植物灰霉病生物防治研究進(jìn)展

張 莉， 張博源，黃繼紅，李琰歌，楊艷君

(1.河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州450001； 2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450046； 3.周口市農(nóng)業(yè)干部學(xué)校，河南 周口466000)

灰霉病由灰葡萄孢菌(BotrytiscinereaPers.)引起，可發(fā)生于多種植物，包括番茄、草莓、葡萄等重要經(jīng)濟(jì)作物，是一種世界性的病害[1]。灰霉病可使植物多個(gè)器官發(fā)病，發(fā)病部位會(huì)產(chǎn)生灰白色或灰褐色霉層。農(nóng)作物貯藏和運(yùn)輸過程中，在低溫、高濕的環(huán)境下，迅速增殖的灰葡萄孢菌會(huì)引起病害大范圍發(fā)生[2]，同時(shí)灰葡萄孢菌加快消耗貯藏物的營養(yǎng)物質(zhì)，致使貯藏物儲(chǔ)存期變短，品質(zhì)下降，帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，主要通過植物葉面噴灑化學(xué)藥劑防控灰霉病，此方法雖可高效抑制病害，但灰葡萄孢菌變異頻繁[3]的特性，易使灰葡萄孢菌產(chǎn)生高抗藥性，防治效果逐漸減弱。使用化學(xué)防治手段不僅成本高，且殘存在環(huán)境中的化學(xué)藥劑可能會(huì)危害人畜健康。

生物防治技術(shù)，即利用生物與生物之間的相互作用來控制有害生物種群密度的方法，對生態(tài)穩(wěn)態(tài)影響較小，不易產(chǎn)生環(huán)境污染，是一種重要的綠色防控手段，具有廣闊的發(fā)展前景[4]。本文對拮抗灰葡萄孢菌微生物及其作用機(jī)理進(jìn)行綜述，以期為灰葡萄孢菌的防治研究提供理論依據(jù)。

1 灰葡萄孢菌

1.1 灰葡萄孢菌特征及發(fā)病規(guī)律

分類學(xué)上，葡萄孢霉屬(Botrytis)歸半知菌亞門(Deuteromycotina)絲孢目(Hyphomycetales)?；移咸焰呔?BotrytiscinereaPers.)是富氏葡萄孢盤菌(Botryotiniafuckeliana)的無性世代，是常見的腐敗菌。灰葡萄孢菌的菌落呈絮狀，顏色為灰白色或淡褐色，菌絲?？尚纬赏庑尾灰?guī)則的黑色堅(jiān)硬菌核。分生孢子梗細(xì)長而直立，頂端呈樹枝狀分枝，在短的小梗上簇生分生孢子，外觀像一串葡萄，分生孢子無色或灰色，橢圓形，光滑透明。

灰葡萄孢菌在土壤中形成由殼和葡聚糖包裹菌絲構(gòu)成黑色菌核以度過嚴(yán)冬，初春時(shí)期成為主要侵染源。菌核的抗逆能力較強(qiáng)，能在各種環(huán)境中持久廣泛存在。當(dāng)環(huán)境溫度適宜時(shí)(3 ℃～27 ℃)，菌核開始生長，萌生的菌絲會(huì)大量生長，分生孢子會(huì)通過大氣流動(dòng)或人類活動(dòng)進(jìn)行傳播?？諝庀鄬穸冗_(dá)90%以上的高濕環(huán)境更容易暴發(fā)病害?；颐共≈饕l(fā)生在初春和初秋時(shí)期，病菌主要從自然孔口處(氣孔)或傷口處入侵，沿植物組織進(jìn)行水平擴(kuò)散，發(fā)病部位呈灰白色水漬狀軟腐，并附著大量灰色霉菌[5-6]。

1.2 灰葡萄孢菌侵染方式

葡萄孢屬真菌寄主范圍廣泛，目前已知有1400多個(gè)寄主，其中大多數(shù)為雙子葉植物[7]?；移咸焰呔芤跃z、分生孢子及菌核的形式侵染寄主，侵染過程和機(jī)理十分復(fù)雜[8]。常在宿主植物發(fā)育早期階段侵染，之后進(jìn)入長時(shí)間的潛伏期，直到宿主機(jī)體內(nèi)部發(fā)生有利于其生長繁殖的理化變化，病原菌會(huì)迅速破壞成熟或衰老組織，而嚴(yán)重引發(fā)宿主軟腐發(fā)生腐爛變質(zhì)?；移咸焰呔a(chǎn)生有利于其侵染的多種代謝產(chǎn)物，比如毒素、細(xì)胞壁降解酶、脫落酸、蛋白酶、果膠酶等，這些物質(zhì)可以造成被侵染植物的葉子變色、特定細(xì)胞崩潰，加速侵染進(jìn)程[9]。在灰霉菌的多種侵染模式中，從灰葡萄孢菌中分離鑒定出的二環(huán)倍半萜烯毒素Botrydial毒性最高，對其宿主具有致死性[10]。這種物質(zhì)是灰霉病對植株進(jìn)行侵染的關(guān)鍵物質(zhì)，可引發(fā)草莓等雙子葉植物的軟腐和組織細(xì)胞破裂，其余毒素類型多為其前體或衍生物[11]。目前，合成Botrydial的基因簇及其編碼的蛋白序列已被檢測出，其中BcBOT2基因負(fù)責(zé)編碼倍半萜合酶，這種酶是Botrydial合成途徑中的關(guān)鍵酶。研究發(fā)現(xiàn)敲除灰葡萄孢霉的BcBOT2基因，可使葡萄孢菌失去合成Botrydial和相關(guān)化合物的能力，灰葡萄孢菌的侵染能力大幅下降[12]。培養(yǎng)灰葡萄孢菌后的過濾液中含有活性成分，氯仿提取后經(jīng)層析分離獲得6種組分，表明灰葡萄孢菌毒素是一類可穩(wěn)定存在的物質(zhì)[13]。目前所檢測的灰葡萄孢菌株都可分泌毒素，可導(dǎo)致與真菌感染相似的壞死傷口，但其侵染機(jī)理尚不清楚[14]。

2 灰葡萄孢菌的生物防治

2.1 生防微生物

2.1.1 拮抗真菌

灰葡萄孢菌拮抗菌的主要菌群體為真菌，其中主要為酵母菌屬和木霉屬。從Newhook較早使用真菌芽枝霉(Cladosporium)防治灰霉菌至今，目前可用來防治灰霉病的拮抗真菌多達(dá)20多種。近年來應(yīng)用于生物防治灰霉病的真菌主要是酵母菌屬和木霉屬。酵母菌作為防治灰葡萄孢菌中一類重要的真菌，主要應(yīng)用于作物采摘后灰葡萄孢菌的防治。目前報(bào)道的有羅倫隱球酵母(Cryptococcuslaurentii)、假絲酵母菌(Candidasaitoana)、季也蒙畢赤酵母(Pichiaguilliermondii)、檸檬形克勒克酵母菌(Kloeckeraapiculata)、卡利比克畢赤酵母(P.caribbica)、異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)等[15-20]可有效防控灰霉病。

木霉菌是另一類重要的灰葡萄孢菌拮抗真菌，經(jīng)張富榮[21]、Tronsmo[22]、趙蕾[23]等人研究發(fā)現(xiàn)木霉屬中的多種木霉菌如：哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、鉤狀木霉(T.hamatum)、擬康氏木霉(T.pseudoningi)以及綠色木霉(T.viride)等[24]，在對灰葡萄孢菌表現(xiàn)出良好拮抗作用的同時(shí)，對灰葡萄孢菌具有顯著的防治效果。除了酵母菌屬和木霉菌屬之外，對灰葡萄孢菌有拮抗作用的還有其它真菌如：棘殼孢菌(pyrenochaetanobilis)、金龜子綠僵菌(Metarh-iziumanisopliae)等[25]。

2.1.2 拮抗細(xì)菌

生物防治灰霉病過程中，對細(xì)菌的使用也較為廣泛。目前，應(yīng)用在防治植物灰霉病中的拮抗細(xì)菌主要包括芽孢桿菌(Bacillusspp.)、假單胞菌(Pseudomonasspp.)和格氏沙雷菌(Serratiaspp.)等。拮抗細(xì)菌通過抑制灰葡萄孢菌果膠酶的活性、產(chǎn)生抗生素或?qū)移咸焰呔a(chǎn)生營養(yǎng)競爭從而抑制其生長繁殖[26]。

童蘊(yùn)慧等[27]對樣本分離純化獲得對番茄灰葡萄孢菌有最強(qiáng)抑制作用的芽孢桿菌Y2-11-1菌株，對番茄葉片、果實(shí)灰霉病防治效果分別達(dá)68.7%和75.0%。李華[28]篩選出的地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis) BY-3菌株，對灰葡萄孢菌具有很好的拮抗效果。陸繼臣等[29]從土壤中篩選出的格氏沙雷菌(Serratiagrimesii) CNY-04菌株，其發(fā)酵液和菌體懸液對灰霉病菌分生孢子的萌發(fā)有較強(qiáng)的抑制作用，抑制率均達(dá)到95%以上。申順善等[30]從茶樹根系分離篩選得到的綠針假單胞菌HL5-4菌株能顯著抑制灰葡萄孢菌的菌絲生長和分生孢子萌發(fā)；在離體試驗(yàn)中，HL5-4菌株對番茄果實(shí)和葉片灰霉病的防治效果較好。羅琳等[31]從新疆哈密瓜、蟠桃及紅棗中分離得到的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，在植物葉片離體試驗(yàn)中表現(xiàn)出對灰葡萄孢菌良好的防治效果。張立新等[32]從櫻桃中分離得到內(nèi)生細(xì)菌特基拉芽孢桿菌(Bacillustequilensis)TY-6菌株對灰霉病菌具有良好抑菌活性，離體和活體抑菌效果分別為89.08%和79.18%。高振峰等[33]從番茄內(nèi)生菌中篩選出的一株貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)，對番茄灰霉病具有良好防治效果。

2.1.3 拮抗放線菌

放線菌作為一種在自然界中具有豐富資源的微生物類群,在植物病害生物防治中有良好開發(fā)應(yīng)用前景。當(dāng)前應(yīng)用于拮抗微生物的放線菌主要是鏈霉菌屬，其中半數(shù)以上的鏈霉菌都能產(chǎn)生抗生素。邵勝楠等[34]篩選分離得到的放線菌KN37菌株代謝物可強(qiáng)烈抑制番茄灰霉病菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)，且對葡萄灰霉病具有較好的防治效果。趙娟等[35]從土壤中分離篩選的具有產(chǎn)生纖維素酶和幾丁質(zhì)酶能力的鏈霉菌T22菌株對番茄灰霉病菌具有強(qiáng)抑制作用。其它的拮抗放線菌還有暗色鏈霉菌(Streptomycesxanthophaeus)、白黑鏈霉菌(Streptomycesalboniger) 等[36-37]。

2.2 植物源殺菌劑

植物是天然生物農(nóng)藥的寶庫，在植物中尋找新的殺菌、抑菌活性物質(zhì)，研制開發(fā)新的植物源殺菌劑，具有生物活性高、環(huán)保無殘留等優(yōu)點(diǎn)，是目前生物防治的熱點(diǎn)之一。從植物中篩選提取出具有抵御病原侵染的抗菌活性成分，包括酚類及酚類糖苷、不飽和內(nèi)酯、硫磺物質(zhì)、皂角苷、生氰糖苷和芥子油苷等多種低分子量的次級(jí)代謝產(chǎn)物。

何培青[38]提取植物葉片釋放的揮發(fā)性物質(zhì)對灰葡萄孢菌孢子的萌發(fā)具有較好的抑制效果，發(fā)現(xiàn)抑制灰葡萄孢菌的效率從高到底依次為脂肪酸衍生物、芳香族化合物、萜類化合物。吉沐祥等[39]在田間的實(shí)驗(yàn)表明乙蒜丁子香酚可濕性粉劑和暗羅丁子香酚可濕性粉劑兩種復(fù)配植物源農(nóng)藥均對草莓灰霉病有較好的防治效果。用物質(zhì)量濃度為30 mg /mL的蒼耳丙酮提取物對番茄灰霉病菌實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其對灰霉菌絲生長的抑制率可達(dá)78.1 %，對分生孢子的形成和萌發(fā)具有較高抑制率[40]。朱虹等[41]對11種植物丙酮提取物的抑菌活性進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)在提取物濃度為100 g/L時(shí)，石蒜對辣椒灰霉菌絲生長和孢子萌發(fā)的抑制率最高。徐文雅等[42]發(fā)現(xiàn)傘形科植物提取物傘形花內(nèi)酯可顯著抑制灰霉菌孢子的萌發(fā)和生長，同時(shí)能夠抑制灰霉菌斑塊的擴(kuò)散。

3 生防機(jī)制

3.1 拮抗作用

微生物通過拮抗作用阻抑病原菌的生長、繁殖和侵染過程，產(chǎn)生的代謝物主要有抗生素等小分子物質(zhì)和細(xì)胞壁降解酶等大分子物質(zhì)。木霉菌利用細(xì)胞壁降解酶能夠引起灰葡萄孢菌細(xì)胞壁的降解和菌絲瓦解，使細(xì)胞內(nèi)部環(huán)境暴露，導(dǎo)致其內(nèi)部生理活動(dòng)發(fā)生紊亂，達(dá)到控制灰葡萄孢菌的目的[43]。對拮抗酵母菌進(jìn)行的抑菌活性研究發(fā)現(xiàn)，揮發(fā)性成分和可擴(kuò)散代謝物對草莓灰霉病具有防治作用[44-45]。對有拮抗活性的放線菌顯微觀察顯示，該菌可引起草莓灰霉菌菌絲扭曲、畸形、斷裂，甚至解離，而產(chǎn)生抑制作用[46]。枯草芽胞桿菌、假單胞菌等拮抗細(xì)菌可以產(chǎn)生抗生素、分泌抗菌蛋白或裂解酶來抑制植物病原真菌的生長繁殖[47]。有研究從類芽孢桿菌(Paenibacilluselgii)中分離出一種兒茶酸，對防治草莓灰霉病具有較好的效果[48]。采用GC-MS聯(lián)用儀對灰霉菌拮抗細(xì)菌活性物進(jìn)行初步分析，活性成分主要是脂肪類、酮類、酯類、醇類、酚類、酸類、肽類等物質(zhì)[49]。在病原體與其拮抗劑不直接接觸的情況下，生物抑菌物質(zhì)中揮發(fā)性有機(jī)化合物(VOCs)，如醇類、酮類等物質(zhì)可在生物控制病原菌中發(fā)揮作用[50]。

3.2 競爭和重寄生作用

競爭作用是拮抗微生物與病原菌競爭營養(yǎng)物質(zhì)或生存空間，從而遏制病原菌的生長繁殖。木霉菌通過競爭作用，可以快速奪取侵染部位附近的營養(yǎng)物質(zhì)，致使病菌停止生長和侵染從而殺滅病原菌[51]。對灰霉病拮抗菌株出芽短梗霉(Aureobasidiumpulluians)的研究表明，該菌株的抑菌機(jī)制可能是活菌之間的競爭作用[52]。

重寄生作用是指拮抗微生物為了獲取營養(yǎng)維持自身的生長需要，通過捕食或者寄生手段抑制病原真菌的生長繁殖，達(dá)到生物防治植物真菌病害的效果。Paul[53]研究發(fā)現(xiàn)一種腐霉對灰霉病菌具有重寄生作用，通過吸收病原菌菌絲內(nèi)的營養(yǎng)導(dǎo)致病原菌死亡，從而抑制病癥的發(fā)生。

3.3 誘導(dǎo)抗性和促生長作用

誘導(dǎo)抗性是指拮抗微生物誘導(dǎo)寄主自身產(chǎn)生抗病性并作出相關(guān)防御響應(yīng)的生理活動(dòng)。由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生，可引發(fā)誘導(dǎo)物的通訊信號(hào)分子N-?；呓z氨酸內(nèi)酯(N-acyl-homoserine lactones，AHLs)[54]，能迅速誘導(dǎo)植物宿主產(chǎn)生強(qiáng)抵抗能力，抵御環(huán)境的脅迫，植物通過接收AHLs信號(hào)分子，感知環(huán)境中細(xì)菌的存在，主動(dòng)做出相關(guān)響應(yīng)，調(diào)控其生長發(fā)育和抗病抗逆反應(yīng)。

促生長作用是拮抗微生物不僅對病原菌具有防治作用，同時(shí)增加寄主植物種子的萌發(fā)、促進(jìn)根和苗的生長以及植株的活力。曲薇等[55]以哈茨木霉WY-1菌株為研究對象發(fā)現(xiàn)其對番茄植株有較好的促生長作用且對灰霉病具有較好的防治效果。

4 生物防治優(yōu)缺點(diǎn)

生物防治的突出優(yōu)勢是符合當(dāng)前綠色、環(huán)保、可持續(xù)的農(nóng)業(yè)發(fā)展理念。拮抗微生物表現(xiàn)出高度專一性的同時(shí)，對食物鏈的負(fù)面影響小，且不會(huì)破壞生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)平衡。

但在自然界中，動(dòng)植物、微生物和環(huán)境之間的關(guān)系是極其復(fù)雜的，不能簡單地將其定義為靜態(tài)關(guān)系。生防微生物在投入應(yīng)用過程中必然或多或少地受到外界生態(tài)環(huán)境宏觀和微觀條件的影響?，F(xiàn)行的生防制品大多屬于周期性產(chǎn)品，長時(shí)間儲(chǔ)存會(huì)面臨活性成分降低、成本費(fèi)用增加等問題。一些病原菌在生防制品環(huán)境中會(huì)以相對穩(wěn)定的形式存在，加之生防制品在外界環(huán)境中存活時(shí)間短，難以有效充分殺滅病害。

對所有的生防制品，人們最為關(guān)注的是其安全性。一方面，生物防治微生物產(chǎn)生具有抑制病菌的物質(zhì)如抗生素，會(huì)隨著日常食用蔬果進(jìn)入人體，長此以往會(huì)否影響人類身體健康？另一方面，人們食用這些帶有抑菌物質(zhì)的食物，是否會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的抗藥性，與治療疾病的藥品是否會(huì)產(chǎn)生沖突等，都值得我們進(jìn)一步研究。

5 展望

生物防治與化學(xué)防治相比具有不污染環(huán)境、對人畜安全、不會(huì)引起病害產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前防治病害的熱點(diǎn)領(lǐng)域。生物防治作為21世紀(jì)綠色保護(hù)的主題之一，拮抗微生物的利用在生物防治中占有重要的位置。隨著對生防微生物在植物之間、分泌物之間以及各種環(huán)境因子之間的相互作用和變化規(guī)律的深入研究和技術(shù)完善，將更好地調(diào)節(jié)無機(jī)與有機(jī)環(huán)境之間的關(guān)系，發(fā)揮生防微生物的防治功能。雖然拮抗菌生產(chǎn)過程中的一些問題，妨礙了拮抗菌制品投入市場的進(jìn)度，但其作用效率高、適用面廣泛、良性協(xié)調(diào)人畜和生態(tài)之間的關(guān)系等優(yōu)點(diǎn)，必將使其在灰霉病的防治中發(fā)展更加重要的作用。