庫德里阿茲威氏畢赤酵母在發(fā)酵工業(yè)中的研究進(jìn)展

王德培，胡 陽，焦 富

（貴州茅臺酒股份有限公司，貴州仁懷 564500）

在石器時代時，人類便已開始利用酵母發(fā)酵來增加食物和飲料的風(fēng)味以及保存周期。乙醇發(fā)酵從最開始的自然發(fā)酵到如今過程受控制的工業(yè)發(fā)酵，發(fā)酵劑也由多菌種混合發(fā)酵轉(zhuǎn)變?yōu)樘囟ǖ膯我痪N發(fā)酵，而釀酒酵母及其近源種是最常見也是應(yīng)用最廣泛的發(fā)酵劑。然而，使用釀酒酵母進(jìn)行純種發(fā)酵也有其局限性，一方面是很難篩選到一株同時滿足所有優(yōu)良性狀的酵母，同時在傳代擴(kuò)培中也容易出現(xiàn)突變導(dǎo)致菌株性狀衰退，另一方面，純種發(fā)酵的風(fēng)味較為單一，難以滿足市場多樣化需求。此外，釀酒酵母的外源蛋白表達(dá)量較低，難以滿足多種工業(yè)化的發(fā)酵需求。

此時，非釀酒酵母（non-Saccharomyces）在工業(yè)發(fā)酵領(lǐng)域逐漸受到關(guān)注和研究。盡管很多非釀酒酵母被認(rèn)為是不受歡迎的污染雜菌，但仍然有不少被認(rèn)為是有益菌種，一方面能降低腐敗污染風(fēng)險、提高發(fā)酵效率，另一方面，能合成多種酶將原料中的前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為風(fēng)味物質(zhì)，如增加酒中甘油含量、降低乙酸含量，產(chǎn)生酯類、揮發(fā)性酚類等特殊風(fēng)味物質(zhì)，能夠改善發(fā)酵食品和飲料的整體質(zhì)量和品質(zhì)，增強(qiáng)風(fēng)味多樣性。庫德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）便是這樣的一種非釀酒酵母。1960 年Kudryavtsev[1]根據(jù)其球形的子囊孢子特征最先將該菌種描述為東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis），經(jīng)過一些列DNA 序列對比實(shí)驗(yàn)后，才最終定下P.kudriavzevii的命名。

P.kudriavzevii在自然界中廣泛分布，經(jīng)常在自發(fā)發(fā)酵中出現(xiàn)，如白酒、葡萄酒、乳制品、酸面團(tuán)等，但P.kudriavzevii在發(fā)酵工業(yè)中的作用和地位需要進(jìn)一步評估。例如，有研究表明，P.kudriavzevii導(dǎo)致了泡菜的腐敗，包括異味和質(zhì)地軟化；假絲酵母引起的人類真菌感染中約2 %是由P.kudriavzevii（即Candida krusei）導(dǎo)致。另一方面，人們越來越認(rèn)識到P.kudriavzevii作為工業(yè)發(fā)酵過程中的發(fā)酵劑的潛力：其獨(dú)特的風(fēng)味特征和酶活性使它們非常適合開發(fā)新風(fēng)格酒精飲料；同時它們對低pH 值的耐受性，其有效的新陳代謝以及產(chǎn)生高濃度乙醇的能力引起了生物乙醇研究領(lǐng)域的注意。因此，對P.kudriavzevii的研究是一個熱門話題，并且越來越多的研究開始針對特有的P.kudriavzevii的基因組、轉(zhuǎn)錄組、代謝組、蛋白質(zhì)組和表觀特征。

在本綜述中，我們主要就P.kudriavzevii的現(xiàn)有信息進(jìn)行了全面概述。在第一部分中，討論了生物學(xué)和遺傳多樣性以及P.kudriavzevii的分類歷史和地位。在第二部分，綜述了P.kudriavzevii的遺傳特征，以及進(jìn)化如何塑造該物種的基因組。接下來，我們回顧表型特征，例如風(fēng)味活性化合物的產(chǎn)生，工業(yè)相關(guān)條件下的生長模式和微生物安全性方面。在最后一部分，我們討論了P.kudriavzevii在三個發(fā)酵過程中的作用和潛力，即中國白酒、葡萄酒和生物乙醇的生產(chǎn)及其他應(yīng)用潛力。

1 庫德里阿茲威氏畢赤酵母分類歷史和地位

P.kudriavzevii最初被Kudryavtsev描述為Issatchenkia orientalis，他認(rèn)為球形子囊孢子是Issatchenkia屬的定義特征之一。Kreger-van Rij 不接受這種分類，并將該物種轉(zhuǎn)移到Pichia屬作為P.orientalis。Boidin 等[1]注意到與之前Pichia orientalis的不同，并提出了新名稱P.kudriavzevii。Von Arx等[2]重新審視了酵母種屬的范圍，強(qiáng)調(diào)子囊孢子形態(tài)作為一個定義的特征，并恢復(fù)了Issatchenkia屬。因此，Kurtzman等[3]接受了Issatchenkia屬，并在該屬中增加了現(xiàn)在被分類為P.exigua、P.occidentalis、P.scutulata和P.terricola的物種。然而，對D1/D2LSU rRNA基因序列的分析表明，歸類到Issatchenkia屬的物種是P.membranifaciens進(jìn)化枝的成員[3]。多基因分析進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)，Issatchenkia屬是P.membranifaciens進(jìn)化枝的成員，并導(dǎo)致它們返回Pichia屬。全基因測序結(jié)果表明，P.kudriavzevii、C.krusei、I.orientalis和C.glycerinogenes是同一物種不同名字，基因組的DNA 序列同源性為99.6 %[4]。與工業(yè)應(yīng)用相關(guān)的出版物通常使用物種名稱P.kudriavzevii，I.orientalis或C.glycerinogenes優(yōu)先于C.krusei，可能是因?yàn)樵谏锛夹g(shù)或食物環(huán)境中使用病原體名稱會有負(fù)面的安全性信號[5]。根據(jù)One Fungus One Name 原則，因此應(yīng)該把P.kudriavzevii作為唯一名稱來使用。

2 庫德里阿茲威氏畢赤酵母基因組及表觀特征

P.kudriavzevii廣泛分布于自然界，常發(fā)現(xiàn)于各種天然發(fā)酵、果實(shí)和土壤中，這些生態(tài)位存在各種環(huán)境壓力：低氧、低pH 值、高溫、高乙醇濃度等[6]。本節(jié)將簡要概述P.kudriavzevii基因組以及其表型特征，使其適應(yīng)這些惡劣的環(huán)境，并競爭勝過其他微生物，最后還討論了其工業(yè)化應(yīng)用的潛在生物安全性。

2.1 基因組

新一代測序技術(shù)使全基因組測序成為一項(xiàng)便宜且近乎瑣碎的工作，目前已發(fā)表了40 多株不同酵母的基因組，其中包括5 株P(guān).kudriavzevii和2 株C.krusei的基因組序列，但很少提供染色體水平的組裝或基于轉(zhuǎn)錄組的注釋。Douglass 等[5]測序P.kudriavzevii的基因組，顯示其基因組由5 條染色體組成，10.18～12.94 Mb，其蛋白質(zhì)編碼的基因密集（約4949～7107 個基因），幾乎沒有重復(fù)的DNA；雖然P.kudriavzevii是甲基營養(yǎng)酵母進(jìn)化枝的成員，但P.kudriavzevii基因組不含有甲醇氧化酶基因（MOX1/AOX1），它們都不能以甲醇作為唯一的碳源生長。另外，P.kudriavzeviiM12 帶有編碼木糖還原酶、木糖醇脫氫酶和負(fù)責(zé)將木糖轉(zhuǎn)化為D-木酮糖的木酮糖激酶，可將木糖轉(zhuǎn)化并進(jìn)入磷酸戊糖途徑以生產(chǎn)乙醇；此外還帶有3 個編碼植酸酶的基因等，有作為益生菌的潛力。

首次報道描述P.kudriavzevii時，它的每個子囊能夠形成一個孢子，但Kurtzman 等[3]后來的研究報道，P.kudriavzevii不會交配或形成孢子。Douglass等[5]測序發(fā)現(xiàn)該CBS573 菌株是三倍體，這為其不能形成孢子或至少不能產(chǎn)生具有活性的孢子提供了一種可能的解釋。測序研究的32 株P(guān).kudriavzevii中大多數(shù)是二倍體，但仍有部分菌株是三倍體。P.kudriavzeviiCBS573 的基因組似乎含有完整的生殖周期基因庫，包括信息素基因（MFa，MFα）和MAPK 激酶途徑中控制交配的大多數(shù)同源基因。對三倍體分離株的可能解釋是，例如MATa/α二倍體喪失雜合性（大多數(shù)菌株均含有MATa 和MATα基因，但有的僅含有MATa 或MATα）而變成MATα/α，然后與MATa 單倍體孢子交配以形成MATa/α/α三倍體。

2.2 生理特性

P.kudriavzevii在含5%麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d 后，菌落呈丁香和淡奶油色；Dalmau 平板法培養(yǎng)7 d 后，在蓋玻片下顯示出豐富且適度分枝的假菌絲。盡管P.kudriavzevii和釀酒酵母的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，但它們都具有一些共同特征，例如都屬于兼性厭氧菌，具有多重耐受性，這使它們能夠在許多酒精發(fā)酵環(huán)境中具備競爭優(yōu)勢。

氧氣。研究表明[7]，P.kudriavzevii是好氧酵母，在溶氧充足（溶氧飽和度＞30%）的環(huán)境中，其呼吸作用占主導(dǎo)位置，此時生長迅速且沒有生成乙醇，這表明P.kudriavzevii是Crabtree陰性。實(shí)際發(fā)酵環(huán)境很難保證溶氧充足，特別是在厭氧發(fā)酵環(huán)境，P.kudriavzevii的生長速率和底物利用率都會比有氧條件低，此時會生成乙醇、乳酸、甘油等產(chǎn)物，適當(dāng)增加發(fā)酵體系中的溶氧能夠提高P.kudriavzevii的發(fā)酵速率和乙醇產(chǎn)量。

溫度。利用生物質(zhì)發(fā)酵前需要加酶進(jìn)行高溫糖化預(yù)處理（約50 ℃），耐高溫酵母可以邊糖化邊發(fā)酵，縮短發(fā)酵時間，還能降低冷卻成本和污染風(fēng)險，特別是在全年氣溫通常很高的熱帶國家，因此酵母的耐熱性對于發(fā)酵生產(chǎn)生物乙醇非常重要[8]。P.kudriavzevii在35～45 ℃條件下，其發(fā)酵效率比釀酒酵母更高。據(jù)報道，在40 ℃條件下，P.kudriavzeviiRZ8-1 的乙醇產(chǎn)量可達(dá)3.38 %（含8.5 %葡萄糖），P.kudriavzeviiDMKU 3-ET15 的乙醇產(chǎn)量可達(dá)7.86%（含18%葡萄糖的木薯淀粉水解物）[7]。在高溫乙醇發(fā)酵過程中，編碼熱休克蛋白（ssq1 和hsp90），乙醇脫氫酶（adh1，adh2，adh3 和adh4）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（tdh2）的基因被上調(diào)，表明這些基因可能在熱脅迫下對P.kudriavzeviiRZ8-1 的耐熱能力起著至關(guān)重要的作用；代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)P.kudriavzevii的耐熱性還與不飽和脂肪酸、嘌呤和嘧啶的含量更高有關(guān)。

碳源。P.kudriavzevii能夠代謝利用多種碳源進(jìn)行生長，但是利用效率存在較大差異。經(jīng)研究人員證實(shí)P.kudriavzevii對葡萄糖、果糖利用率最高，其次是甘露糖、乙醇和甘油，個別菌株能少量利用半乳糖和木糖；不會代謝麥芽糖、乳糖、阿拉伯糖、纖維二糖、棉子糖或海藻糖、麥芽糖[7，9]。大部分P.kudriavzevii菌株因不含有蔗糖酶而不能利用蔗糖，但是也有報道個別菌株能夠利用蔗糖產(chǎn)乙醇，且經(jīng)過半乳糖預(yù)處理的P.kudriavzevii細(xì)胞利用蔗糖的速率更快，乙醇產(chǎn)量更高。此外，P.kudriavzevii是Krebs 陽性菌，可以消耗蘋果酸和其他三羧酸循環(huán)中間體作為唯一的碳源和能源，且不受葡萄糖抑制，該特點(diǎn)使P.kudriavzevii能夠在厭氧發(fā)酵過程中降解檸檬酸或蘋果酸，調(diào)節(jié)酒體的酸度；而S.cerevisiae、Zygosaccharomyces bailii、Schizosaccharomyces pombe等Krebs 陰性菌只能在葡萄糖或其他可同化的碳源存在的前提下才能利用蘋果酸[10-11]。

氮源。氮源是影響酵母菌生長和代謝的關(guān)鍵，P.kudriavzevii能夠代謝利用有機(jī)氮和無機(jī)氮進(jìn)行生長，包括酵母提取物、玉米漿、硫酸銨和磷酸二銨等，但很難利用硝酸鹽和尿素[9，12]。Rijswijck等[13]的研究表明，在限制氮源的條件下，P.kudriavzevii的生長模式會發(fā)生轉(zhuǎn)變，此時的P.kudriavzevii會形成metafilaments 或假菌絲。盡管假菌絲形成背后的機(jī)制及其在細(xì)胞代謝中的作用尚不清楚，可能與缺少輔酶有關(guān)，也與編碼細(xì)胞壁蛋白的基因FLO11和酯類物質(zhì)的形成也有關(guān)系，推測認(rèn)為假菌絲是在營養(yǎng)物質(zhì)耗盡期間形成，尤其是氮源，假菌絲的形成有助于深入培養(yǎng)基獲取營養(yǎng)物質(zhì)。

2.3 生物安全性

酵母大多都是不具有侵略性和傳染性的微生物，但個別酵母可能是機(jī)會致病菌。P.kudriavzevii及其無性型假絲酵母（C.krusei）廣泛分布于自然界中，也是一種常見的臨床分離真菌[5，14-15]。但P.kudriavzevii和C.krusei[11，16]均不被認(rèn)為是致病菌，被歸類為生物安全1 級（BSL-1），被美國FDA 認(rèn)為是“公認(rèn)的安全”[5]，同時也被列入國際乳業(yè)聯(lián)合會（IDF）與歐洲食品和飼料文化協(xié)會（EFFCA）出版的“MFC 清單”中。然而，最新的研究顯示，來源于環(huán)境的P.kudriavzevii和來源于臨床的C.krusei的表型沒有明顯差異，且大都具有相似水平的耐藥性；甚至整個畢赤酵母屬似乎都具有對氟環(huán)唑的高耐藥性，例如P.fermentans、P.norvegensis和P.cactophila等[5]。

酵母、人類反應(yīng)和食物之間的聯(lián)系主要基于飲食觀察，當(dāng)個體的健康和免疫系統(tǒng)較弱時會面臨的風(fēng)險更大，包括癌癥、艾滋病以及接受免疫抑制藥物、廣譜抗生素和放射化療的患者[17]。人群中這種個體的頻率越高，報告酵母感染的報告就越多；此外，越來越多的酵母菌應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)，增加了個體暴露于酵母的感染幾率。因此，在生物工業(yè)中使用P.kudriavzevii可能會對免疫功能較低的工人的健康產(chǎn)生潛在的危害，并可能對消費(fèi)者造成潛在的危害，這需要引起注意。

3 庫德里阿茲威氏畢赤酵母在發(fā)酵工業(yè)中的作用

經(jīng)常能在一些傳統(tǒng)食品和飲料的發(fā)酵過程中分離得到P.kudriavzevii，例如中國白酒、可可豆發(fā)酵、葡萄酒、發(fā)酵乳等，同時還具有作為益生菌和生物控制劑的潛力[16]；同時，P.kudriavzeviiis在生產(chǎn)生物乙醇、甘油和琥珀酸方面發(fā)揮著越來越大的作用。

3.1 中國白酒

大曲作為生產(chǎn)中國白酒的重要糖化劑和發(fā)酵劑，Zheng 等[18，20]采用可培養(yǎng)與不可培養(yǎng)相結(jié)合的技術(shù)方法對清香型白酒發(fā)酵劑大曲的微生物多樣性進(jìn)行了研究，明確了P.kudriavzevii是汾酒大曲中常見的酵母菌。隨后Li 等[19]研究發(fā)酵劑生產(chǎn)過程中微生物的群落結(jié)構(gòu)和組成，同樣證實(shí)了P.kudriavzevii是清香型白酒大曲中重要的真菌組成，存在于大曲的整個發(fā)酵過程，并且對大曲質(zhì)量的好壞有著至關(guān)重要的作用，甚至?xí)η逑阈桶拙频娘L(fēng)味產(chǎn)生重大影響。與此同時，研究表明，在醬香型和濃香型白酒的釀造過程中同樣存在大量的P.kudriavzevii，說明了該酵母廣泛參與了中國白酒的發(fā)酵過程[21-23]。

Wu 等[24]對清香型白酒的重要微量風(fēng)味成分萜烯化合物進(jìn)行解析，該結(jié)果表明，萜烯化合物是谷物和原料在清香型白酒發(fā)酵過程中經(jīng)S.cerevisiae、P.kudriavzevii和W.anomalus3 種酵母的作用而形成。此外，Deng 等[25]研究表明，P.kudriavzevii具有較強(qiáng)的耐酸作用及降解乳酸的能力，在高乳酸脅迫下，與單一培養(yǎng)的P.kudriavzevii或S.cerevisiae相比，共培養(yǎng)能顯著提高了乳酸消耗，恢復(fù)S.cerevisiae的乙醇代謝能力。

綜上所述，P.kudriavzevii廣泛存在于中國白酒的釀造過程，它不僅參與調(diào)節(jié)釀造微生物的菌群功能；同時，其與釀酒酵母所產(chǎn)的風(fēng)味物質(zhì)很相似，但風(fēng)味物質(zhì)之間的相對比例卻是不同的，最終風(fēng)味輪廓的差異為開發(fā)具有獨(dú)特風(fēng)格的白酒提供了更多可能性。

3.2 葡萄酒

近些年，由于全球變暖引發(fā)了葡萄成熟過程中酚類成熟度和糖含量之間的時間差，如果葡萄在其酚類成熟度適宜時收獲，它們的糖含量會更高，從而導(dǎo)致葡萄酒的乙醇濃度增加[26]。根據(jù)消費(fèi)者的新需求，這種較高的乙醇含量是不符合需要的，因?yàn)橛绊戯L(fēng)味復(fù)雜性感知[27]，并且其過量消耗對健康和道路安全有害。使用非釀酒酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵，能夠降低酒精度，同時提高風(fēng)味和口感。使用P.kudriavzevii發(fā)酵葡萄酒，令人愉快的“水果香”就明顯高于使用釀酒酵母發(fā)酵的葡萄酒；多種風(fēng)味物質(zhì)濃度超過了釀酒酵母發(fā)酵的葡萄酒，包括丙酸乙酯、辛酸乙酯、己酸乙酯、正戊醇和苯乙醇等，而這些揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)濃度與水果香呈正相關(guān)[11]。研究表明，Ehrlich 途徑或負(fù)責(zé)酯合成的特定酶（釀酒酵母中的Atf1p，Atf2p）也存在于非釀酒酵母中，其中Ehrlich 途徑的酶（如Aro10p）具有廣泛的底物特異性，導(dǎo)致形成多種雜醇，即使只有一種氨基酸作為的氮源[28]。

乙酸和甘油是P.kudriavzevii己糖發(fā)酵最重要的副產(chǎn)物，其中甘油具有一點(diǎn)的甜味和黏度，當(dāng)葡萄酒中甘油濃度接近5.2 g/L時，它會使葡萄酒具有圓潤的特性，同時還可以平衡酸感，增加口感的復(fù)雜性。此外，使用P.kudriavzevii發(fā)酵葡萄酒能夠降低有機(jī)酸的含量，降低酸度，提高揮發(fā)性酸含量。

3.3 生物乙醇

生物質(zhì)的水解產(chǎn)物非常復(fù)雜，纖維素大部分水解成葡萄糖，半纖維素被分解成不同的己糖以及戊糖，例如葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖和L-阿拉伯糖等；由于水解過程是在高溫和高壓下，部分己糖和戊糖脫水后被降解為羥甲基糠醛（HMF）和糠醛等。這些副產(chǎn)物對酵母細(xì)胞具有毒性，HMF 和糠醛即使在低濃度下也對RNA、DNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜具有破壞作用。去除這些副產(chǎn)物的成本非常高，因此，篩選對這些副產(chǎn)物具有耐受性的酵母菌株對提高生物乙醇發(fā)酵效益更切合實(shí)際。

雖然到目前為止，關(guān)于非產(chǎn)酒酵母對糠醛等副產(chǎn)物耐受性的分子基礎(chǔ)報道很少，但很多研究已將P.kudriavzevii用于高溫發(fā)酵生物乙醇。Kwon 等[29]的研究表明，P.kudriavzevii能在5 g/L 糠醛下生長而完全不受抑制，在7 g/L 時才被完全抑制；某些菌株對HMF 耐受限度可以超過7 g/L；同時，P.kudriavzevii還能耐受其他幾種水解副產(chǎn)物的抑制，例如可耐受高達(dá)8～10 g/L的乙酸，2 g/L的甲酸和1.8～2 g/L的香草醛。此外，P.kudriavzevii還能耐受其他幾種生產(chǎn)生物乙醇時的環(huán)境脅迫因子。例如，P.kudriavzevii能在高溫條件下發(fā)酵，在高于35 ℃時發(fā)酵效率比釀酒酵母高，甚至可以在高達(dá)45℃的條件下發(fā)酵[30]；并且可以耐受高達(dá)12%～15%（v/v）的乙醇、5%～10%（w/v）的NaCl 和40%～48%（w/v）的葡萄糖[31]，還可以在極低的pH 值條件下生長（低至pH2）[32]。

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，在10%乙醇脅迫下P.kudriavzevii的500多個基因的表達(dá)發(fā)生了變化，包括海藻糖和麥角甾醇生物合成途徑的修飾，以及與應(yīng)激相關(guān)的各種基因的激活。例如熱休克蛋白、伴侶蛋白、泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的大量表達(dá)，這些都與錯誤折疊蛋白的重新折疊和降解相關(guān)；此外，乙醇脅迫似乎誘導(dǎo)了營養(yǎng)饑餓效應(yīng)，這與細(xì)胞攝取營養(yǎng)，假菌絲生長和孢子形成的變化有關(guān)。

4 展望

在過去的幾十年中，非釀酒酵母在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用潛力受到越來越多的關(guān)注，本文綜述了P.kudriavzevii的基因和表型特征信息，以及工業(yè)中的一些應(yīng)用。雖然P.kudriavzevii與釀酒酵母酵母相比，較低的生長速度阻礙了其在短批次發(fā)酵中的競爭力，但是它們在特定情況下具有特別應(yīng)用的潛力，特別是在高溫與低pH 值和高乙醇因素相結(jié)合的情況下[10]。盡管如此，P.kudriavzevii對這些脅迫條件的耐受性分子機(jī)制仍未得到充分研究，針對性的基因組工具和技術(shù)非常有限，今后還需操控其遺傳信息和代謝途徑來充分發(fā)揮這種多重耐受酵母的潛力。