程序化細(xì)胞死亡分子5在乳腺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

劉秀芬， 敖洪峰， 敖金平

（1.上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院病理科，上海 201400；2.上海市奉賢區(qū)南橋社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心外科，上海 201400）

乳腺癌是一種常見的女性惡性腫瘤，發(fā)病率居我國(guó)女性惡性腫瘤的第3位[1]。盡管乳腺癌目前已有較好的治療方案，預(yù)后也相對(duì)較好，但局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移甚至死亡的患者仍較多[2]，發(fā)生轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者的預(yù)后較差。腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是乳腺癌轉(zhuǎn)移的主要途徑，患者首次就診時(shí)是否發(fā)生腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可為腫瘤潛在轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)提供重要參考[3]。此外，是否發(fā)生腋窩淋巴轉(zhuǎn)移及轉(zhuǎn)移數(shù)量還與腫瘤復(fù)發(fā)及患者的預(yù)后密切相關(guān)[4]。乳腺癌細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是由多種細(xì)胞因子參與的復(fù)雜生物學(xué)行為，程序化細(xì)胞死亡分子5（programmed cell death 5，PDCD5）蛋白是一種新的凋亡正調(diào)控蛋白，在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要的作用[5]。有研究結(jié)果顯示，PDCD5在多種腫瘤組織中的表達(dá)明顯低于正常組織，而PDCD5表達(dá)下降可阻斷癌細(xì)胞的凋亡程度，增加癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，因此PDCD5與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)[6]。本研究擬檢測(cè)PDCD5在乳腺癌組織中的表達(dá)，并分析PDCD5與臨床病理學(xué)參數(shù)及腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，初步探討PDCD5在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用，為患者的臨床評(píng)估提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2015年1月—2018年12月在上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院行切除手術(shù)的乳腺癌患者160例，年齡（44.7±7.1）歲，其中<45歲85例、≥45歲75例。所有患者均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)，在術(shù)前均未進(jìn)行放化療和其他治療，3年隨訪資料完整。按國(guó)際抗癌聯(lián)盟2009版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[7]：Ⅰ～Ⅱ期128例，Ⅲ～Ⅳ期32例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移72例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移88例。收集所有患者癌組織樣本及對(duì)應(yīng)的癌旁（與癌組織的距離≥5 cm）組織樣本。本研究經(jīng)上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[編號(hào)：CS2019（12）]，患者及家屬均知情同意并自愿簽字。

1.2 主要抗體和試劑盒

兔抗人PDCD5單克隆抗體、鼠抗人雌激素受體（estrogen receptor，ER）單克隆抗體、羊抗人孕激素受體（progesterone receptor，PR）單克隆抗體、兔抗人人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）單克隆抗體、鼠抗人細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）D1單克隆抗體、Ki-67蛋白單克隆抗體、兔抗人趨勢(shì)化因子受體4（chemokine receptor 4，CXCR4）單克隆抗體、羊抗人E-鈣黏蛋白（E-cadherin，E-cad）單克隆抗體均購(gòu)自上海長(zhǎng)島生物技術(shù)有限公司，辣根過氧化物標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體購(gòu)自上海滬峰化工有限公司，SP試劑盒購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組化法檢測(cè)PDCD5、Cyclin D1、Ki-67、CXCR4、E-cad蛋白表達(dá)

將石蠟包埋的組織樣本切成5 μm厚的切片，放入40%乙醇中，40 ℃水浴處理4 min，展開后置于60 ℃烘箱中烘片。用二甲苯脫蠟20 min，用梯度乙醇水化，加入3%過氧化氫，室溫放置10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，再對(duì)PDCD5、Cyclin D1、Ki-67、CXCR4、E-cad蛋白進(jìn)行高溫高壓組織修復(fù)，采用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）沖洗，加入5%羊血孵育30 min，除去封閉液，加入一抗，置于4 ℃冰箱過夜。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，次日取出后用PBS沖洗，每張切片滴加二抗，室溫下孵育30 min，PBS沖洗5次，每次3 min，加入DAB顯色劑，隨后用PBS沖洗，終止顯色，用水沖洗10 min，梯度乙醇脫水干燥，在CKX53光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司）下觀察組織樣本。

1.4 PDCD5、Cyclin D1、Ki-67、CXCR4、E-cad蛋白表達(dá)陽性判定標(biāo)準(zhǔn)

由2位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師對(duì)病理切片進(jìn)行盲評(píng)。每張切片隨機(jī)選5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野隨機(jī)取200個(gè)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。細(xì)胞出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性表達(dá)，最終染色結(jié)果以陽性細(xì)胞在組織樣本中的比例及陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度綜合判定。染色強(qiáng)度評(píng)分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細(xì)胞表達(dá)百分率評(píng)分：無陽性細(xì)胞為0分，<25%為1分，25%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。最終結(jié)果為以上2項(xiàng)得分的乘積，9～12分為強(qiáng)陽性（+++），5～8分為陽性（++），1～4分為弱陽性（+），0分為陰性（-）。

1.5 乳腺癌分子分型判定標(biāo)準(zhǔn)

乳腺癌的分子分型參考St.Gallen乳腺癌會(huì)議（2015年）國(guó)際專家共識(shí)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[8]，分型標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 乳腺癌分子分型判定標(biāo)準(zhǔn)

1.6 腋窩淋巴結(jié)標(biāo)記方法及計(jì)數(shù)

將清掃的腋窩淋巴結(jié)分為3組，以胸小肌為解剖標(biāo)志，第1組淋巴結(jié)位于胸小肌下緣外側(cè)，第2組淋巴結(jié)位于胸小肌后方上緣和下緣之間，第3組淋巴結(jié)位于胸小肌上緣內(nèi)側(cè)；位于胸大肌與胸小肌之間的淋巴結(jié)歸為胸肌間淋巴結(jié)，背闊肌附近分布的淋巴結(jié)獨(dú)立標(biāo)記為背闊肌旁淋巴結(jié)，記錄所有淋巴結(jié)數(shù)量。

1.7 隨訪

采用定期復(fù)查和電話相結(jié)合的方式隨訪5年，統(tǒng)計(jì)所有患者的無進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）和總生存期（overall survival，OS）。PFS定義為從病理學(xué)確診日期至疾病進(jìn)展或尚未進(jìn)展的末次隨訪日期，OS定義為從病理學(xué)確診日期開始至死亡或末次隨訪日期。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Spearman相關(guān)分析評(píng)估等級(jí)變量之間的相關(guān)性。采用Kaplan-Meier生存曲線分析PDCD5與乳腺癌患者生存率之間的相關(guān)性。采用Cox比例回歸分析評(píng)估乳腺癌腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PDCD5蛋白在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況

PDCD5蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，乳腺癌組織中PDCD5蛋白的陽性表達(dá)率為25.0%（40/160），明顯低于癌旁正常組織[60.0%（96/160）]（P=0.000）。見表2、圖1。

表2 乳腺癌組織和癌旁組織中PDCD5的陽性表達(dá)率

圖1 PDCD5在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)（免疫組化法，×400）

2.2 PDCD5蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

PDCD5蛋白表達(dá)與不同TNM分期、組織分化程度、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否有肌層浸潤(rùn)、是否有脈管浸潤(rùn)及不同ER、PR、HER-2表達(dá)狀態(tài)有關(guān)（P<0.05），與年齡、月經(jīng)狀態(tài)、腫瘤直徑及分子分型無關(guān)（P>0.05）。見表3。

表3 不同臨床病理特征乳腺癌患者PDCD5表達(dá)的比較 例（%）

續(xù)表3 例（%）

2.3 PDCD5蛋白表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性

Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，PDCD5蛋白表達(dá)與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目呈正相關(guān)（r=0.428，P=0.000）；與Cyclin D1、 Ki-67和CXCR4表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r值分別為-0.217、-0.220、-0.271，P<0.01），與E-cad表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.464，P=0.000）。

2.4 乳腺癌腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素分析

Cox比例回歸分析結(jié)果顯示，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、低組織分化程度、肌層浸潤(rùn)、脈管浸潤(rùn)、PDCD5陽性、ER陰性、PR陰性、HER-2陽性是乳腺癌腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素（P<0.05）。見表5。

表5 乳腺癌腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素分析

2.5 PDCD5表達(dá)與乳腺癌患者生存的關(guān)系

PDCD5陽性患者5年OS和PFS分別為65.00%和33.00%，顯著高于PDCD5陰性患者（40.83%和17.50%）（P<0.05）。見圖2。

圖2 PDCD5陽性和陰性乳腺癌患者的Kaplan-Meier生存曲線

3 討論

乳腺癌是引起女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因。在我國(guó)，乳腺癌的發(fā)病率以每年約3%的速度增長(zhǎng)[8]。雖然近年來乳腺癌的臨床診斷、治療和發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的相關(guān)研究取得了一定的進(jìn)展，但乳腺癌的總體生存率仍較低，其中癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是治療失敗的主要原因之一。惡性腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)、侵襲在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用[9]，因此探討腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)有利于進(jìn)一步明確腫瘤的發(fā)病機(jī)制。

PDCD5除具有促進(jìn)多種細(xì)胞凋亡和抑制其增殖的作用外，還可影響細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移與細(xì)胞黏附能力，使癌細(xì)胞可以抵抗失巢凋亡的發(fā)生，增加癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，使其更具侵襲性[10]。有研究結(jié)果顯示，PDCD5蛋白可與正向調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶3的半衰期，使其半衰期延長(zhǎng)，從而參與細(xì)胞凋亡[11]。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)PDCD5可明顯提高癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，而經(jīng)PDCD5抑制劑處理后，癌細(xì)胞的侵襲性明顯下降[12]。臨床研究結(jié)果顯示，PDCD5蛋白在胃癌、卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)量明顯低于癌旁組織（P<0.05）[13-14]。WANG等[15]的研究結(jié)果顯示，在已轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者病變組織中，PDCD5蛋白陽性組PDCD5 mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯低于PDCD5蛋白陰性組（P=0.015）。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌患者癌組織中PDCD5蛋白的陽性表達(dá)率明顯低于癌旁組織（P=0.000），提示PDCD5蛋白表達(dá)可能與乳腺癌的發(fā)生有一定的關(guān)系。本研究結(jié)果還顯示，PDCD5蛋白與TNM分期、組織分化程度、是否有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤(rùn)、脈管浸潤(rùn)及ER、PR、HER-2表達(dá)有關(guān)（P<0.05），PDCD5蛋白表達(dá)強(qiáng)度與乳腺癌腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目呈正相關(guān)（r=0.428，P=0.000），提示PDCD5與乳腺癌的臨床進(jìn)展之間有一定關(guān)系，PDCD5表達(dá)量下降可能促進(jìn)了乳腺癌的轉(zhuǎn)移。DENG等[16]的研究結(jié)果顯示，HER-2過表達(dá)型乳腺癌的癌組織中PDCD5表達(dá)明顯低于其他分子分型的乳腺癌。本研究結(jié)果顯示，5種分子分型的乳腺癌組織中PDCD5表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），這可能與本研究納入的HER-2過表達(dá)乳腺癌患者例數(shù)較少有關(guān)。

有研究結(jié)果顯示，多個(gè)癌基因及抑癌基因表達(dá)的相關(guān)蛋白，如Cyclin D1、CXCR4、E-cad等與癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)有關(guān)[17]。Cyclin D1是一種細(xì)胞周期蛋白，可與周期性依賴性蛋白激酶相互作用，促使細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，縮短細(xì)胞周期，并加速細(xì)胞的增殖[18]。YOUSEF等[19]的研究結(jié)果表明，Cyclin D1在有肌層浸潤(rùn)和腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者的癌組織中呈高表達(dá)。有研究結(jié)果顯示，在非小細(xì)胞肺癌中轉(zhuǎn)染PDCD5 siRNA可促進(jìn)Cyclin D1的表達(dá)；PDCD5缺失會(huì)導(dǎo)致Cyclin D1在抵抗DNA損傷時(shí)受到明顯抑制[20]。Ki-67是一種增殖抗原，可有效反映腫瘤細(xì)胞的增殖活性，是臨床上檢測(cè)惡性腫瘤增殖的標(biāo)志物。CAIAZZO等[21]研究發(fā)現(xiàn)，與乳腺癌原發(fā)病灶相比，轉(zhuǎn)移病灶中Ki-67的表達(dá)明顯升高。在乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)PDCD5，可抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，其原因可能與下調(diào)Ki-67有關(guān)[22]。CXCR4是介導(dǎo)趨化因子發(fā)揮功能的重要受體，與特異性配體CXCL12構(gòu)成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路共同參與了淋巴結(jié)細(xì)胞歸巢、血管生成、細(xì)胞增殖及遷移等生物學(xué)行為[23]。徐娟等[24]的研究結(jié)果顯示，在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌、卵巢癌組織中，CXCR4 mRNA表達(dá)強(qiáng)度明顯升高。胥丹等[25]的研究結(jié)果顯示，PDCD5能顯著抑制肝癌細(xì)胞系HepG2在體外的生長(zhǎng)，促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能與PDCD5對(duì)CXCR4的調(diào)控有關(guān)。E-cad是鈣黏蛋白超家族的重要成員。在腫瘤進(jìn)展中，E-cad的異常表達(dá)可反映腫瘤細(xì)胞的侵襲能力、對(duì)藥物敏感性和抗凋亡能力的變化[26]。LEFORT等[27]的研究結(jié)果表明，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者癌組織中E-cad的表達(dá)低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，且與HER-2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.382，P=0.000）。本研究結(jié)果顯示，PDCD5蛋白表達(dá)強(qiáng)度與Cyclin D1、Ki-67和CXCR4呈負(fù)相關(guān)（r值分別為-0.217、-0.220、-0.271，P<0.05），與E-cad呈正相關(guān)（r=0.464，P=0.000）；Cox比例回歸分析結(jié)果顯示，PDCD5陽性是乳腺癌患者發(fā)生腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素，提示PDCD5蛋白表達(dá)下調(diào)可能與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道[28]一致。

有研究結(jié)果顯示，PDCD5蛋白表達(dá)與激素受體陽性呈正相關(guān)，PDCD5陰性表達(dá)患者預(yù)后較差，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)更高，且與激素受體表達(dá)呈正相關(guān)[29]。本研究結(jié)果顯示，ER、PR陰性及HER-2陽性的乳腺癌組織中PDCD5的陽性表達(dá)率較低；Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示，PDCD5陽性乳腺癌患者的5年OS和PFS顯著高于陰性患者（P<0.05），提示PDCD5陰性的乳腺癌患者預(yù)后較差。由于本研究為單中心研究，納入的病例數(shù)較少，因此本研究結(jié)果還需要大規(guī)模的多中心臨床研究加以驗(yàn)證。

綜上所述，PDCD5蛋白在乳腺癌組織中呈低表達(dá)，可能通過調(diào)控運(yùn)動(dòng)相關(guān)蛋白Cyclin D1、Ki-67、CXCR4及E-cad促進(jìn)乳腺癌腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，進(jìn)而影響患者預(yù)后。