圖1-c所示，在B.subtilisWB800中使用P43啟動(dòng)子時(shí)，α-熊 果苷的產(chǎn)量最高，為29.14 g/L，底物HQ的摩爾轉(zhuǎn)化率為23.56%；而在B.subtilisWB800中使用強(qiáng)啟動(dòng)子P566時(shí)，α-熊果苷的產(chǎn)量最低，為10.10 g/L，表明在B.subtilisWB800中，使用P43啟動(dòng)子調(diào)控Smut的表達(dá)對于全細(xì)胞催化合成α-熊果苷的效果更好。而在B.subtilisWB600中使用P43和P566啟動(dòng)子對于α-熊果苷的產(chǎn)量沒有明顯差別，分別為11.71、12.55 g/L。上述結(jié)果表明，以B.subtilisWB800作為表達(dá)宿主，使用P43啟動(dòng)子調(diào)控Smut的表達(dá)有利于獲得較高產(chǎn)量的α-熊果苷。

在重組菌株BS8-P43-Smut的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步增加Smut的拷貝數(shù)：將構(gòu)建的2拷貝P43-smut整合表達(dá)框轉(zhuǎn)化BS8-P43-Smut，獲得菌株BS8-P43-2Smut；將3拷貝P43-smut整合表達(dá)框轉(zhuǎn)化BS8-P43-2Smut，獲得菌株BS8-P43-3Smut；將4拷貝P43-smut整合表達(dá)框轉(zhuǎn)化BS8-P43-3Smut，獲得菌株BS8-P43-4Smut。然后將上述4株重組菌株進(jìn)行全細(xì)胞催化，α-熊果苷的產(chǎn)量如圖1-d所示，α-熊果苷產(chǎn)量與smut的拷貝數(shù)的增加呈正相關(guān)；當(dāng)整合4個(gè)拷貝smut時(shí)，α-熊果苷的產(chǎn)量為54.05 g/L，底物HQ的摩爾轉(zhuǎn)化率為43.70%，表明增加smut基因的拷貝數(shù)能在一定程度上提高α-熊果苷的產(chǎn)量。

a-蔗糖磷酸化酶基因smut的整合表達(dá)框；b-蔗糖磷酸化酶基因smut在B.subtilis中同源重組的示意圖；c-4株重組菌株全細(xì)胞催化22 h時(shí)合成α-熊果苷的能力；d-分別整合1、2、3、4拷貝的蔗糖磷酸化酶基因smut的重組菌株在全細(xì)胞催化22 h時(shí)合成α-熊果苷的能力

2.2 蔗糖磷酸化酶的RBS序列優(yōu)化

為進(jìn)一步提高α-熊果苷的產(chǎn)量，我們對P43-smut表達(dá)框中RBS序列進(jìn)行優(yōu)化[18-19]。使用RBS預(yù)測網(wǎng)站“RBS calculator”設(shè)計(jì)蔗糖磷酸化酶基因smut的最優(yōu)RBS序列，獲得了理論最優(yōu)RBS序列RBSopt：5′-ACGATGTAGCTGCTAGATACCAAAAGGA-GGTTTTTTTT-3′[20-21]。預(yù)測結(jié)果如圖2-a所示。

將原始的RBS序列替換成RBSopt并構(gòu)建1拷貝P43-RBSopt-smut整合表達(dá)框轉(zhuǎn)化B.subtilisWB800菌株，獲得重組菌株BS8-P43-RBSopt-Smut；將2拷貝P43-RBSopt-smut整合表達(dá)框轉(zhuǎn)化BS8-P43-RBSopt-Smut，獲得重組菌株BS8-P43-RBSopt-2Smut；將3拷貝P43-RBSopt-smut整合表達(dá)框轉(zhuǎn)化BS8-P43-RBSopt-2Smut，獲得重組菌株BS8-P43-RBSopt-3Smut。然后將這3株重組菌株進(jìn)行α-熊果苷的全細(xì)胞催化，結(jié)果如圖2-b所示。當(dāng)將原始RBS序列替換為RBSopt后，BS8-P43-RBSopt-Smut菌株的α-熊果苷合成能力就已接近于BS8-P43-4Smut菌株，為46.33 g/L，底物HQ的摩爾轉(zhuǎn)化率為37.46%；BS8-P43-RBSopt-2Smut和BS8-P43-RBSopt-3Smut菌株合成α-熊果苷的能力不斷提高，其中BS8-P43-RBSopt-3Smut菌株全細(xì)胞催化合成α-熊果苷的產(chǎn)量為99.14 g/L，底物HQ的摩爾轉(zhuǎn)化率為80.15%。上述結(jié)果表明，通過優(yōu)化RBS序列和增加拷貝數(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)目標(biāo)蛋白酶Smut的高效表達(dá)，最終提高α-熊果苷的產(chǎn)量。

a-“RBS caculator”預(yù)測的不同RBS序列對應(yīng)的翻譯速率；b-重組菌株BS8-P43-RBSopt-Smut, BS8-P43-RBSopt-2Smut, BS8-P43-RBSopt-3Smut全細(xì)胞催化22 h時(shí)合成α-熊果苷的情況

2.3 全細(xì)胞催化合成α-熊果苷的條件優(yōu)化

在前面的研究中，我們使用5 mL的反應(yīng)體系進(jìn)行全細(xì)胞催化，但是發(fā)現(xiàn)多個(gè)批次之間的α-熊果苷產(chǎn)量不夠穩(wěn)定。此外，HPLC檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)催化22 h的反應(yīng)液在產(chǎn)物峰之后始終伴隨著一個(gè)面積較大的雜峰(圖3-a)。通過與HQ標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間(圖3-b)比對，確定該雜峰對應(yīng)的物質(zhì)就是HQ，這說明在全細(xì)胞催化反應(yīng)進(jìn)行到22 h時(shí)還有一部分HQ未被轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。因此，我們嘗試將反應(yīng)體系擴(kuò)大至 20 mL 并延長催化時(shí)間，發(fā)現(xiàn)不同批次之間α-熊果苷的產(chǎn)量保持穩(wěn)定，表明擴(kuò)大反應(yīng)體系有利于α-熊果苷的穩(wěn)定合成。結(jié)果如圖3-d所示，當(dāng)催化時(shí)間延長至34 h時(shí)，BS8-P43-RBSopt-Smut、BS8-P43-RBSopt-2Smut和BS8-P43-RBSopt-3Smut菌株催化生成的α-熊 果苷含量均有明顯提高，其中BS8-P43-RBSopt-3Smut菌株累積合成了119.44 g/L的α-熊果苷，底物HQ的摩爾轉(zhuǎn)化率為96.56%。催化時(shí)間超過34 h 后，α-熊果苷的產(chǎn)量趨于穩(wěn)定，在46 h時(shí)檢測到α-熊果苷質(zhì)量濃度為121.60 g/L。表明α-熊果苷的催化合成在前34 h就基本完成。同時(shí)，我們對催化液中的底物HQ濃度進(jìn)行檢測，如圖3-e所示，發(fā)現(xiàn)隨著催化時(shí)間的延長，HQ的濃度不斷降低，這也間接證明了適當(dāng)?shù)匮娱L催化時(shí)間可以提高α-熊果苷的產(chǎn)量。

a-重組菌株全細(xì)胞催化22 h時(shí)催化液中α-熊果苷和對HQ對應(yīng)的出峰時(shí)間和峰面積；b-HQ標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜出峰時(shí)間；c- α-熊果苷標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜出峰時(shí)間；d-重組菌株在不同催化時(shí)間時(shí)α-熊果苷的積累量；e-重組菌株在不同催化時(shí)間時(shí)底物HQ的殘留量

3 結(jié)論與討論

前期的研究對變異鏈球菌來源的蔗糖磷酸化酶進(jìn)行分子改造，獲得了具有高效催化合成α-熊果苷潛力的SmSPI336L。本文在此基礎(chǔ)上，將SmSPI336L在B.subtilisWB800菌株中異源整合表達(dá)，獲得的重組菌株BS8-P43-4Smut在全細(xì)胞催化22 h時(shí)α-熊 果苷的產(chǎn)量54.05 g/L，底物HQ的摩爾轉(zhuǎn)化率為43.70%。通過RBS序列優(yōu)化策略，并對催化條件進(jìn)行優(yōu)化后，重組菌株BS8-P43-RBSopt-3Smut在全細(xì)胞催化34 h時(shí)α-熊果苷的產(chǎn)量為119.44 g/L，底物HQ的摩爾轉(zhuǎn)化率為96.56%。與目前已報(bào)道的α-熊果苷合成方法相比，利用該方法具有操作簡便、產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率高且產(chǎn)量穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，為實(shí)現(xiàn)α-熊果苷的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一個(gè)新的策略。但是，本研究中全細(xì)胞催化合成α-熊果苷是在搖瓶中完成的，為滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要，接下來需要放大催化體系，對發(fā)酵條件、全細(xì)胞催化的策略進(jìn)行系統(tǒng)地優(yōu)化。