外泌體在胰腺腫瘤早期診斷、治療和預(yù)后方面的臨床價(jià)值

夏文雯 陳瑋 王強(qiáng) 趙嚴(yán)

1同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200072；2張家港市第二人民醫(yī)院消化內(nèi)科，張家港 215600

外泌體(exosomes)是一種40～100 nm大小，含有DNA、RNA和蛋白質(zhì)的細(xì)胞外囊泡，在腫瘤的生長和遷移中發(fā)揮著重要作用。所有活細(xì)胞都會產(chǎn)生外泌體，而癌細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體較正常細(xì)胞更多。外泌體的脂質(zhì)雙層膜可以保護(hù)內(nèi)部的核酸，使其免被血漿中的核酸酶分解，使內(nèi)部核酸能以高分子量形式存在，這些高質(zhì)量DNA材料使分子分析具有更高的分辨率和敏感性[1]。體液檢測腫瘤外泌體的簡便性大大推動(dòng)了外泌體在癌癥診斷效用方面的研究。部分研究表明外泌體不僅可以幫助診斷疾病，還與治療的反應(yīng)及疾病預(yù)后相關(guān)。

1．外泌體核酸與胰腺腫瘤早期診斷：外泌體中含有高質(zhì)量的核酸，通過核酸來早期診斷胰腺癌是近幾年的研究熱點(diǎn)。Madhavan等[2]研究發(fā)現(xiàn)，血清外泌體上癌癥起始細(xì)胞標(biāo)記和miRNA標(biāo)記的互補(bǔ)性增強(qiáng)了基于血清外泌體的胰腺癌診斷的可靠性，并且證實(shí)了這種檢測手段在大規(guī)模臨床評估上的穩(wěn)定性。Goto等[3]通過下一代測序分析評估了胰腺癌或?qū)Ч軆?nèi)乳頭狀黏液性腫瘤(intraductal papillary mucinous neoplasm, IPMN)患者和沒有腫瘤患者的外泌體miRNA(ex-miRNA)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，胰腺癌和IPMN患者中ex-miR-191、ex-miR-21和ex-miR-451a的表達(dá)顯著上調(diào)，且這3種ex-miR的診斷準(zhǔn)確性比血清miRNA高5%～20%。Kitagawa等[4]也發(fā)現(xiàn)血漿中部分信使RNA和小核仁RNA，如WASF2、ARF6、SNORA74A和SNORA25被包裹在外泌體中并從培養(yǎng)的胰腺癌細(xì)胞中分泌，且WASF2水平與胰腺癌風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性最高，可用于胰腺癌的早期診斷。Nakamura等[5]研究了PDAC和CP患者胰液中提取的外泌體，發(fā)現(xiàn)與CP患者相比，PDAC患者中ex-miR-21和ex-miR-155的相對水平明顯更高，而胰液miR-21和miR-155的相對水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明胰液中的部分外泌體miRNA，如ex-miR-21和ex-miR-155也可作為PDAC的生物標(biāo)志物。

KRAS基因突變在胰腺癌患者中常見，其可促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。Allenson等[6]發(fā)現(xiàn)KRAS突變體陽性與胰腺癌相關(guān)，而檢測外泌體DNA中的突變型KRAS比檢測血漿循環(huán)DNA具有更高的效用。

2．外泌體蛋白質(zhì)與胰腺腫瘤早期診斷：外泌體中蛋白質(zhì)的差異性表達(dá)也是胰腺癌早期診斷標(biāo)志物的研究熱點(diǎn)。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(glypican 1, GPC1)在PDAC細(xì)胞和鄰近的基質(zhì)成纖維細(xì)胞中表達(dá)。有研究表明正常胰腺和PDAC組織之間的GPC1水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但PDAC患者的循環(huán)外泌體(circulating exosomes, crExos)中GPC1水平較高[1]，提示外泌體中的GPC1蛋白可用于PDAC的早期檢測。Melo等[7]通過研究乳腺癌、PDAC和健康供體患者血清中分離的crExos，發(fā)現(xiàn)GPC1陽性表達(dá)患者的crExos與癌癥之間存在強(qiáng)烈的相關(guān)性，特別是對于PDAC。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在胰腺癌患者血清crExos中檢測到GPC1，對診斷胰腺癌具有極高的特異度和靈敏度，可將健康受試者和良性胰腺疾病患者與早期及晚期胰腺癌患者區(qū)分開來。研究認(rèn)為GPC1陽性表達(dá)者的crExos可作為潛在的非侵入性診斷和篩查工具，用于檢測早期階段的胰腺癌。之后的研究同樣發(fā)現(xiàn)GPC1蛋白在正常胰腺的外分泌部中不存在，但在PDAC中顯著過表達(dá)，同時(shí)腫瘤細(xì)胞中GPC1的增加與AJCC分期無關(guān)，表明它可能是早期PDAC的優(yōu)良檢測標(biāo)志物[8]。

除了GPC1蛋白，鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ZIP4同樣可用于PDAC的檢測。Jin等[9]發(fā)現(xiàn)外泌體ZIP4水平可用于區(qū)分惡性胰腺癌患者與良性胰腺疾病患者、膽道疾病患者和健康群體，良性胰腺腫瘤患者和胰腺炎患者的外泌體ZIP4水平也存在顯著差異。

1．外泌體與抗藥性：胰腺癌具有局部侵襲、早期轉(zhuǎn)移和對治療的高度抗性的特征，目前常規(guī)使用細(xì)胞毒性藥物來治療，吉西他濱是最常使用的藥物?？顾幮允侵委熓〉闹饕?，因此迫切需要有效的預(yù)測標(biāo)志物以區(qū)分胰腺腫瘤患者并制定個(gè)體化治療方案，從而實(shí)現(xiàn)最小化治療抗性[10]。

Patel等[11]發(fā)現(xiàn)吉西他濱處理的胰腺腫瘤細(xì)胞能產(chǎn)生明顯的抗藥性，而這種抗藥性大多是由腫瘤細(xì)胞的外泌體引起。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這類經(jīng)吉西他濱處理的釋放外泌體(gem-exo)的胰腺腫瘤細(xì)胞中超氧化物歧化酶2(superoxide demutase 2, SOD2)和ROS解毒基因(CAT)上調(diào)，而吉西他濱代謝基因脫氧胞苷激酶(deoxycytidine kinase, DCK)下調(diào)。SOD/CAT上調(diào)抑制基礎(chǔ)和吉西他濱誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生，并部分促進(jìn)化學(xué)抗性。外泌體遞送的miR-155導(dǎo)致DCK下調(diào)，而當(dāng)miR-155的功能受到抑制或DCK得以恢復(fù)時(shí)，gem-exo介導(dǎo)的化學(xué)抗性顯著消除。這些發(fā)現(xiàn)證明了外泌體在介導(dǎo)胰腺腫瘤的獲得性化學(xué)抗性中的新作用。同一時(shí)期，Mikamori等[12]進(jìn)一步驗(yàn)證了吉西他濱的長期暴露會增加PDAC細(xì)胞中miR-155的表達(dá)，miR-155的增加誘導(dǎo)了外泌體的分泌，而外泌體將miR-155遞送到其他PDAC細(xì)胞，miR-155又可通過促進(jìn)抗凋亡活性來增強(qiáng)PDAC細(xì)胞的化學(xué)抵抗能力。對miR-155或外泌體分泌的靶向治療可有效地減弱PDAC細(xì)胞的化學(xué)抗性，為吉西他濱治療PDAC提供了新的靶點(diǎn)。

Fan等[10]研究了對吉西他濱抗性可變的3種胰腺腫瘤細(xì)胞系(PANC1、MIA PaCa-2和BxPC3)分離出的外泌體在這些細(xì)胞系中傳遞化學(xué)抗性的能力，發(fā)現(xiàn)具有化學(xué)抗性的PANC1細(xì)胞外泌體促進(jìn)了MIA PaCa-2和BxPC3細(xì)胞產(chǎn)生吉西他濱抗性。進(jìn)一步研究表明，外泌體EphA2的表達(dá)可以傳遞抗藥性，這可能作為預(yù)測胰腺腫瘤治療反應(yīng)的微創(chuàng)生物標(biāo)志物。

2．外泌體與藥物遞送：除了化學(xué)抗性，藥物遞送方式的低效率也是限制現(xiàn)有藥物治療功效的一個(gè)重要因素。Pascucci等[13]在2014年首次證明間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞能夠通過其分泌的膜微泡包裝和遞送活性藥物，為抑制體外腫瘤生長提供了一種新的藥物輸送方法。外泌體作為無免疫原性的納米級囊泡，在有效藥物遞送系統(tǒng)研究方面受到了極大的關(guān)注。Kanchanapally等[14]通過用阿霉素孵育胰腺癌細(xì)胞、胰腺星狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)外泌體的藥物裝載，用高效液相色譜分析法評估藥物包裝到外泌體中的功效，發(fā)現(xiàn)胰腺癌細(xì)胞釋放的外泌體最高，且裝載藥物量也最多；而巨噬細(xì)胞衍生的外泌體顯示出最高的抗腫瘤活性，提示外泌體的藥物裝載存在供體細(xì)胞特異性差異，這可能影響它們作為治療性藥物載體的效用。

1．外泌體核酸與胰腺腫瘤患者預(yù)后：Takahasi等[15]研究發(fā)現(xiàn)血漿外泌體miR-451a在術(shù)后復(fù)發(fā)的PDACⅡ期患者中上升最明顯，且外泌體miR-451a與腫瘤大小和分期顯著相關(guān)。高水平外泌體miR-451a患者的總存活率和無病存活率顯著低于低水平miR-451a患者，認(rèn)為血漿外泌體miR-451a水平可能是用于預(yù)測PDAC患者的復(fù)發(fā)和預(yù)后的有效微創(chuàng)生物標(biāo)志物。但Goto等[3]卻發(fā)現(xiàn)高ex-miR-21表達(dá)患者的總存活率明顯短于低ex-miR-21表達(dá)患者，而ex-miR-191和ex-miR-451a不影響胰腺腫瘤患者的生存率。Li等[16]發(fā)現(xiàn)PDAC患者血漿外泌體miR-222高，與腫瘤大小和TNM分期顯著相關(guān)，是PDAC患者生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。而任瀟凡和李志花[17]在研究中發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的外泌體lncRNA CCAT1與胰腺癌的進(jìn)展有潛在的聯(lián)系，外泌體lncRNA CCAT1過表達(dá)與胰腺癌患者不良預(yù)后呈正相關(guān)，是影響胰腺癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立因素。

研究證明KRAS突變也與胰腺腫瘤的預(yù)后有關(guān)。Bernard等[18]收集了患者的液體活檢樣本，通過多變量分析發(fā)現(xiàn)外泌體來源的DNA(exoDNA)中KRAS的突變等位基因分?jǐn)?shù)(mutant allele fraction, MAF)≥5%是無進(jìn)展生存期和總生存期的重要預(yù)測因子。進(jìn)一步分析了局限性PDAC患者的連續(xù)血液樣品中exoDNA和循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)水平，發(fā)現(xiàn)新輔助治療后exoDNA水平的增加與疾病進(jìn)展顯著相關(guān)，而ctDNA與預(yù)后無明顯相關(guān)性。Allenson等[6]也發(fā)現(xiàn)超過1%的KRAS MAF是影響無病生存期的重要風(fēng)險(xiǎn)因素。

2．外泌體蛋白質(zhì)與胰腺腫瘤患者預(yù)后：Melo等[7]通過評估術(shù)前和術(shù)后血清GPC1陽性表達(dá)的PDAC患者crExos水平，發(fā)現(xiàn)手術(shù)切除后crExos水平顯著降低，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)crExos水平與腫瘤負(fù)荷及手術(shù)前和手術(shù)后患者的存活相關(guān)，crExos的減少可作為預(yù)測疾病存活的獨(dú)立特異性預(yù)后標(biāo)志。Frampton等[1]發(fā)現(xiàn)PDAC手術(shù)切除后患者crExos的GPC1水平顯著下降，且高crExos GPC1水平的患者具有更大的腫瘤負(fù)荷。Lu等[8]也發(fā)現(xiàn)GPC1是胰腺癌患者總生存率較低的重要危險(xiǎn)因素，風(fēng)險(xiǎn)比增加1.82倍。在胰腺腫瘤發(fā)生過程中，GPC1異位表達(dá)并作為獨(dú)立的不良預(yù)后因素。高水平的GPC1與較差的病理分化和較差的生物學(xué)行為相關(guān)。然而，Tanaka等[19]的研究結(jié)果卻并未表明GPC1陽性病例與GPC1陰性病例之間的預(yù)后差異?？紤]到GPC1是由胰腺癌前病變表達(dá)的，可能不參與胰腺癌晚期的惡性潛能，故認(rèn)為GPC1蛋白表達(dá)與胰腺癌患者的總體存活率或無復(fù)發(fā)存活率無關(guān)。除GPC1，Sakaue等[20]還發(fā)現(xiàn)腹水提取的外泌體中高度糖基化的CD133可作為晚期胰腺癌患者預(yù)后較好的潛在生物標(biāo)志物。

近幾年外泌體在胰腺腫瘤發(fā)生、發(fā)展、抗藥性、臨床診斷及預(yù)后的研究中備受關(guān)注，外泌體中的高質(zhì)量核酸與蛋白質(zhì)更是研究熱點(diǎn)。然而外泌體中低濃度的DNA和DNA突變影響了液體活檢的靈敏度，缺乏區(qū)分癌癥外泌體和正常外泌體的有效手段影響了液體活檢的特異度，這個(gè)問題的解決還有待外泌體DNA分離技術(shù)的改進(jìn)。GPC1蛋白的表達(dá)在胰腺癌早期檢測方面也受到一定的限制，GPC1過表達(dá)的PDAC前體病變并不一定會發(fā)展成為胰腺癌，故確定GPC1表達(dá)水平的閾值以檢測胰腺惡性腫瘤十分必要。綜上所述，外泌體在胰腺腫瘤診治方面具有巨大發(fā)展?jié)摿Γ瑸橐认倌[瘤提供了新的診療思路和手段，但后續(xù)仍需大樣本的研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突