基質(zhì)金屬蛋白酶在慢性創(chuàng)面中的研究進展

何秀娟 劉青武 陳 佳 馬慧可 林 燕 李 萍

慢性創(chuàng)面是創(chuàng)面正常的愈合順序被破壞，盡管進行了適當?shù)闹委?，但愈合過程延長。最常見的慢性創(chuàng)面主要有靜脈或動脈潰瘍，壓瘡或糖尿病足潰瘍(diabetic foot ulcer，DFU)[1]。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)能降解細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)成分，炎癥期清除損傷的蛋白質(zhì)和臨時ECM，增殖期降解毛細血管基膜，重塑期收縮和重塑組織，參與細胞遷移和血管生成。創(chuàng)面的高MMPs活性及其與基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(matrix metalloproteinase tissue inhibitors，TIMPs)失衡是導致慢性創(chuàng)面不易愈合的重要原因。

一、MMPs分類和功能

MMPs屬于Zn2+依賴金屬蛋白酶超家族，分為膠原酶、明膠酶、間充質(zhì)溶解素類、膜型-MMPs、基質(zhì)溶解素類和非定義類型[2]。MMPs可由多種細胞分泌并在細胞膜上聚集，在靜止期幾乎檢測不到。當創(chuàng)傷時MMPs被激活，對促進組織再生具有重要作用[3]。

1.膠原酶:包括間質(zhì)膠原酶(MMP-1)、中性粒細胞膠原酶(MMP-8)、膠原酶-3(MMP-13)和 MMP-18。傷口邊緣的MMP-1降低了α1β2整合素和Ⅰ型膠原之間的親和力，從而使傷口邊緣的角質(zhì)形成細胞遷移來閉合創(chuàng)面。慢性創(chuàng)面中發(fā)現(xiàn)大量α2-巨球蛋白(α2M)和MMP-1的復合物。MMP-8主要由中性粒細胞表達和儲存，能有效切割Ⅰ型膠原。糖尿病足潰瘍患者比非糖尿病患者的MMP-1和 MMP-8水平明顯升高，高蛋白水解環(huán)境導致糖尿病患者皮膚創(chuàng)面愈合不良。MMP-13影響角質(zhì)形成細胞的遷移和血管生成，MMP-13敲除小鼠的成纖維細胞減少，創(chuàng)面收縮程度減輕。

2.明膠酶:包括MMP-2(明膠酶A)和MMP-9(明膠酶B)。MMP-2和MMP-9 釋放血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α) 可誘導 ECM 及血管生成因子的釋放，促進創(chuàng)面肉芽組織的纖維蛋白形成。角質(zhì)形成細胞、上皮細胞、中性粒細胞和巨噬細胞都可以產(chǎn)生MMP-9。MMP-9能影響角質(zhì)形成細胞遷移和上皮再生。DFU患者受損皮膚中 MMP-9水平高于健康人和糖尿病患者的健康皮膚，且MMP-9上調(diào)程度與定植細菌數(shù)呈正相關(guān)[4]。難愈性糖尿病性潰瘍MMP-9基因表達異常[5]。使用siRNA技術(shù)降低糖尿病小鼠傷口MMP-9表達，可顯著加速傷口愈合過程并改善新生組織的質(zhì)量[6]。使用MMP-9抑制劑局部治療db /db糖尿病小鼠創(chuàng)面，可使創(chuàng)面愈合加速，再上皮化增多，細胞凋亡顯著減少。使用殼聚糖及硫酸軟骨素溶液加入Ⅰ型膠原制成的基質(zhì) GBT013 敷料作用于糖尿病小鼠慢性傷口，能夠降低MMP-9酶活性，促進糖尿病創(chuàng)面愈合[7]。慢性DFU 滲出物中MMP-2 增高，對降解膠原蛋白和組織破壞具有顯著影響[8]。

3．其他：MMP-3 參與組織重塑，降解膠原纖維，并激活其他MMPs。MMP-14位于細胞表面，可切割細胞周圍的膠原纖維。

二、TIMPs分類和功能

TIMPs能夠結(jié)合并可逆性阻斷 MMPs活性，包括TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3 和TIMP-4。TIMP-1是MMP-9的特異性抑制劑，可促進人成纖維細胞生長，減少細胞凋亡，主要在燒傷創(chuàng)緣強表達。TIMP-2抑制所有MMPs，主要抑制MMP-2前體與活性形式，在焦痂下基質(zhì)中大量表達，在遷移上皮創(chuàng)面邊緣缺乏。TIMP-3與周圍基質(zhì)緊密相連，可以抑制MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9和MMP-13。TIMP-2和TIMP-3是MMP-14的抑制劑。TIMP-4在真皮創(chuàng)傷中作用較小。

慢性創(chuàng)面表皮中TIMP-1、TIMP-2和TIMP-3的表達均降低，出現(xiàn)了MMPs與TIMPs的失衡。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病皮膚組織和糖基化終末產(chǎn)物處理的人成纖維細胞中 TIMP-1的表達均顯著降低；采用 TIMP-1載體介導基因治療糖尿病大鼠創(chuàng)面后，創(chuàng)面愈合明顯改善。采用激光照射體外培養(yǎng)的糖尿病患者皮膚成纖維細胞，可增加TIMP-1表達，減少基質(zhì)降解，促進糖尿病創(chuàng)面愈合。

三、MMPs在創(chuàng)面愈合中的研究進展

MMP-1、MMP-8、MMP-13、MMP-14、MMP-2和MMP-9在急性創(chuàng)傷皮膚再上皮化和消除瘢痕組織的作用已經(jīng)被報道。目前，大多數(shù)MMPs基因敲除的小鼠研究涉及傷口的急性炎癥，并不能說明MMPs對慢性皮膚創(chuàng)面的作用。例如，MMP-3-/-動物發(fā)生皮膚接觸性超敏反應受損，MMP-9-/-小鼠皮膚炎性細胞浸潤減少和清除細菌效率降低。MMP-9已知是維持慢性皮膚傷口的因素，因此是有害的，然而其在急性炎癥中發(fā)揮促血管生成作用，甚至可能是有益的。這說明對于愈合遲緩性皮膚傷口，MMPs的作用取決于疾病或治療階段。

MMPs以無活性的酶原形式生成，受到TIMPs和α2-巨球蛋白的嚴格控制。大多數(shù)MMPs在皮膚中如何被激活，以及是否有活性都是未知的。隨著MMPs活性形式的研究深入，如果能開發(fā)出一種專門結(jié)合活性MMPs的阻斷劑結(jié)合樹脂，就可以在慢性傷口愈合領域取得突破性進展。MMP-9在糖尿病創(chuàng)面中表達上調(diào)，可作為糖尿病創(chuàng)面的標志物。在糖尿病患者和非糖尿病患者的傷口中均檢測到MMP-8。此外，抑制MMP-9和給予外源性MMP-8治療可加速糖尿病小鼠傷口愈合。MMP-8和MMP-9抑制劑的聯(lián)合治療產(chǎn)生了疊加結(jié)果，表明基于藥理學抑制MMPs和外源酶替代的新療法是可行的[9, 10]。目前迫切需要對靜脈功能不全和壓瘡引起的慢性傷口的類似研究。MMPs的廣泛分析，酶活性測試和扎實的臨床工作將明確有害的和有益的MMPs，然后選擇最佳的選擇性MMPs抑制劑和理想的重組酶聯(lián)合治療特定的慢性傷口[11]。

一項把靜脈性腿部潰瘍患者創(chuàng)面滲出液中9種MMPs和4種人TIMPs水平進行比較的研究表明，肉芽創(chuàng)面滲出液中MMP-1和MMP-13的水平高于炎性創(chuàng)面，而炎性創(chuàng)面滲出液中MMP-2、MMP-9和MMP-12的含量顯著高于肉芽創(chuàng)面[12]。在炎性創(chuàng)面滲出液中TIMP-1和TIMP-2水平較高，而在肉芽創(chuàng)面滲出液中TIMP-4水平較高。當人骨髓單核細胞THP-1細胞被創(chuàng)面滲出液刺激時，MMP-1、MMP-8和MMP-9水平在接觸炎性創(chuàng)面滲出物后升高，而MMP-3、MMP-7、MMP-12和MMP-13水平用肉芽創(chuàng)面分泌物刺激時升高。舒洛地希是一種治療靜脈性腿部潰瘍的糖胺聚糖(glycosaminoglycans, GAGs)，其在體外使肉芽創(chuàng)面滲出液刺激的THP-1細胞MMP-2水平升高，MMP-7水平降低，并使炎性創(chuàng)面滲出液刺激的THP-1細胞MMP-8水平顯著降低。上述結(jié)果闡明了MMPs水平的階段特異性差異，提供了一種針對不同疾病狀態(tài)獲取生化標志物的篩選方法和標準，以客觀的方式評估臨床治療效果，但是尚不能確定這些分子是難愈合性靜脈創(chuàng)面的原因還是結(jié)果。由于沒有理想的慢性靜脈潰瘍的動物模型，這些分子和治療方案尚未在體內(nèi)進行研究。

另一項研究發(fā)現(xiàn)，各種形式的MMP-9在壓瘡患者創(chuàng)面表達上調(diào)[13]。對MMP-9基因啟動子(-1562 C->T)單核苷酸多態(tài)性的研究發(fā)現(xiàn)，T等位基因表達較高。一項由22例DFU患者參加的研究顯示，第0、12周“愈合良好者”MMP-1水平顯著高于“愈合不良者”；MMP-9水平顯著低于“愈合不良者”。研究通過分析MMP-9水平，MMP-1/TIMP-1和MMP-9/TIMP-1比率，提出了一種“不良治愈評分系統(tǒng)”，其可以在患者入院時確定，有可能在臨床上用作治愈的預測因子，從而采取適當?shù)闹委熡媱漑14]。

一項研究把靜脈性腿部潰瘍(VLU)患者、2型糖尿病神經(jīng)病變足潰瘍(DFU)患者和VLU患者的自體皮膚移植后供體部位(作為愈合對照傷口)比較，3組傷口液體沒有MMP-9水平的差異；兩個慢性傷口組 TIMP-1水平顯著降低，導致MMP-9/TIMP-1比率嚴重不平衡；2型糖尿病患者血清中MMP-9水平較高，因此研究認為阻斷MMP-9高酶活性并不一定使慢性創(chuàng)面恢復正常[15]。

MMPs(包括MMP-9)是重要的免疫調(diào)節(jié)劑。局部使用蛋白酶(如膠原酶)及其抑制劑可模擬正常傷口愈合的過程，這種局部皮膚治療可能沒有全身不良反應。第2種免疫調(diào)節(jié)方法是局部應用MMPs誘導劑，例如原則上可以通過促炎IL-1誘導表達內(nèi)源性膠原酶，但如果循環(huán)中IL-1水平輕微升高，則可能誘發(fā)全身急性反應和發(fā)熱。此外，一種更合適的方法可能是使用趨化因子，如人體內(nèi)主要的中性粒細胞趨化劑IL-8，IL-8與GAGs局部結(jié)合，并招募和激活中性粒細胞，產(chǎn)生MMP-8和所有形式的MMP-9[16]。

以蛋白酶抑制劑為基礎的策略來改善慢性傷口。慢性創(chuàng)傷微環(huán)境MMPs和TIMPs失衡導致外源性生長因子的降解。因此，解決這個問題的一種方法是提供蛋白酶抑制劑。例如，ND-336可選擇性地抑制MMP-2、MMP-9和MMP-14，可通過減少炎性反應、增強上皮再生和增加血管生成來加速糖尿病小鼠的傷口閉合。在傷口敷料中加入蛋白酶抑制劑也已被探索。例如，將膠原蛋白和氧化再生纖維素基質(zhì)結(jié)合到傷口敷料中，可以通過與MMPs結(jié)合和鈍化來改善傷口修復。銀敷料和水凝膠是抗菌的，在豬模型和臨床試驗中也顯示出了有前景的結(jié)果[17]。此外，銀通過取代MMPs中的鋅使蛋白酶失活，從而加速肉芽組織的形成。

慢性傷口MMPs的水平增加導致病理性基質(zhì)降解。因此需要功能性生物材料來恢復MMPs和TIMPs之間的平衡以促進傷口愈合。硫酸化糖胺聚糖GAG衍生物具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，天然GAG與TIMP-3相互作用，前者是功能化生物材料中有希望的候選者。通過結(jié)合實驗和分子建模方法鑒定了TIMP-3的GAG結(jié)合位點，并揭示GAG衍生物比天然GAG具有更高的螯合TIMP-3的能力，而且不改變其對MMPs的抑制潛力。因此，含有GAG衍生物的生物材料可以保護組織免于過度的蛋白水解降解，通過重建MMPs/TIMPs平衡來治療慢性傷口[18]。

四、展 望

MMPs和細胞因子一樣，可以成為治療常見慢性傷口的有效藥物或藥物靶點?，F(xiàn)有的技術(shù)可以確定在傷口愈合的不同階段的目標蛋白酶。例如，MMP-9在炎癥早期是有益的中性粒細胞源性分子，但一旦形成肉芽組織，它就成為慢性傷口的有害和維持因素。到目前為止，直接促血管生成的治療方法都失敗了，但在動物模型研究中，局部蛋白酶和蛋白酶抑制劑治療可促使糖尿病創(chuàng)面更快愈合。用促炎性細胞因子和趨化因子替代治療可能有助于將張力性肉芽腫性皮膚創(chuàng)面轉(zhuǎn)變?yōu)楦缓艿难仔越M織，這是外科清創(chuàng)術(shù)的一種補充方式?，F(xiàn)今的技術(shù)，例如轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學，用于描述正常和異常的傷口愈合，并且對于動物模型，可以針對有用的免疫調(diào)節(jié)劑和靶標。因此，跨學科研究的結(jié)合，以及用基礎、臨床前和臨床分子免疫學的專門研究取代病例報告，將改變慢性傷口愈合領域的發(fā)展。最后，免疫調(diào)節(jié)療法的臨床轉(zhuǎn)化取決于改進給藥方法的發(fā)展[19]。然而，許多已經(jīng)進入臨床試驗的療法未起到預期效果，因為目前的給藥方法依賴于超生理的大劑量，而不是可控的、持續(xù)的釋放。因此，新的傳遞系統(tǒng)對于目前正在探索和未來將要探索的治療方法的成功轉(zhuǎn)化至關(guān)重要。