豬流行性腹瀉病毒新型檢測方法研究進(jìn)展

李天芝，于新友，霍 芳，李 峰

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea,PEDV）屬冠狀病毒科冠狀病毒屬[1]，病毒粒子呈球形，有囊膜，表面有纖突，大小約95～190 nm。PEDV的唯一宿主是豬，可引起豬急性腸道傳染病豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea viruse, PED），豬不分品種和日齡均可感染發(fā)病，臨床表現(xiàn)為嘔吐、水樣腹瀉、脫水[2]。該病發(fā)病急，傳播速度快，哺乳仔豬發(fā)病后死亡率高，7日齡內(nèi)仔豬死亡率可達(dá)100%。現(xiàn)有商品化疫苗雖能減輕臨床癥狀，但不能阻止病毒感染，已發(fā)病豬場短時間內(nèi)可反復(fù)發(fā)病。PED于1971年首次暴發(fā)于英格蘭，目前在世界主要養(yǎng)豬國家均有發(fā)病和流行，是危害豬業(yè)的一種重要疾病。我國于1976年首次報道豬流行性腹瀉病例的存在，通常呈散發(fā)流行，危害相對較輕，自2010年開始PED在我國大規(guī)模暴發(fā)[3]，PEDV持續(xù)不斷的變異，由G1型毒株轉(zhuǎn)變?yōu)橐訥2型毒株流行為主，病毒致病力增強(qiáng)，至今一直未得到有效控制[4]。

引起豬腹瀉的因素眾多，有細(xì)菌性腹瀉、病毒性腹瀉、寄生蟲性腹瀉，以及飼養(yǎng)管理不善導(dǎo)致的腹瀉。豬腹瀉后快速查找病因，并采取相應(yīng)的措施，是進(jìn)行有效防控的前提和基礎(chǔ)。豬流行性腹瀉在豬場發(fā)病率高，造成的損失嚴(yán)重，且與豬傳染性胃腸炎、輪狀病毒病等在臨床表現(xiàn)和病理變化上很難區(qū)分，早期檢測確診后，采取相應(yīng)措施可有效減少豬場損失。確診方法為采用針對病原的快速檢測法，傳統(tǒng)的病原分離法不能滿足疾病快速確診的需求。隨著技術(shù)的發(fā)展和科技的進(jìn)步，針對PEDV病原的新型檢測方法不斷出現(xiàn)，文章綜述了針對PEDV新型檢測方法研究進(jìn)展，以期為該病的診斷和防控提供參考。

1 常規(guī)RT-PCR法

RT-PCR法是以病毒的RNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)來檢測病毒核酸的方法，其特異性好，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種動物疾病診斷中。王若木等[5]基于PEDV的S基因和E基因序列，分別設(shè)計了PEDV的分型和鑒別引物，經(jīng)過反應(yīng)條件優(yōu)化，成功建立了鑒別PEDV G1/G2型感染的雙重RT-PCR方法；其中，PEDV G1型感染可擴(kuò)增得到1條249 bp的目的片段，G2型感染擴(kuò)增得到2條目的片段（840 bp和249 bp）。趙攀登等[6]根據(jù)GenBank中PEDV變異毒株和傳統(tǒng)毒株S基因序列，設(shè)計兩對特異性引物，進(jìn)行反應(yīng)條件優(yōu)化。結(jié)果顯示，建立的RT-PCR鑒別診斷方法能夠特異性區(qū)分PEDV變異毒株和傳統(tǒng)毒株，能擴(kuò)增出變異毒株442 bp的目的片段，而傳統(tǒng)毒株是270 bp的目的片段，并且與TGEV（傳染性胃腸炎）、PRV（豬偽狂犬病病毒）、PRRSV（藍(lán)耳病病毒）、PPV（細(xì)小病毒）、CSFV（豬瘟病毒）等均無交叉反應(yīng)；敏感性結(jié)果表明，該方法能檢測出變異毒株和傳統(tǒng)毒株的底限均為4×104拷貝/μL。

2 多重RT-PCR法

多重RT-PCR法是在一個體系中加入多對引物，優(yōu)化反應(yīng)條件后可同時實(shí)現(xiàn)多種病原篩查，具有快速、靈敏度高、高效等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于臨床疾病的快速診斷。丁慶文等[7]參照GenBank中登錄的PEDV M基因、PDCoV（豬丁型冠狀病毒）N基因和PSV 2C基因的保守序列，設(shè)計3對引物，經(jīng)反應(yīng)條件優(yōu)化，建立了能同時檢測PDCoV、PEDV和PSV（豬薩佩羅病毒）的多重RT-PCR方法。結(jié)果顯示，該方法除了對PDCoV、PEDV和PSV有特異性擴(kuò)增外，對PRV、PCV2（圓環(huán)病毒2型）、PBoV（豬博卡病毒）、CSFV、PRRSV等豬常見病毒的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，特異性較強(qiáng)；建立的多重RT-PCR方法對3種質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的最低檢測限分別為1.40×102拷貝/μL（PDCoV）、1.53×102拷貝/μL（PEDV）、1.57×103拷貝/μL（PSV）；而以3種質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板的各單一PCR對PDCoV、PEDV和PSV的最低檢測限分別為1.40×102拷貝/μL、1.53×102拷貝/μL、1.57×102拷貝/μL。以PDCoV、PSV病毒核酸及PEDV陽性病料的cDNA為模板，不同時間重復(fù)檢測3次，檢測結(jié)果均一致，表明該方法重復(fù)性較好。曾秀秀等[8]設(shè)計3對特異性引物，建立PEDV、PDCoV和SADS-CoV（豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒）的三重RT-PCR方法。結(jié)果表明，采用建立的三重RT-PCR方法對PEDV、PDCoV和SADS-CoV進(jìn)行擴(kuò)增，分別擴(kuò)增出大小約為486 bp、329 bp和628 bp的特異性片段；該方法對CSFV、TGEV和PRRSV不能擴(kuò)增出任何片段，特異性好；對PDCoV、PEDV和SADS-CoV的最低檢測量分別為1×106拷貝/μL、1×103拷貝/μL、1×104拷貝/μL，具有較高的敏感性。劉瑩等[9]根據(jù)GenBank中登錄的PDCoV M基因和PEDV M基因設(shè)計了2對引物，通過對PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了檢測PDCoV和PEDV的雙重RT-PCR檢測方法。特異性和敏感度的試驗(yàn)表明，此方法對PDCoV和PEDV核酸的最低檢測量分別為3.27×103拷貝/μL和3.63×104拷貝/μL，敏感度較高；該方法可同時擴(kuò)增出340 bp（PDCoV）和520 bp（PEDV），但不能擴(kuò)增出TGEV、PRV、PBoV和PRRSV的對應(yīng)條帶。

3 納米PCR方法

納米PCR方法是將納米金粒子添加于PCR反應(yīng)體系中的一種新技術(shù)，可提高酶的活性和穩(wěn)定性，提升反應(yīng)效率，減少非特異性擴(kuò)增，提高PCR反應(yīng)特異性，縮短反應(yīng)時間，使檢測更加準(zhǔn)確、可靠[10]。付琦媛等[11]參照GenBank中PEDV經(jīng)典株CV777和變異株CH-HB1-2018的S基因序列，設(shè)計了3條特異性引物，并以納米金顆粒作為熱導(dǎo)介子，優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，建立了能夠區(qū)分PEDV經(jīng)典株和變異株的雙重納米RT-PCR檢測方法。利用該方法同時檢測PEDV經(jīng)典株和變異株、PRV、PCV2和PCV3（圓環(huán)病毒3型）、PRRSV和PDCoV，結(jié)果顯示，該方法能特異性鑒別PEDV經(jīng)典株（747 bp）和變異株（442 bp），且與其他病原均無交叉反應(yīng)，特異性較強(qiáng)；將重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10倍倍比稀釋后分別利用該方法和普通RT-PCR同時檢測，結(jié)果顯示，所建立的雙重納米RT-PCR方法能檢測出經(jīng)典株CV777和變異株CH-HB1-2018重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的下限分別為5.68×102拷貝/μL和4.93×102拷貝/μL，其敏感性較普通RT-PCR的敏感性高100倍。

4 熒光RT-PCR方法

熒光RT-PCR是在常規(guī)RT-PCR技術(shù)上發(fā)展的一種病原核酸檢測技術(shù)，具有靈敏、快速、特異等優(yōu)點(diǎn)，可直接觀察擴(kuò)增結(jié)果，不需要后續(xù)電泳檢測產(chǎn)物，降低了實(shí)驗(yàn)室氣溶膠污染概率，避免了假陽性結(jié)果，可以分為染料法和探針法兩種。王以欣等[12]以PEDV的N基因?yàn)榘谢?，基于雙啟動寡核苷酸引物（DPO），經(jīng)過條件優(yōu)化，建立了檢測PEDV的熒光RT-PCR方法。結(jié)果顯示，DPO引物的有效退火溫度范圍較寬（45～65 ℃）；在測試的10種病毒中僅PEDV為陽性擴(kuò)增結(jié)果，其余病毒為陰性結(jié)果，特異性較強(qiáng)；對PEDV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢測限可達(dá)1.64×101拷貝/μL，敏感性較高；組內(nèi)、組間重復(fù)性結(jié)果的變異系數(shù)均小于1%，重復(fù)性較好。南沛等[13]設(shè)計了一對特異性引物，建立了PEDV EvaGreen熒光PCR檢測方法，對其特異性、靈敏度和重復(fù)性進(jìn)行分析。結(jié)果表明，該熒光定量PCR可以特異性地檢測PEDV，對其他非靶標(biāo)病毒無交叉反應(yīng)，最低檢測限為5 拷貝/ μL；使用3個不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)，Ct值的變異系數(shù)在2.8% 以下，表明該方法重復(fù)性好。冉偉等[14]建立了基于PEDV ORF3基因的SYBR Green I熒光RT-PCR檢測方法。結(jié)果顯示，以重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.998 2，Ct值與質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品在102～1010拷貝/μL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。該方法除對PEDV檢測結(jié)果為陽性外，對TGEV、PoRV、PDCoV、PCV3和PRRSV核酸擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，特異性強(qiáng)；該方法對重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢測下限為102拷貝/μL，比普通RT-PCR靈敏100倍，敏感性高；批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于5%，重復(fù)性好。許夢怡等[15]根據(jù)TGEV的M基因、PEDV的M基因和PoRV的VP2基因序列，分別設(shè)計引物和探針，經(jīng)過進(jìn)一步的條件優(yōu)化，建立了檢測TGEV、PEDV、PoRV的三重實(shí)時熒光定量PCR方法，該方法對TGEV、PEDV、PoRV的檢測靈敏度分別為2.49拷貝/μL、4.36拷貝/μL、4.96拷貝/μL，TGEV、PEDV、PoRV的組內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)的CV（變異系數(shù)）最大值分別為2.5% 、3.8% 、4.3%，組間重復(fù)性試驗(yàn)的CV最大值分別為3.7% 、3.4% 、3.2%，均不超過5%，表明建立的方法重復(fù)性好；用此方法對PRV、PCV1（圓環(huán)病毒1型）、PRRSV樣本進(jìn)行檢測，均沒有交叉反應(yīng)，表明該方法特異性好。于新友等[16]根據(jù)GenBank中已登錄的PRRSV ORF7基因和PEDV N基因序列，設(shè)計2對特異性引物和2條TaqMan探針，通過優(yōu)化擴(kuò)增條件建立檢測PRRSV和PEDV的雙重TaqMan熒光定量RT-PCR方法。結(jié)果表明，最終確立的20 μL擴(kuò)增體系中各引物和探針的加樣量分別為：PRRSV-F 0.8 μL，PRRSV-R 0.6 μL，PRRSV-P 0.5 μL；PEDV-F 1.2 μL，PEDV-R 1.0 μL，PEDV-P 0.7 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?0 ℃反轉(zhuǎn)錄6 min；95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸1 0 s，共4 0個循環(huán)。檢測P R R S V和PEDV的敏感性可分別達(dá)到1.05 TCID50/100 μL和3.16 TCID50/100 μL，該方法特異性好，不與其他常見豬病病原體發(fā)生交叉反應(yīng)，批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)均不高于2.0%。劉如月等[17]根據(jù)GenBank中的PEDV M基因及PDCoV N基因設(shè)計了兩對特異性引物和探針，建立了PEDV和PDCoV的雙重TaqMan qRT-PCR方法，該方法特異性強(qiáng)，與PCV2、PCV3、PRV、PRRSV、TGEV、PBoV及CSFV均無交叉反應(yīng)；敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，建立的單一與雙重?zé)晒舛縋CR對PEDV及PDCoV的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品檢測下限分別為4.7×101拷貝/μL和3.17×101拷貝/μL，敏感性高；對該檢測方法的重復(fù)性進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，該方法組內(nèi)和組間的變異系數(shù)均小于3%，重復(fù)性好。

5 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）方法是由日本學(xué)者Notomi等發(fā)明的一種新型的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，一臺水浴鍋或恒溫箱就能實(shí)現(xiàn)反應(yīng)，結(jié)果可通過肉眼觀察白色渾濁或綠色熒光的生成來判斷，簡便快捷，具有靈敏度高、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)。吳迪等[18]針對PEDV的M基因編碼區(qū)序列，分別設(shè)計合成3組引物，通過對引物的篩選和反應(yīng)條件優(yōu)化，建立了PEDV RT-LAMP可視化快速檢測方法。靈敏度和特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法在65 ℃ 45 min對PEDV的檢測靈敏度為2 拷貝/μL，與TGEV、PoRV、CSFV、PRV、PRRSV均無交叉反應(yīng)。狄亞心等[19]根據(jù)PEDV N基因設(shè)計引物，優(yōu)化并建立了基于RT-LAMP的PEDV快速檢測方法。結(jié)果顯示，該方法的最佳反應(yīng)條件：反應(yīng)溫度為61 ℃，反應(yīng)時間為50 min，Mg2+（鎂離子）和dNTPs濃度分別為8.0 mmol/L和4.0 mmol/L，外引物和內(nèi)引物最佳濃度比為1∶4。特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法只能檢測出PEDV，對其他病原檢測均為陰性，具有良好的特異性；敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該法能檢測出的最低RNA濃度為6.52×10-5mg/L，而常規(guī)RT-PCR能檢測到最低濃度為6.52×10-3mg/L，表明RT-LAMP敏感性是RT-PCR的100倍；重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果無明顯差異，重復(fù)性較好。

6 重組聚合酶擴(kuò)增技術(shù)

重組聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerise amplification, RPA）技術(shù)是2006年由英國TwistDx Inc公司研發(fā)的一種新病原核酸恒溫檢測技術(shù)，主要在25～42 ℃等溫條件下，采用3種酶實(shí)現(xiàn)核酸快速大量擴(kuò)增，短時間內(nèi)實(shí)現(xiàn)靶基因指數(shù)擴(kuò)增，不需要昂貴的儀器設(shè)備，能滿足疫病快速現(xiàn)場檢測的需求。呂繼洲等[20]基于PEDV病毒M基因保守序列，設(shè)計一系列擴(kuò)增引物及其熒光探針，建立了一種PEDV實(shí)時熒光RPA等溫檢測方法，測定了方法的特異性與敏感性。結(jié)果表明，該實(shí)時熒光RPA方法可在39 ℃恒溫反應(yīng)20 min特異性擴(kuò)增PED病毒M基因，與TGEV、PRRSV、PCV2、CSFV等對照病毒無交叉反應(yīng)，其檢測限為10拷貝/μL。

7 膠體金檢測法

膠體金法原理是利用膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)牢固結(jié)合，而不影響蛋白質(zhì)的生物特性。具有操作簡便、穩(wěn)定性好、結(jié)果判斷直觀等優(yōu)點(diǎn)，適合基層臨床一線疾病快速確診應(yīng)用。張艷萍等[21]用膠體金標(biāo)記抗PEDV單克隆抗體B1，摸索與優(yōu)化標(biāo)記條件并制備成金墊；將抗PEDV的單克隆抗體B2和羊抗鼠IgG多克隆抗體噴在硝酸纖維素膜上，優(yōu)化確定最佳包被濃度，組裝成試紙條并做成帶有樣本采集部件的檢測卡。結(jié)果表明，PEDV快速檢測卡可檢測最低病毒含量為100 TCID50/mL；臨床檢測腹瀉豬糞便樣本，與PCR試劑盒結(jié)果對比，檢測卡靈敏度為94.7%，特異性為100%。

8 基因芯片技術(shù)

基因芯片檢測技術(shù)原理是將大量探針分子固定于支持物上后與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強(qiáng)度進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。胡靖飛等[22]根據(jù)PEDV的S、M基因、TGEV的S、N基因、PRoV A的VP7、NSP4基因與PDCoV的M、N基因設(shè)計8對特異性引物，再根據(jù)每對引物擴(kuò)增基因的保守區(qū)域設(shè)計寡核苷酸探針，并用Cy-3熒光直接標(biāo)記下游引物5'端進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增標(biāo)記樣品。研究確定最佳制備和反應(yīng)參數(shù)：100 μmol/L探針原液與點(diǎn)樣緩沖液比例為1∶2，水合處理10 h，雜交溫度為42 ℃，雜交時間為120 min，以信噪比值≥2或信號值＞1 300判為陽性。該芯片靈敏性試驗(yàn)表明最低檢測量為106拷貝/μL，特異性試驗(yàn)表明對非目標(biāo)病原無交叉反應(yīng)，保存期試驗(yàn)表明制備的芯片置于4 ℃下可保存至少60 d。

9 小結(jié)

豬病毒性腹瀉是豬場常見的嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的一類疫病，可導(dǎo)致仔豬大量死亡，其中PED發(fā)病率最高，危害最嚴(yán)重，且同其他病毒引起腹瀉癥狀和病變類似，臨床上很難鑒別，需借助實(shí)驗(yàn)室方法檢測確診。傳統(tǒng)的病毒分離等方法不能滿足臨床疾病快速確診需求，而抗體檢測法不能判定疾病現(xiàn)癥感染。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步越來越多病原快速檢測法被研制，并應(yīng)用于臨床疾病檢測，主要是針對病原核酸的，還有直接針對病毒的，包括RT-PCR方法、熒光RT-PCR方法、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（LAMP）、重組聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（RPA）、膠體金檢測法、基因芯片技術(shù)等。這些檢測方法均有各自不同特點(diǎn)，常規(guī)RT-PCR法雖然特異性強(qiáng)，但檢測速度慢，操作繁瑣，反應(yīng)結(jié)束后需要電泳檢測，且敏感性不高。熒光RT-PCR法雖克服了常規(guī)RT-PCR的部分缺陷，但儀器昂貴，需合成探針，增加檢測成本，不適合基層應(yīng)用。LAMP方法雖然簡單、方便，適合基層進(jìn)行推廣應(yīng)用，但靈敏度太高，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。RPA方法雖不需要復(fù)雜的儀器和設(shè)備，操作簡便，但試劑昂貴。膠體金方法雖檢測速度快，但檢測敏感性低，容易漏檢，市場上產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊?；蛐酒瑱z測技術(shù)鑒于成本和技術(shù)原因，尚不能廣泛應(yīng)用于臨床。不同養(yǎng)殖場及實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)自身不同情況選擇適合自己的方法。隨著技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，已經(jīng)出現(xiàn)了病原免核酸提取直擴(kuò)PCR技術(shù)、便攜式熒光PCR儀器及除模板外PCR組分凍干保存技術(shù)，如能應(yīng)用于PEDV分子檢測，必將開發(fā)出更多方便、快捷、成本更低的病毒檢測技術(shù)，方便疾病確診，從而更好地進(jìn)行PEDV的防控工作。

影響檢測結(jié)果的因素眾多，除了檢測方法，所選擇及采集的病料樣本也很關(guān)鍵，要在合適的時機(jī)，采集典型病料豬及新死亡豬病料樣本，盡可能多采集幾份，病料要新鮮防止腐敗變質(zhì)，并及時送檢，PED不同時期糞便中病毒含量不同。一旦確診后同豬群其他健康豬可緊急接種疫苗，同時加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，改善豬只所處環(huán)境，提升環(huán)境溫度，降低舍內(nèi)氨氣濃度，加強(qiáng)環(huán)境消毒和豬場生物安全管控。病死豬嚴(yán)格無害化處理，防止病原在場內(nèi)大規(guī)模擴(kuò)散。