多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1、凋亡誘導(dǎo)因子在卵巢癌組織中的表達(dá)及其臨床病理意義

秦翱翔 沈 力

湖北省荊州市松滋市中醫(yī)院腫瘤科，湖北荊州 434200

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)中常見(jiàn)的惡性腫瘤，具有高度侵襲性，因其隱匿性，確診時(shí)多為晚期，患者5年存活率較低，其已成為嚴(yán)重威脅婦女生命的惡性疾病[1-2]。因此，積極尋找能夠有效預(yù)測(cè)患者預(yù)后的分子標(biāo)記物具有重要的意義。多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1（poly adenosine diphosphate ribose polymerase 1，PARP1）是DNA 損傷修復(fù)的關(guān)鍵酶，主要存在于細(xì)胞核，少量存在于細(xì)胞質(zhì)中，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。過(guò)度的DNA 損傷及PARP1 表達(dá)，會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）和腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）耗竭，進(jìn)而使得凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosisinducing factor，AIF）及核酸內(nèi)切酶G 從線粒體中釋放，進(jìn)入細(xì)胞核，誘發(fā)非caspase3 途徑，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[3-4]。細(xì)胞凋亡對(duì)于維持生物體正常發(fā)育起重要的作用，一旦凋亡調(diào)控機(jī)制發(fā)生紊亂，細(xì)胞惡變的潛能增高，最終可能轉(zhuǎn)化為腫瘤。AIF 是新發(fā)現(xiàn)的一種凋亡效應(yīng)分子，既具有細(xì)胞凋亡活性又具有氧化還原酶活性，可以不依賴于caspase 途徑而行使細(xì)胞凋亡功能，在腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，對(duì)細(xì)胞凋亡起促進(jìn)作用[5-6]。目前，關(guān)于PARP1、AIF 在卵巢癌的研究未有報(bào)道，故本研究運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)腫瘤組織中PARP1、AIF 表達(dá)情況，并分析其與卵巢癌患者各項(xiàng)病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系，以期為卵巢癌診療及預(yù)后提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年6月至2017年6月于湖北省荊州市松滋市中醫(yī)院手術(shù)切除且經(jīng)病理證實(shí)的70 例卵巢癌組織標(biāo)本及相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本（距癌組織＞5 cm，經(jīng)HE 染色顯示無(wú)癌細(xì)胞浸潤(rùn)），所有癌組織標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)為卵巢癌。患者平均年齡（56.63±7.42）歲，＜60 歲28 例，≥60 歲42 例；臨床分期：Ⅰ期17 例，Ⅱ期22 例，Ⅲ期18 例，Ⅳ期13 例；腫瘤直徑：≤5 cm 27例，＞5 cm 43 例；組織學(xué)類(lèi)型：漿液性37 例，其他33 例；分化程度：高分化14 例，中分化15 例，低分化41 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43 例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27 例。

納入標(biāo)準(zhǔn)： ①患者在術(shù)前均未經(jīng)放化療或其他治療，且無(wú)手術(shù)禁忌；②患者經(jīng)病理診斷證實(shí)為卵巢癌[7]；③患者及其家屬對(duì)本研究知情同意，并簽訂協(xié)議書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有肝病、高血壓、心臟病等疾病者；②資料不完整，無(wú)法進(jìn)行術(shù)后隨訪者。另收集患者腫瘤直徑、組織學(xué)類(lèi)型、臨床分期、分化程度及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理資料。本研究經(jīng)湖北省荊州市松滋市中醫(yī)院道德倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，符合《赫爾辛基宣言》。

1.2 主要試劑

SP 免疫組化試劑盒及DAB 顯色試劑盒，購(gòu)自武漢博士德公司；山羊抗人AIF 多克隆抗體，購(gòu)自Santa Cruz 公司；兔抗人PARP1 多克隆抗體，購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)組織標(biāo)本中PARP1、AIF蛋白表達(dá) 采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組織標(biāo)本中PARP1、AIF 蛋白表達(dá)，具體操作如下。

①各組織標(biāo)本經(jīng)固定、石蠟包埋后，石蠟切片機(jī)切片，厚度約4 μm。②展片，60℃烘烤1 h。③常規(guī)二甲苯脫蠟，無(wú)水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇水化。④枸櫞酸鈉緩沖液煮沸18 min 進(jìn)行抗原熱修復(fù)。⑤滴加3%過(guò)氧化氫于室溫孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。⑥磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer，PBS）沖洗3 min×3 次，滴加1%牛血清白蛋白，孵育30 min 封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。⑦而后吸棄封閉液（陰性對(duì)照除外），分別滴加山羊抗人AIF 多克隆抗體、兔抗人PARP1 多克隆抗體，置于4℃冰箱過(guò)夜。⑧取出切片，PBS 沖洗5 min×3 次，加入生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育40 min。⑨PBS 沖洗切片5 min×3次，DAB 顯色，10%蘇木精復(fù)染。⑩70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無(wú)水乙醇梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察染色情況并拍照。

1.3.2 結(jié)果判定 由三名病理醫(yī)生對(duì)每張染色片進(jìn)行評(píng)分取均值，以細(xì)胞漿或細(xì)胞膜呈棕黃色顆粒為陽(yáng)性顯色。根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比來(lái)進(jìn)行評(píng)分。

①細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0 分（無(wú)染色），1 分（淺黃色），2 分（棕黃色），3 分（棕褐色）。②陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)： 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%，記0 分；10%～25%，記1 分；26%～50%，記2 分；51%～80%，記3 分；＞80%，記4 分。染色指數(shù)（staining index，SI），即染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分乘積。SI＜3 分，陰性（-）；SI=3 分，弱陽(yáng)性（+）；3 分＜SI＜6 分，中等陽(yáng)性（++）；SI≥6 分，強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。其中陰性和弱陽(yáng)性表示低表達(dá)，中等陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性表示高表達(dá)。

1.3.3 隨訪 所有患者均有完整的隨訪資料，隨訪時(shí)間36 個(gè)月，死亡患者以死亡時(shí)間作為隨訪截止日期，無(wú)病生存期（disease-free survival，DFS）的計(jì)算為從手術(shù)日期至疾病復(fù)發(fā)或因疾病進(jìn)展導(dǎo)致患者死亡的時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)；采用Spearman 分析卵巢癌組織中PARP1 與AIF 表達(dá)相關(guān)性采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，行Log-rank 檢驗(yàn)； 采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析影響卵巢癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌組織和癌旁組織中PARP1、AIF 表達(dá)情況的比較

卵巢癌組織中PARP1、AIF 陽(yáng)性表達(dá)率分別為72.86%（51/70）和70.00%（49/70），均高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

表1 卵巢癌組織和癌旁組織中PARP1、AIF 表達(dá)情況的比較[n（%）]

2.2 卵巢癌組織中PARP1、AIF 表達(dá)與患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

PARP1、AIF 在卵巢癌組織中的表達(dá)與患者年齡、腫瘤直徑、組織學(xué)類(lèi)型無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）。PARP1、AIF 高表達(dá)患者臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、 低分化及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比例均高于低表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

表2 卵巢癌組織中PARP1、AIF 表達(dá)與患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系[n（%）]

2.3 卵巢癌組織中PARP1 與AIF 表達(dá)的相關(guān)性

卵巢癌組織中PARP1 與AIF 表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.791，P＜0.05）（表3）。

表3 卵巢癌組織中PARP1 與AIF 表達(dá)的相關(guān)性（n）

2.4 卵巢癌組織中PARP1、AIF 表達(dá)與患者術(shù)后DFS 的關(guān)系

PARP1 高表達(dá)卵巢癌患者中位DFS 為6.78 個(gè)月，短于PARP1 低表達(dá)患者的23.32 個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1）。AIF 高表達(dá)卵巢癌患者中位DFS 為7.80 個(gè)月，短于AIF 低表達(dá)患者的28.00 個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖2）。

圖1 卵巢癌組織中PARP1 表達(dá)與患者術(shù)后DFS 的關(guān)系

圖2 卵巢癌組織中AIF 表達(dá)與患者術(shù)后DFS 的關(guān)系

2.5 影響卵巢癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素

單因素分析顯示，PARP1、AIF、臨床分期、分化程度及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均是影響卵巢癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。多因素Cox 分析顯示，臨床分期、分化程度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、PARP1 及AIF 均是影響卵巢癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）（表4）。

表4 影響卵巢癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素

3 討論

手術(shù)切除病灶是目前卵巢癌的主要治療手段，輔以放化療或放療，但治療效果有限[8-9]。因此尋找具有診斷、 預(yù)后預(yù)測(cè)潛力的標(biāo)志物及新治療靶點(diǎn)成為現(xiàn)階段的研究熱點(diǎn)。PARP1 是具有多聚二磷腺苷酸核糖基催化活性的蛋白酶，存在于多數(shù)真核細(xì)胞內(nèi)，在DNA 損傷修復(fù)、細(xì)胞周期、基因組穩(wěn)定和細(xì)胞死亡等方面均發(fā)揮重要作用[10-12]。PARP1 在卵巢癌中的呈現(xiàn)高表達(dá)，能促進(jìn)卵巢癌的生長(zhǎng)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[13-14]。本研究結(jié)果顯示，卵巢癌組織中PARP1 陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織，PARP1 高表達(dá)患者臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比例均高于低表達(dá)患者（P＜0.05），與張燦燦等[14]研究相似，提示PARP1 在卵巢癌組織中存在異常高表達(dá)，可能參與卵巢癌的發(fā)生及發(fā)展。

細(xì)胞凋亡是一系列酶參與的生化反應(yīng)，在維持正常細(xì)胞更新和異常細(xì)胞清除平衡中起著重要作用，受許多凋亡相關(guān)因子的影響[6，15]。AIF 是具有促凋亡活性的蛋白，又具有氧化還原酶活性，在腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，對(duì)細(xì)胞凋亡起促進(jìn)作用[5，16]。陳吉等[17]研究報(bào)道，胃黏膜組織中AIF mRNA 高表達(dá)與胃癌形成有一定關(guān)聯(lián)，可作為早期評(píng)估胃癌的臨床指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，卵巢癌組織中AIF 陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織，AIF 高表達(dá)患者臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、 低分化及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比例均高于低表達(dá)患者（P＜0.05），與陳吉等[17]研究結(jié)果相似，提示AIF 能夠?yàn)槟[瘤細(xì)胞生長(zhǎng)活動(dòng)提供能量，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)，提示AIF 在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定作用。

DFS 是在根治性手術(shù)后作為輔助化療時(shí)最常用的終點(diǎn)指標(biāo)，本研究Kapalan-Meier 生存曲線分析結(jié)果顯示，PARP1 和AIF 高表達(dá)卵巢癌患者中位DFS均短于低表達(dá)患者（P＜0.05），表明PARP1 和AIF 可能作為卵巢癌的預(yù)后指標(biāo)，其高表達(dá)提示患者預(yù)后較差。進(jìn)一步采用Cox 模型分析結(jié)果顯示，臨床分期、分化程度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、PARP1 及AIF 均是影響卵巢癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素（P＜0.05），而PARP1、AIF、臨床分期及分化程度是影響卵巢癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），提示PARP1 和AIF 可能作為判斷卵巢癌患者預(yù)后的參照指標(biāo)。同時(shí)需關(guān)注卵巢癌的臨床分期、分化程度對(duì)患者預(yù)后的影響。此外，本研究結(jié)果顯示卵巢癌組織中PARP1 與AIF 表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05），由此也提示PARP1、AIF 在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中可能協(xié)同發(fā)揮作用進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程，但具體機(jī)制尚需深入探究[15-16]。

綜上所述，PARP1、AIF 在卵巢癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織，其與卵巢癌患者臨床分期、分化程度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及DFS 相關(guān)，可能作為評(píng)定卵巢癌患者預(yù)后的臨床參考指標(biāo)。但由于目前研究的局限性，PARP1、AIF 參與卵巢癌發(fā)生發(fā)展的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。