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    豐花月季杏花村組培快繁條件篩選

    2021-11-29 05:24:14任杰林榕榕王燕梁靜萍黎經(jīng)田李可貴陳冠銘李宏楊劉揚
    熱帶農(nóng)業(yè)科學 2021年10期
    關(guān)鍵詞:杏花村腋芽外植體

    任杰 林榕榕 王燕 梁靜萍 黎經(jīng)田 李可貴陳冠銘 李宏楊 劉揚

    (1三亞市南繁科學技術(shù)研究院 海南三亞 572000;2海南玫瑰谷產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司 海南三亞 572000;3三亞市熱帶農(nóng)業(yè)科學院 海南三亞 572000;4海南熱帶海洋學院 海南三亞 572000)

    月季(Rosa chinensis)是薔薇科薔薇屬的一種常綠或半常綠灌木,顏色多樣,有濃郁的香味,形態(tài)各有特點,受到國內(nèi)外人的喜愛。月季在中國已有2 000年的栽培歷史[1]。據(jù)統(tǒng)計,現(xiàn)代月季品種約有24 000種[2],杏花村屬于現(xiàn)代月季品種之一的豐花月季(Floribunda Roses),又稱聚花月季,1935年Drior用Kirsten Penlsen×Unamed seedling作為親本育出。其適應(yīng)能力強,長勢好,易管理,花開艷麗,常用于園林綠植。海南三亞的亞龍灣國際玫瑰谷與三亞市南繁科學技術(shù)研究院合作,對杏花村引種栽培,發(fā)現(xiàn)其適合三亞的氣候環(huán)境,但因三亞夏季高溫高濕天氣影響,常規(guī)的扦插、壓條、嫁接等繁殖方式成活率低、病毒積累嚴重。阻礙其推廣示范,育苗難問題亟待解決。

    早在1980年,Hasegawa[3]就在MS培養(yǎng)基上成功培育出攀援月季Improvedfire,證明組培月季可行。組培外植體的選擇通常為生長健壯、芽點飽滿的枝條,少數(shù)也采用葉片[4-7]、葉柄[4,8]、葉盤[8]做外植體。在李海燕等[9]研究中,中部莖段腋芽效果最好,平均萌發(fā)時間比頂部和基部芽短6~8 d。其次是基部,再是頂部[9-13]。

    適宜濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑能有效促進月季腋芽的誘導。Rout等[14]進行腋芽誘導時,發(fā)現(xiàn)6-BA的正常有效濃度為0.5~3.0 mg/L。Bressan[10]在研究Gold Glow時,發(fā)現(xiàn)當6-BA量超過0.3 mg/L會對側(cè)芽萌發(fā)起到明顯的抑制,且NAA的有效濃度為 0.01~0.5 mg/L[15-16]。錢蕾[17]在對粉-A 初代培養(yǎng)研究中,添加6-BA 2.0 mg/L和NAA 0.05 mg/L,誘導率為94.61%。莫磊興等[18]研究結(jié)果表明,高溫會影響芽的萌發(fā),26℃左右最適芽的萌發(fā)。

    在腋芽的增殖研究中發(fā)現(xiàn),0.1~3.0 mg/L為6-BA的正常有效濃度,0.3 mg/L為IBA的最優(yōu)有效濃度,0.005~0.500 mg/L為NAA的合理有效濃度[19]。6-BA低濃度最適于促進腋芽的增殖,高濃度則會抑制腋芽生長發(fā)育。NAA的濃度高低會影響芽增殖速度,NAA濃度在0.1 mg/L以上時,腋芽增殖率會明顯降低[20]。其次,腋芽的增殖還會受環(huán)境因子、糖濃度、pH等多項因子的影響。莫磊興等[18]研究發(fā)現(xiàn),隨著光照強度的提高,玻璃化的現(xiàn)象慢慢減緩,光照在3 000 lx左右腋芽的增殖培養(yǎng)率會得到有效提高。培養(yǎng)基的糖濃度與pH高低影響繼代的生長周期,因此,月季培養(yǎng)基中的糖含量不得超過50 g/L,pH必須低于5.5。

    生根培養(yǎng)通常采用1/2 MS培養(yǎng)基。Hyndman等[21]認為,MS培養(yǎng)基中的氮鹽比與無機鹽相同,但高濃度氮鹽對生根有抑制作用,生根主要利用NAA、IBA、IAA等生長素,且NAA常用有效濃度為0.01~1.00 mg/L,IBA有效濃度為0.01~1.00mg/L,IAA使用則相對較少。李正平[22]將ATB用于月季組織培養(yǎng)的研究,發(fā)現(xiàn)生根的有效濃度為0.5~10.0 mg/L,生根的較佳濃度為0.5~2.0 mg/L。何松林等[23]將IBA、IAA和NAA添加在薩蔓莎生根培養(yǎng)基中,結(jié)果證明3種激素均能促進生根,且效果最佳的配方是:1/2 MS+IBA 0.5 mg/L、1/2 MS+IAA 1.0 mg/L與1/2 MS+NAA 0.5 mg/L。另外,在培養(yǎng)基中加入適量的活性炭能有效吸附有毒物質(zhì)及沉淀。姚曉惠等[24]研究發(fā)現(xiàn),月季組織培養(yǎng)的生根階段還受較多環(huán)境因子的影響,溫度為21℃時生根的長勢最好;且日光燈更適于月季的生根。

    月季組培技術(shù)相對成熟,已有許多優(yōu)良月季品種如卡羅拉、多情玫瑰、金太陽、芳純月季等多種研究對象及成果[25],為月季快繁技術(shù)研究提供參考。本文在前人研究的基礎(chǔ)上,對豐花月季杏花村進行組培快繁試驗,使其具有優(yōu)良遺傳特性和表型特性,同時縮短育種周期,以解決三亞地區(qū)月季育苗難問題,并建立適合三亞的月季組培育苗技術(shù)體系。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    外植體材料取自亞龍灣國際玫瑰谷,采健壯、芽點飽滿的杏花村枝條作為材料。試驗在三亞市南繁科學技術(shù)研究院的組培快繁實驗室及大棚中完成。

    1.2 方法

    1.2.1 外植體處理

    外植體材料的處理:將采樣枝條進行2 h的流水沖洗,隨后分別將各芽點剪成5 cm左右莖段,莖段含1~2個芽點,外植體在超凈工作臺下用洗滌劑消毒2次。消毒:先用75%酒精浸泡3 min,用無菌水濕潤3次,再用0.1%氯化汞浸泡15 min,加一滴吐溫,輕輕攪拌,然后用無菌水潤洗5遍。消毒完畢,進行接種試驗,將消毒好的莖段處理至1 cm左右的長度,各個莖段都含有一個芽點,相接種至培養(yǎng)基中。

    1.2.2 培養(yǎng)基設(shè)計

    1.2.2.1 啟動誘導培養(yǎng)基

    現(xiàn)選用WPM、MS、1/2 MS 3種培養(yǎng)基類型,添加0.5 mg/L的山農(nóng)(外植體型)抑制污染,且每次選用30個芽節(jié)用于以下培養(yǎng)基進行水平正交試驗:(1) 空白對照;(2) WPM+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L;(3) WPM+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L;(4)WPM+6-BA2.0mg/L+NAA 0.2 mg/L;(5) 1/2 MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L;(6)1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L;(7)1/2MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L;(8)MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L;(9)MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L;(10)MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.05mg/L。

    1.2.2.2 腋芽增殖培養(yǎng)基

    將誘導長出的健壯新芽莖段通過無菌操作進行切割,接種到增殖培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。選用WPM培養(yǎng)基,添加6-BA、NAA、GA3和IBA四種植物生長激素,進行水平正交試驗,每次接種30株新芽,且添加0.5 mL/L山農(nóng)(外植體型)抑制污染。(1)空白對照;(2) WPM+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L;(3) WPM+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.02 mg/L;(4)WPM+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L;(5) WPM+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L;(6) WPM+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.02 mg/L+GA30.5 mg/L; (7)WPM+6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.02 mg/L;(8) WPM+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+GA30.05 mg/L;(9)WPM+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L。

    1.2.2.3 生根培養(yǎng)基

    采用WPM培養(yǎng)基,添加NAA、GA3、IBA三種植物生長激素,以及0.5 mL/L山農(nóng)(內(nèi)生菌型)抑制污染,和0.1 g/L ACO誘導根系生長。設(shè)計水平正交試驗,每次試驗使用30株增殖獲得的健壯無根苗。(1)空白對照;(2)WPM+NAA 0.1 mg/L+IBA 0.1 mg/L;(3) WPM+ NAA 0.2 mg/L+ IBA 0.2 mg/L;(4) WPM+GA30.1 mg/L+NAA 0.05 mg/L+IBA 0.1 mg/L;(5) WPM+ GA30.1 mg/L+ NAA 0.1 mg/L;(6)WPM+ GA30.1 mg/L+NAA 0.2 mg/L+IBA 0.2 mg/L;(7) WPM+ GA30.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L+ IBA 0.2 mg/L;(8)WPM+ GA30.5 mg/L+ NAA 0.1 mg/L+IBA 0.1 mg/L;(9) WPM+ GA30.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L;

    1.2.2.4 煉苗移栽

    將生根培養(yǎng)基中生長健壯并且根部發(fā)育良好的組培苗,從無菌培養(yǎng)室轉(zhuǎn)移至溫室大棚,進行為期一周煉苗。一周后打開培養(yǎng)瓶瓶蓋,將組培苗取出用500~600倍的多菌靈溶液浸泡10 min,且洗凈根部殘留的培養(yǎng)基。然后放在陰涼通風處靜置晾干3~5 min,再移栽至蛭石中觀察15 d,記錄其生長過程及成活率[15]。

    1.2.3 數(shù)據(jù)處理

    用Excel 2010進行數(shù)據(jù)歸納整理,用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對記錄的數(shù)據(jù)進行方差分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同培養(yǎng)基組合對杏花村腋芽誘導的影響

    從表1的正交試驗可知,不同植物生長素濃度配比對杏花村月季初代誘導培養(yǎng)的各處理間差異顯著。結(jié)果表明,生長調(diào)節(jié)劑對腋芽的誘導有一定的作用。其中WPM+6-BA 1.0+NAA 0.1 mg/L效果最為顯著。當6-BA濃度為1.0 mg/L,NAA濃度為0.1 mg/L時,葉片綠而健壯無愈傷,生長良好,誘導率較高,而外植體在無任何生長調(diào)節(jié)劑的WPM培養(yǎng)基中,雖能夠誘導腋芽發(fā)芽,但生長狀況一般,芽個數(shù)較少、誘導率較低。當培養(yǎng)基配方中的6-BA濃度為2.0和0.5 mg/L,NAA濃度為0.2和0.05 mg/L時,雖誘導腋芽的生長,但是植株生長狀況一般,葉黃較多,生長勢弱,說明在誘導培養(yǎng)階段生長調(diào)節(jié)劑的濃度過高或過低,不僅不利于腋芽分化,還可能抑制植株的正常生長,使葉片變黃。3種培養(yǎng)基類型中MS培養(yǎng)基最適宜植株生長,植株生長狀況較好,葉綠,高大健壯,但芽苗個數(shù)較少,誘導率較低。月季品種間的基因型各異和培養(yǎng)基配方有差異,不同濃度的生長調(diào)節(jié)劑組合對月季的腋芽誘導起不同作用。根據(jù)誘導的平均芽數(shù)和生長狀況來看,WPM+6-BA1.0mg/L+NAA 0.1 mg/L是杏花村腋芽誘導的最適培養(yǎng)基(圖1)。

    圖1 腋芽誘導培養(yǎng)的生長發(fā)育過程

    表1 不同培養(yǎng)基組合腋芽誘導的影響

    2.2 不同培養(yǎng)基組合對杏花村腋芽增殖的影響

    由表2可看出,杏花村月季的腋芽增殖效果差異顯著。WPM+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.02 mg/L的增殖效果較好,增殖率顯著高于其他處理,植株長得好,葉綠,產(chǎn)生的愈傷較少,成活率高。而腋芽在無任何生長調(diào)節(jié)劑的WPM培養(yǎng)基中,雖然能增殖,但生長比較差,葉黃,成活率極低。6-BA+NAA+GA3處理增殖效果較6-BA+NAA和6-BA+IBA差,葉黃,愈傷多,成活率低。結(jié)合芽的增殖率、成活率和生長狀況看,WPM+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.02 mg/L為最適合的腋芽增殖培養(yǎng)基(圖2)。

    圖2 腋芽增殖培養(yǎng)的生長發(fā)育過程

    表2 不同培養(yǎng)基組合腋芽增殖的影響

    2.3 不同培養(yǎng)基組合對杏花村腋芽生根的影響

    由表3可以看出,不同濃度的激素配比對杏花村月季的腋芽生根效果的差異顯著。其中WPM+GA30+NAA 0.2 mg/L+IBA 0.2 mg/L,培養(yǎng)配方的效果最為顯著。從方差分析情況看,當IBA濃度為0.2 mg/L、NAA濃度為0.02 mg/L時,腋芽的平均根數(shù)為2.05根,平均株高為0.68 cm。相比其他處理,腋芽生長良好,葉片翠綠,高大健壯,根系發(fā)達,成活率高。而腋芽在無任何生長調(diào)節(jié)劑的WPM培養(yǎng)基中,雖可以達到生根的效果,但生長一般,較健壯,葉較綠,根系較發(fā)達。而WPM+GA30.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+IBA 0.1 mg/L植株生長狀況較差,生長勢弱,葉黃,根系不發(fā)達,大面積死亡成活率低。根據(jù)腋芽的平均株高、平均根數(shù)、成活率和生長狀況來看,最適合腋芽生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基為WPM+NAA0.2mg/L+IBA0.2mg/L(圖3)。

    表3 不同培養(yǎng)基組合腋芽生根的影響

    圖3 腋芽生根培養(yǎng)的生長發(fā)育過程

    2.4 組培苗馴化成活率

    以蛭石為基質(zhì),組培苗放在室外培養(yǎng),隨著時間的變化,適應(yīng)生長環(huán)境的植株,將會長出新葉,葉片數(shù)為2~3片,后期生長健壯會長出叢生芽,生長勢較弱的植株會慢慢表現(xiàn)出葉片枯黃,根部發(fā)黑。煉苗一周后,成活率為90%左右;煉苗兩周后,成活率為70%左右。說明豐花月季杏花村組培苗在三亞移栽馴化具有可行性。

    3 討論與結(jié)論

    本試驗研究了不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對豐花月季杏花村的腋芽誘導、增殖以及生根的影響。外植體的消毒處理與無菌操作在組培試驗中尤為重要,與吳林森等[26]提出的觀點相同。本試驗在外植體的消毒階段,另使用了山農(nóng)試劑對枝條中存在的細小毛刺進行消毒處理,可更大程度上抑制污染發(fā)生。

    在試驗中,發(fā)現(xiàn)MS培養(yǎng)基最適宜植株生長發(fā)育,與閆海霞等[27]研究認為WPM最適宜植株生長的觀點不一致。結(jié)果表明,WPM誘導時間相對MS要慢一些,植株的健壯程度相比MS稍差,但WPM的誘導率相對于MS誘導率更高。因此,腋芽的誘導選用MS培養(yǎng)基也可行。進行腋芽的誘導時,添加2 mg/L 6-BA和0.2 mg/L NAA,會在一定程度上使植物葉片枯黃且長勢弱;將6-BA濃度調(diào)為1 mg/L、NAA濃度調(diào)為0.1 mg/L時,腋芽的誘導生長最佳。由此可見,試驗中的生長調(diào)節(jié)劑6-BA與NAA的有效濃度范圍與 Rout[16]和 Bressan[11]的研究相符。增殖階段中使用GA3效果并不理想,植株生長狀況差,死亡多,葉片黃,愈傷多;IBA則對腋芽的增殖有一定的促進效果。由此可見,進行月季腋芽的增殖時,GA3并不適合,IBA則可行,但相比而言,使用低濃度的6-BA和NAA更適于月季腋芽的增殖。在生根階段由于發(fā)生溫度變高導致根部變黑的情況,從而影響植株的正常生長。這與姚曉惠等[24]研究發(fā)現(xiàn)的結(jié)果一致,生根階段受溫度變化的影響較為顯著,其最適溫度為21℃。因此,本試驗中,將溫度控制在20~25℃,從而避免溫度變化的影響。最后進行移栽培養(yǎng)時,經(jīng)多次反復移栽觀察后,豐花月季杏花村組培苗在蛭石基質(zhì)中生長良好,成活率明顯較高。

    綜上所述,豐花月季杏花村最適宜腋芽誘導的培養(yǎng)基為WPM+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L;最適合腋芽增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)基為WPM+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.02 mg/L;最適宜生根的培養(yǎng)基為WPM+NAA 0.2 mg/L+IBA 0.2 mg/L;組培苗馴化以蛭石為基質(zhì),在室外培養(yǎng)觀察15 d,存活率為50%。

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