CircRNA在結(jié)直腸癌中的研究進展

袁晨磊，趙 鑫

（1.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部，江蘇 蘇州 215123；2.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科，江蘇 蘇州 215006）

結(jié)直腸癌是世界范圍內(nèi)常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。2021年發(fā)布的美國癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，目前結(jié)直腸癌發(fā)病率在消化系統(tǒng)癌癥中居于首位，死亡人數(shù)占全部惡性腫瘤死亡人數(shù)的8.7%[1]。在中國，結(jié)直腸癌的發(fā)病率僅次于肺癌和胃癌，位居所有惡性腫瘤的第3位，并且發(fā)病率還在不斷上升[2]。近年來腸鏡檢查的普及以及腹腔鏡手術(shù)的發(fā)展，結(jié)直腸癌的手術(shù)效率、術(shù)后臨床療效和患者預(yù)后都有了顯著的進步[3]。在過去幾十年中，人們對結(jié)直腸癌的發(fā)病機制的認識取得了一些進展，然而有效的治療措施依舊有限[4-5]。但積極的是，包括化療和免疫治療等治療手段的進步，使目前結(jié)直腸癌的5 年生存率可以達到65%[6]。盡管近些年對于結(jié)直腸癌的病因有所闡述，包括不合理的飲食習(xí)慣，沒有進行充足的體育運動，體內(nèi)微生物及其代謝以及社會心理因素等[7-9]，但是影響結(jié)直腸癌發(fā)展具體的分子機制還不明確。因此闡明結(jié)直腸癌發(fā)展的分子機制極為重要。

Circular RNA（circRNA）是一種新發(fā)現(xiàn)的具有共價閉環(huán)結(jié)構(gòu)的非編碼RNA，廣泛存在于人體細胞中[10]。cricRNA由前體mRNA反向拼接轉(zhuǎn)錄，具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、序列保守、組織特異性強的特點。最近的研究表明，circRNA可以作為microRNA的海綿，抑制microRNA的活性，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄以及結(jié)合RNA結(jié)合蛋白等功能[11-12]。作為一種新型的調(diào)控分子，circRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，有望成為一種新型的腫瘤標(biāo)志物和潛在的靶點，為腫瘤診斷和靶向治療提供新的方向[13]。CircRNA在基因調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用，如作為miRNA海綿吸附miRNA，調(diào)控相關(guān)基因以及多肽的表達等[14]。研究表明，CricRNA可以作為一些癌癥的新型治療靶點，如肝細胞癌、非小細胞肺癌，口腔鱗狀細胞癌以及結(jié)直腸癌等[15-17]。在這篇綜述中，總結(jié)了circRNA在結(jié)直腸癌惡性發(fā)展中的機制和作用。

1 CircRNA在結(jié)直腸癌中的角色

已有的研究表明，circRNA在結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮了很大作用[18]。一項研究通過使用Arraystar circRNA微陣列分析，確定了1 817 個在結(jié)腸癌組織中具有明顯不同表達譜的circRNA，其中1 236 個上調(diào)，581 個下調(diào)[19]。CircRNA在結(jié)腸癌中參與調(diào)控細胞增殖、細胞凋亡、腫瘤侵襲性和轉(zhuǎn)移、細胞周期、癌癥干細胞以及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）。這一部分將具體闡述cricRNA在這些細胞過程中的作用并分析circRNA在結(jié)直腸癌中的機制。

1.1 CircRNA調(diào)控細胞增殖 很多研究表明circRNA在結(jié)直腸癌細胞增殖中起到重要作用。Zheng等[20]通過實時熒光定量PCR實驗、CCK8檢測實驗以及細胞克隆形成實驗研究發(fā)現(xiàn)，circPPP1R12A的表達加速了DLD-1、Caco-2、HCT-116和LoVo結(jié)腸癌細胞的增殖。另外，沉默circPPP1R12A也可抑制結(jié)腸癌細胞的增殖能力[20]。與之相似的，通過下調(diào)circRNA-ACAP2的表達，可明顯減弱結(jié)腸癌細胞SW480的增殖性[21]。另一項研究發(fā)現(xiàn)，cricRNA CBL.11作為miR-6778-57的競爭性內(nèi)源RNA調(diào)控結(jié)腸癌細胞的增殖[22]。CircRNA CBL.11在結(jié)腸癌細胞中低表達，釋放miR-6778-57，Li等[22]通過CCK-8試驗顯示，與對照組相比，miR-6778-5p能顯著提高結(jié)直腸癌細胞的活力。相反，miR-6778-5p的抑制劑顯著抑制了結(jié)直腸癌細胞的增殖。此外，EdU結(jié)合試驗顯示，miR-6778-5p模擬物增強了HCT116細胞的增殖，但受到其抑制劑的抑制作用而受損。這些結(jié)果表明，circRNA CBL.11通過調(diào)控miR-6778-5p增強結(jié)直腸癌細胞的增殖性。

Circ_0055625可以通過miR-106b/ITGB8通路調(diào)控結(jié)腸癌細胞的增殖。Circ_0055625的敲除、miR-106b的高表達，以及ITGB的低表達都被證明能夠抑制結(jié)腸癌細胞SW480和HT29的增殖[23]。Circ_0055625在結(jié)腸癌細胞中高表達，并作為miR-106b海綿，ITGB作為miR-106b的靶基因在circ_0055625高表達時數(shù)量增加，調(diào)控結(jié)腸癌細胞的增殖性[23]。相似的另一項研究[24]發(fā)現(xiàn)，circ_000166作為miR-330-5p海綿調(diào)控結(jié)腸癌細胞的增殖能力。Zhao等[24]通過CCK8檢測實驗證實了cric_000166的敲除可以顯著降低結(jié)腸癌細胞HT29和HCT166細胞的增殖能力，另外轉(zhuǎn)染RNA實驗證實了cric_000166通過吸附miR-330-5p使其下游靶基因ELK1表達增加，從而增加了結(jié)腸癌細胞的增殖能力。

綜合以上的研究，證明了circRNA在調(diào)控結(jié)腸癌細胞增殖性方面起到了關(guān)鍵的作用。

1.2 CircRNA調(diào)控細胞凋亡 CircRNA據(jù)報道參與調(diào)控結(jié)腸癌細胞的凋亡。Tu等[25]研究發(fā)現(xiàn)，circ_0001313在結(jié)腸癌細胞中高表達，circ_0001313作為miRNA-510-5p海綿與其競爭性結(jié)合，上調(diào)miRNA-510-5p的靶基因AKT2的表達，轉(zhuǎn)染siRNA AKT2明顯降低了SW480和HCT116細胞中AKT2的表達。有趣的是，AKT2對結(jié)腸癌細胞凋亡的影響與circ-0001313相似，與miR-540-5p有相反的影響。沉默AKT2顯著誘導(dǎo)細胞凋亡，而miR-510-5p敲除則明顯抑制細胞凋亡。更重要的是，miR-510-5p可以逆轉(zhuǎn)circ-0001313對結(jié)腸癌細胞凋亡的調(diào)控，Caspase-9活性的變化趨勢與流式細胞儀得到的結(jié)果相同。以上數(shù)據(jù)意味著，cric_0001313通過circ-0001313/miR-510-5p/AKT2通路調(diào)控細胞凋亡[25]。與其相似的另一項研究發(fā)現(xiàn)，過表達的cric_104916調(diào)控結(jié)腸癌細胞的凋亡，而cric_104916在結(jié)腸癌細胞中低表達，抑制細胞凋亡通路，從而調(diào)控結(jié)腸癌的進展[26]。

1.3 CircRNA調(diào)控腫瘤侵襲性和轉(zhuǎn)移 CricRNA已被證明在調(diào)控結(jié)腸癌細胞的侵襲性和轉(zhuǎn)移方面具有關(guān)鍵作用。一項研究[28]表明，circPTK2（circ_0005273）促進結(jié)直腸癌細胞的侵襲性和轉(zhuǎn)移，circPTK2的敲除抑制了腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移能力。Yang等[27]通過結(jié)腸癌肝肺轉(zhuǎn)移實驗，采用表達熒光素的SW620結(jié)腸腫瘤細胞系，在雌性裸鼠中正交生成腫瘤，結(jié)果顯示，cricPTK2敲除可分別明顯鈍化脾內(nèi)注射后的自發(fā)肝轉(zhuǎn)移或尾靜脈注射后的肺轉(zhuǎn)移。Fang等[28]的研究發(fā)現(xiàn)circRNA_100290在結(jié)腸癌中通過形成circ_100290/miR-516b/FDZ4/Wnt/β-catenin通路調(diào)控結(jié)腸癌細胞的侵襲性。Cric_100290在結(jié)腸癌細胞中高表達，circ_100290為miR-516b的海綿，miR-516b靶向FZD4，cric_100290通過抑制miR-516b促進FDZ4的表達，從而激活Wnt/β-catenin通路，增加結(jié)腸癌細胞的侵襲性[28]。

He等[21]為了確定circRNA-ACAP2、Tiam1和miR-21-5p表達對SW480細胞入侵的影響，用表達sh-circRNA-ACAP2、sh-Tiam1或miR-21-5p的慢病毒載體轉(zhuǎn)染SW480細胞，進行劃痕實驗和Transwell實驗，發(fā)現(xiàn)下調(diào)circRNA-ACAP2和Tiam1的表達以及上調(diào)miR-21-5p的表達后，結(jié)腸癌SW480細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲性被顯著抑制，證明circRNA-ACAP2/hsa-miR-21-5p/Tiam1反饋回路在結(jié)腸癌細胞的侵襲性和轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用。另一個相似的研究[18]表明circ_0071589調(diào)控結(jié)直腸癌細胞的侵襲性和轉(zhuǎn)移。Wang等[18]通過Transwell實驗和劃痕實驗證明circ_0071589的沉默能顯著降低結(jié)腸癌HCT116細胞的侵襲性和轉(zhuǎn)移能力。

1.4 CircRNA調(diào)控細胞周期 CircRNA已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控結(jié)腸癌細胞的細胞周期。Circ_104916可以通過激活細胞周期蛋白調(diào)控結(jié)腸癌細胞周期G2/M期阻滯，從而阻止結(jié)腸癌細胞增殖[26]。

另一項研究中，Wang等[29]通過功能獲得實驗證明，circ_0014717的過表達可以顯著抑制結(jié)直腸癌細胞增殖和菌落形成，并在體外誘導(dǎo)細胞周期G0/G1期停滯，在體內(nèi)抑制異種移植瘤生長。此外，circ_0014717還可以上調(diào)細胞周期抑制蛋白p16的表達。

Li等[30]的研究數(shù)據(jù)表明，結(jié)直腸癌細胞周期在circRNA_102209的敲除下，明顯從S期和G2/M期向G0/G1期轉(zhuǎn)移，G0/G1期的細胞比例明顯升高，而S期的細胞比例明顯下降。此外，流式細胞儀的結(jié)果表明，敲除hsa_circRNA_102209會增加結(jié)直腸癌細胞的凋亡率，而Bax、Cas-9和MMP9等凋亡相關(guān)分子的上調(diào)也進一步證實了這一點。這些數(shù)據(jù)揭示了circRNA_102209敲除可能會使細胞周期在G0/G1期停止，從而促進結(jié)直腸癌細胞的凋亡[30]。

1.5 CircRNA調(diào)控癌癥干細胞 越來越多的證據(jù)揭示了癌癥干細胞的存在及其在賦予治療抵抗力方面的作用。癌癥干細胞是癌細胞的一小部分，它使腫瘤異質(zhì)性得以實現(xiàn)，并啟動腫瘤的形成[31]。在新出現(xiàn)的證據(jù)中，腫瘤干細胞對腫瘤侵襲性、轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)起到關(guān)鍵作用，circRNAs已經(jīng)被驗證參與了結(jié)直腸癌等人類癌癥中腫瘤干細胞的形成和維持。Zhan等[32]研究發(fā)現(xiàn)，circCTIC1敲除后損害了結(jié)腸腫瘤起始細胞（tumor-initiating cells, TICs）的自我更新，而其過度表達則起到相反的作用。circCTIC1與核重塑因子（NURF）復(fù)合物相互作用，將NURF復(fù)合物招募到c-Myc啟動子上，最終驅(qū)動c-Myc的轉(zhuǎn)錄啟動[32]。

1.6 CircRNA調(diào)控EMT過程 EMT是上皮細胞轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細胞，使其具有遷移和轉(zhuǎn)移能力的細胞過程。CricRNA被證實在結(jié)直腸癌細胞EMT過程中發(fā)揮重要作用。Li等[30]為了研究hsa_circRNA_102209基因敲除對結(jié)直腸癌細胞EMT的影響，考察了E-cad、vimentin和snail等相關(guān)標(biāo)志物的表達水平。轉(zhuǎn)染si-hsa_circRNA_102209后，上述分子的蛋白和mRNA水平均受到影響。由此得出敲除hsa_circRNA_102209可導(dǎo)致結(jié)直腸癌細胞EMT的下調(diào)。

Zhou等[33]通過生物信息學(xué)和雙熒光素酶報告實驗證實，circRNA_100859作為miR-217海綿，miR-217直接靶向缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α），circRNA_100859的高表達釋放HIF-1α。而HIF-1α可通過激活PI3K/PKB/GSK-3β/Snail1信號通路促進結(jié)腸癌HCT116細胞EMT[34]。

2 CricRNA在結(jié)直腸癌中的臨床作用

CricRNA在最新的研究中被證實可以作為結(jié)直腸癌診斷，治療以及預(yù)后的生物標(biāo)志物。

血漿circRNA面板可作為結(jié)直腸癌的新型診斷生物標(biāo)志物，Lin等[35]研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組（n＝61）相比，結(jié)直腸癌患者（n＝45）血漿中3種circRNA（circ-CCDC66、circ-ABCC1和circ-STIL）的水平明顯下降。ROC曲線分析顯示，三種circRNA面板的ROC曲線下面積（AUC）為0.780，高于傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物，如癌胚抗原（CEA）和碳水化合物抗原19-9（CA19-9）。將circRNA面板與CEA和CA19-9相結(jié)合，可能會提高診斷結(jié)直腸癌的能力（AUC＝0.855）。此外，血漿circ-ABCC1水平與腫瘤生長和進展有關(guān)，結(jié)直腸癌的前驅(qū)病變，包括結(jié)腸腺瘤和腺瘤性息肉，血漿circ-CCDC66和circ-ABCC1水平下降。更重要的是，circ-CCDC66和circ-STIL對早期結(jié)直腸癌的診斷有幫助，三circRNA面板提高了對CEA陰性和CA19-9陰性結(jié)直腸癌的診斷能力。

在Ruan[36]的研究中，對腫瘤和鄰近正常組織中的437 個結(jié)腸癌circRNA進行了檢測，發(fā)現(xiàn)與非復(fù)發(fā)的結(jié)腸癌患者相比，103 個circRNAs在復(fù)發(fā)的結(jié)腸癌患者中表達有差異。其中，在Ⅱ/Ⅲ期結(jié)腸癌患者中驗證了100 個上調(diào)的circRNAs，以測試它們是否可以作為預(yù)后生物標(biāo)志物。在驗證隊列中，包括hsa_circ_0122319、hsa_circ_0087391、hsa_circ_0079480和hsa_circ_0008039在內(nèi)的4 個circRNA對無病生存期（DFS）有較強的預(yù)測價值。由此發(fā)現(xiàn)了一個基于4-circRNA的表達特征，對Ⅱ/Ⅲ期結(jié)腸癌的癌癥復(fù)發(fā)具有高度的預(yù)測性，具有識別高危早期結(jié)腸癌個體的潛力，這些個體將從輔助化療中獲益最大。

3 結(jié)語

綜上所述，circRNAs在結(jié)腸癌的發(fā)生和進展中起著至關(guān)重要的作用。靶向circRNAs可能有助于提升結(jié)直腸癌患者的治療效果[13]。然而，對于cricRNAs的研究，目前也存在以下幾個方面的不足。首先circRNAs在結(jié)直腸癌發(fā)展中的作用機制非常復(fù)雜，可能是由于不同亞型在結(jié)直腸癌進展中的作用機制存在差異性，許多結(jié)直腸癌相關(guān)的circRNA的作用機制尚未報道，因此需要逐一報道。另外，circRNAs在臨床當(dāng)中是否足以作為生物標(biāo)志物用于治療需要驗證，目前將circRNAs作為靶向藥物在臨床上使用還未報道，circRNAs與常規(guī)的生物標(biāo)志物相比是否具有優(yōu)勢需要確定。但是我們樂觀地認為，新的和強大的測序技術(shù)的使用將闡明在結(jié)腸腫瘤的發(fā)生中參與的circRNAs的作用，可能促進circRNAs的臨床應(yīng)用，用于診斷、治療和預(yù)后評估。