干細(xì)胞促進(jìn)肌腱損傷修復(fù)研究進(jìn)展

楊志金，唐康來(lái)

(1.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九二〇醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科,昆明 650032； 2.陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)中心,重慶 400038)

肌腱是人體運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的重要組成部分，為致密的纖維結(jié)締組織，其將骨骼與肌肉連接起來(lái)，輔助肌肉運(yùn)動(dòng)并維持骨骼的穩(wěn)定性，是傳遞力量以實(shí)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)所不可或缺的結(jié)構(gòu)[1- 2]。肌腱損傷在體育運(yùn)動(dòng)及日常生活中均十分常見(jiàn)，全球每年大約有超過(guò)3 000萬(wàn)例的肌腱損傷患者，并導(dǎo)致超過(guò)1 560億美元的醫(yī)療支出[3-4]。

肌腱的血液供應(yīng)較差，導(dǎo)致其再生修復(fù)能力差，損傷后不僅其結(jié)構(gòu)的完整性很難恢復(fù)，其生物力學(xué)強(qiáng)度也明顯降低[5-6]。肌腱損傷部位經(jīng)常會(huì)形成瘢痕，其會(huì)損害組織的生物力學(xué)性能和整體活動(dòng)能力[7]。肌腱損傷后明顯影響患者的運(yùn)動(dòng)功能，且肌腱損傷往往愈合不理想，影響患者的生活質(zhì)量[8]。肌腱損傷后無(wú)論是非手術(shù)治療或手術(shù)治療均不能完全恢復(fù)肌腱的天然成分、組織結(jié)構(gòu)及機(jī)械性能。目前尚無(wú)理想的治療方法，臨床迫切需要確實(shí)可行的治療方案[9-10]。

1 肌腱的結(jié)構(gòu)及功能

肌腱含有豐富的膠原纖維，是有一定彈性的致密結(jié)締組織。膠原纖維沿著肌腱長(zhǎng)軸平行排列，呈輕微波浪狀，粗細(xì)基本一致。肌腱的組成及結(jié)構(gòu)使其更適于擔(dān)任連接肌肉和骨骼的角色。肌腱的主要成分是水，占肌腱重量的55%～70%。膠原是其主要的固體成分，占肌腱組織干重的65%～80%。膠原蛋白是一種剛性結(jié)構(gòu)蛋白，為組織提供抗張強(qiáng)度，其中以Ⅰ型膠原為主，約占凈重的90%，Ⅲ型膠原含量較少[11-13]。細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)及其組成成分對(duì)肌腱的發(fā)育和健康維持至關(guān)重要，肌腱ECM的主要成分是Ⅰ型膠原。

肌腱細(xì)胞和肌腱干細(xì)胞是肌腱組織內(nèi)的主要細(xì)胞類型，占肌腱細(xì)胞總數(shù)的90%～95%。肌腱細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，呈紡錘形，細(xì)胞核細(xì)長(zhǎng)，細(xì)胞質(zhì)薄。肌腱干細(xì)胞位于細(xì)胞外基質(zhì)包繞的平行排列膠原纖維之間，可向肌腱細(xì)胞分化。

2 肌腱損傷的愈合過(guò)程

肌腱損傷愈合包括內(nèi)源性因素及外源性因素，其確切機(jī)制目前尚不完全清楚[14]。現(xiàn)有研究認(rèn)為損傷肌腱的修復(fù)可以分為3個(gè)階段，這些階段可以互相重疊，其持續(xù)時(shí)間取決于肌腱損傷的位置和嚴(yán)重程度[15-16]。

2.1炎癥反應(yīng)期 受損部位首先會(huì)出現(xiàn)血腫，中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等遷移至損傷部位，并釋放炎性因子，血管生成因子啟動(dòng)血管生成，同時(shí)成纖維細(xì)胞開(kāi)始合成Ⅲ型膠原。

2.2細(xì)胞增殖期 損傷幾天后，在細(xì)胞增殖期開(kāi)始合成大量的ECM成分，包括無(wú)序排列的蛋白聚糖和膠原蛋白(大部分是Ⅲ型膠原)。此階段的另一個(gè)特征是：細(xì)胞大量增加并吸收大量水分。

2.3重塑與成熟期 Ⅲ型膠原纖維逐漸被Ⅰ型膠原纖維替代，合成的膠原纖維開(kāi)始沿著肌腱長(zhǎng)軸方向進(jìn)行排列，從而恢復(fù)肌腱的剛度及抗拉強(qiáng)度。大約10周后，成熟階段開(kāi)始，其特征是膠原纖維交聯(lián)的增加及更成熟的肌腱組織形成。

3 干細(xì)胞促進(jìn)肌腱損傷修復(fù)研究現(xiàn)狀

干細(xì)胞可以促進(jìn)損傷組織修復(fù)，在合適的條件下具有多向分化潛能。干細(xì)胞不僅在個(gè)體正常發(fā)育過(guò)程中具有重要的作用，在組織損傷的病理?xiàng)l件下也具有重要作用。干細(xì)胞無(wú)論是在肌腱急性損傷或慢性損傷的治療上，均具有巨大的潛能和應(yīng)用前景[10]。肌腱組織工程的常用種子細(xì)胞主要有間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、肌腱干細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等[17]。

3.1肌腱干細(xì)胞(tendon stem cells，TSCs) 在很長(zhǎng)一段時(shí)間，肌腱細(xì)胞被認(rèn)為是肌腱中唯一的細(xì)胞類型。直至2007年，有學(xué)者首次從人及小鼠的肌腱中分離獲得TSCs[18]，并相繼在多種動(dòng)物的肌腱及韌帶中分離獲得TSCs[19-21]。TSCs表現(xiàn)出成人間充質(zhì)干細(xì)胞相同的典型特征，如典型的表面抗原、自我更新、克隆形成和三系分化能力(成脂肪、成骨和成軟骨)。Zhang和Wang[22]研究發(fā)現(xiàn)TSCs能夠在體外分化成脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞，在裸鼠皮下移植后也能形成肌腱樣、軟骨樣和骨樣組織。與其他的MSCs相比，TSCs表達(dá)肌腱相關(guān)基因如scleraxis(Scx)、tenomodulin(Tnmd)等[15]。由于這些獨(dú)特的性質(zhì)，TSCs在肌腱損傷修復(fù)、再生過(guò)程中起關(guān)鍵作用[10,23]。

TSCs來(lái)源于肌腱，是治療肌腱損傷最適宜的種子細(xì)胞。Zhang等[24]研究證實(shí)，在體外實(shí)驗(yàn)中，脫細(xì)胞肌腱組織支架能促進(jìn)TSCs增殖，并有利于其保持干細(xì)胞的干性。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，脫細(xì)胞肌腱組織支架聯(lián)合TSCs能在裸鼠體內(nèi)形成肌腱樣組織。Shen等[25]將兔來(lái)源TSCs在蠶絲膠原海綿支架上培養(yǎng)后，移植至兔肩袖損傷模型，12周后同種異體TSCs治療組與對(duì)照組相比具有更好的組織結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)性能。Chen等[26]使用TSCs聯(lián)合富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)治療大鼠跟腱損傷，研究結(jié)果證實(shí)：TSCs和PRP對(duì)肌腱損傷有協(xié)同治療作用，可顯著促進(jìn)肌腱損傷愈合。Ni等[27]用TSCs治療大鼠髕腱缺損動(dòng)物模型，結(jié)果證實(shí)治療4周時(shí)TSCs治療組生物力學(xué)性能明顯優(yōu)于對(duì)照組，TSCs能促進(jìn)損傷肌腱的早期愈合。

3.2間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs) MSCs

是具有自我更新能力及多向分化潛能的多能干細(xì)胞，現(xiàn)已從包括骨髓、滑膜、肝臟、肌肉、腦、脂肪、胎盤(pán)和臍帶等多種組織中分離得到MSCs[28]。MSCs最早于成年骨髓中發(fā)現(xiàn)，稱之為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)[29]。BMSCs很容易分離，且自我更新和多向分化能力強(qiáng)，也是肌腱損傷再生領(lǐng)域的理想細(xì)胞來(lái)源。在治療運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)損傷疾病時(shí)，BMSCs由于良好的生物學(xué)特征，是使用最廣泛的干細(xì)胞類型。

Kim等[30]在肩袖損傷患者修復(fù)期注射以纖維蛋白膠為載體包裹的脂肪源性MSCs，用臨床及影像檢查指標(biāo)評(píng)價(jià)治療效果，結(jié)果顯示脂肪源性MSCs局部注射可顯著降低肩袖損傷再次發(fā)生率。Chong等[31]采用兔跟腱中部完全橫斷損傷動(dòng)物模型，研究外源性BMSCs治療對(duì)肌腱早期愈合過(guò)程中組織結(jié)構(gòu)和機(jī)械性能的影響。治療組在纖維蛋白支架中加入BMSCs，而對(duì)照組僅使用纖維蛋白支架，在損傷后3周，治療組細(xì)胞排列及機(jī)械性能方面均優(yōu)于對(duì)照組，骨髓MSCs在肌腱早期愈合中表現(xiàn)出積極的作用。然而，這項(xiàng)研究主要局限是實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組長(zhǎng)期效應(yīng)上無(wú)顯著差異。

現(xiàn)有研究表明MSCs在促進(jìn)肌腱損傷修復(fù)方面有積極作用，其可能的作用機(jī)制包括：首先，MSCs可以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，并通過(guò)細(xì)胞-細(xì)胞間的直接接觸，釋放可溶性免疫抑制劑而發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)功能； 其次，MSCs可以分泌促進(jìn)相鄰細(xì)胞增殖的生長(zhǎng)因子、趨化因子及預(yù)防細(xì)胞凋亡； 最后，MSCs具有多向分能力，包括：骨、軟骨、肌腱、脂肪及肌肉等[32-34]。

3.3脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells,ADSCs) ADSCs具有易于獲取、來(lái)源廣泛、體外擴(kuò)增容易、免疫原性低、不存在倫理問(wèn)題等許多優(yōu)點(diǎn)。目前，ADSCs已在人、雞等多種物種中成功分離[35-36]。

Uysal等[14]利用ADSCs治療兔的跟腱損傷，組織學(xué)及免疫組化染色結(jié)果證實(shí)ADSCs可促進(jìn)肌腱損傷愈合。Lee等[33]將人來(lái)源ADSCs移植至大鼠跟腱損傷動(dòng)物模型，分別在損傷后2周及4周進(jìn)行免疫組化、生物力學(xué)測(cè)試等檢測(cè)，結(jié)果顯示人來(lái)源ADSCs能促進(jìn)大鼠肌腱損傷愈合，并顯著提高其生物力學(xué)性能。Oh等[37]將ADSCs注射至兔的慢性肩袖撕裂部位，進(jìn)行生物力學(xué)及組織學(xué)分析，結(jié)果顯示ADSCs局部注射可促進(jìn)肩袖損傷的愈合，并改善了肩袖組織的脂肪浸潤(rùn)情況。Lee等[38]用異體ADSCs治療人的慢性肌腱病，隨訪52周，結(jié)果證實(shí)無(wú)明顯不良反應(yīng)，可顯著減輕關(guān)節(jié)疼痛、改善關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍及損傷肌腱的組織結(jié)構(gòu)。ADSCs是一種治療肌腱病的安全、有效的方法，是一種治療肌腱損傷極具潛力的細(xì)胞類型，其促進(jìn)肌腱損傷愈合的機(jī)制，包括刺激肌腱自身細(xì)胞增殖、合成ECM，募集肌腱自身細(xì)胞至損傷部位，從而促進(jìn)肌腱損傷愈合。

3.4皮膚來(lái)源干細(xì)胞(skin-derived stem cells,SDSCs) 皮膚是一種獨(dú)特的器官，是哺乳動(dòng)物中能持續(xù)自我更新的少數(shù)器官之一，甚至到成年時(shí)期。皮膚含有多種干細(xì)胞用于維持皮膚的自我平衡及在皮膚損傷或疾病時(shí)促進(jìn)損傷皮膚的修復(fù)。皮膚成纖維細(xì)胞在形態(tài)、功能上與肌腱細(xì)胞十分相似，且來(lái)源廣泛、相對(duì)容易獲取。皮膚成纖維細(xì)胞和干細(xì)胞表達(dá)相同的細(xì)胞免疫表型，并且也具有分化為脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的多向分化能力[39]。

Liu等[40]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)：皮膚成纖維細(xì)胞可作為肌腱組織工程的種子細(xì)胞，以促進(jìn)肌腱損傷的愈合。Obaid等[41]在一項(xiàng)隨機(jī)雙盲臨床對(duì)照試驗(yàn)中，使用皮膚成纖維細(xì)胞治療慢性跟腱損傷，研究結(jié)果證實(shí)皮膚成纖維細(xì)胞治療慢性跟腱損傷安全、有效，隨訪6個(gè)月時(shí)疼痛評(píng)分明顯優(yōu)于對(duì)照組。Clarke等[42]在一項(xiàng)臨床試驗(yàn)中，使用超聲引導(dǎo)下注射自體皮膚來(lái)源的皮膚成纖維細(xì)胞治療髕腱損傷，治療后6周及3、6個(gè)月的隨訪結(jié)果證實(shí)：皮膚成纖維細(xì)胞短期治療髕腱損傷安全、有效，和對(duì)照組相比疼痛及功能改善均十分顯著。

4 小結(jié)

由于肌腱通常受到機(jī)械損傷或退行性損傷的影響，肌腱損傷后肌腱細(xì)胞的更新和功能、結(jié)構(gòu)完整性的重建極其重要。干細(xì)胞治療肌腱損傷是一項(xiàng)極有前景的治療方法，能有效促進(jìn)損傷肌腱修復(fù)或再生，關(guān)鍵在于選擇合適的細(xì)胞類型。

目前尚無(wú)治療肌腱損傷的理想干細(xì)胞，不同的干細(xì)胞有其各自的優(yōu)缺點(diǎn)，但不使用老年或病變組織來(lái)源干細(xì)胞是明確的。

在肌腱損傷愈合的不同階段，生長(zhǎng)因子對(duì)干細(xì)胞的分化均具有重要調(diào)控作用。在肌腱損傷愈合過(guò)程中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)等細(xì)胞因子均具有調(diào)控其分化方向的作用。同時(shí)支架材料的研究和利用也是肌腱組織工程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其可為干細(xì)胞生長(zhǎng)提供穩(wěn)定的外部環(huán)境。理想的肌腱組織工程支架應(yīng)具有良好的生物活性、生物相容性及安全性、適宜的機(jī)械性能及力學(xué)強(qiáng)度、易加工及處理、合適的孔隙率及三維立體結(jié)構(gòu)等。干細(xì)胞促進(jìn)肌腱損傷修復(fù)過(guò)程中，使用生物支架作為載體，使用生長(zhǎng)因子來(lái)誘導(dǎo)干細(xì)胞成肌腱分化，及干細(xì)胞個(gè)性化植入后增強(qiáng)等綜合治療方案，或許能為肌腱損傷的治療提供完美解決方案。

在過(guò)去20年中，有關(guān)于肌腱損傷的干細(xì)胞及組織工程研究取得了許多令人鼓舞的結(jié)果。干細(xì)胞促進(jìn)肌腱損傷修復(fù)在大量的動(dòng)物研究中，取得了很好的治療效果。近年來(lái)，研究人員更加關(guān)注干細(xì)胞治療在人體肌腱損傷中的應(yīng)用。在此期間也開(kāi)展了許多臨床前研究，但目前的研究成果仍不夠完善，仍需進(jìn)一步的臨床研究來(lái)證實(shí)干細(xì)胞治療的安全性及有效性。目前，只有MSCs治療跟腱炎等少數(shù)臨床試驗(yàn)在進(jìn)行中，將來(lái)在肌腱再生醫(yī)學(xué)和組織工程領(lǐng)域，仍需更多臨床實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證干細(xì)胞促進(jìn)肌腱損傷修復(fù)的臨床療效。干細(xì)胞促進(jìn)肌腱損傷修復(fù)的機(jī)制目前尚不完全清楚，還必須進(jìn)一步深入研究，使干細(xì)胞治療肌腱損傷成為切實(shí)可行的治療方法。干細(xì)胞無(wú)論是治療肌腱急性損傷，還是緩解退行性肌腱病的癥狀，均是希望與挑戰(zhàn)并存。