甘蔗染色體遺傳研究進展

丁雪兒, 侯 瀟, 鄧祖湖

(福建農林大學國家甘蔗工程技術研究中心/農業(yè)部福建甘蔗生物學與遺傳育種重點實驗室，福建 福州 350002)

甘蔗(Saccharumofficinarum)為禾本科甘蔗屬植物，主要分布在熱帶與亞熱帶地區(qū)，生產上主要以蔗莖進行無性繁殖，并可多年宿根[1-2]。甘蔗屬與蔗茅屬、芒屬、硬穗屬和河八王屬組成“甘蔗復合體”[3]，這些近緣屬野生種是拓寬甘蔗遺傳基礎的重要種質資源[4]。甘蔗屬內分為6個種，包括4個栽培種(熱帶種、中國種、印度種和食穗種)和2個野生種(割手密種和大莖野生種)。

染色體是生物細胞內遺傳物質的載體，每個物種都有一定數(shù)目及一定形態(tài)結構的染色體[5]。現(xiàn)代甘蔗品種是異源雜合的非整倍體作物，染色體數(shù)較多且組成復雜，該遺傳背景使染色體遺傳研究較困難。Burner et al[6]研究發(fā)現(xiàn)，染色體傳遞方式可能會影響甘蔗育種的選擇效率和育種進展。在甘蔗野生種質利用過程中，把染色體遺傳行為與甘蔗材料表型相結合研究，對促進遺傳育種有重要意義。本文綜述了染色體遺傳方式、基因組原位雜交(genomicinsituhybridization, GISH)技術以及寡核苷酸熒光原位雜交(oligonucleotide fluorescenceinsituhybridization, oligo-FISH)技術在甘蔗染色體上的研究進展，以期為研究甘蔗及近緣屬物種基因組結構提供參考。

1 甘蔗染色體的遺傳方式

1.1 甘蔗屬種間雜交后代的染色體遺傳方式

熱帶種(2n=80)又稱為“高貴種”,含糖量高且粗大，對水肥要求高[7]。熱帶種作為“高貴化”育種的原始親本和回交親本，與野生種質資源雜交以創(chuàng)新種質。野生種割手密莖徑細、含糖量低但再生能力較高。熱帶種與割手密雜交能將熱帶種的高糖性狀和高產量的潛力與割手密的抗逆性相結合，改善雜交后代的宿根能力和適應性?，F(xiàn)代甘蔗栽培種品種主要是熱帶種和割手密雜交而來的非整倍體，染色體數(shù)目約100～130條，其中70%～80%來自熱帶種，10%～20%來自割手密，約10%來自二者之間的相互重組[8]。

1961年，Bremer[9]基于染色體計數(shù)的細胞遺傳學研究表明，熱帶種與割手密雜交F1代以及F1再與純正熱帶種回交得到的BC1染色體傳遞方式大多為2n+n，即熱帶種作為母本將全部的染色體傳遞給F1和BC1代。該遺傳方式加快了熱帶種大莖、高糖性狀的恢復速度并減少割手密野生血緣，使甘蔗在割手密“高貴化”育種中的優(yōu)良性狀得以迅速恢復。但Price[10]研究表明，熱帶種×割手密雜交后代也有n+n的遺傳方式。熱帶種與割手密雜交品種中，產量較高的品種都出自2n+n組合[11]。熱帶種與割手密雜交多以熱帶種作母本，以割手密做母本則較少。Kandasami[12]研究表明,以割手密為母本、熱帶種為父本的雜交后代大多以n+n的方式傳遞，少數(shù)為2n+n的方式。Price[10]研究表明，熱帶種與熱帶種雜交或者熱帶種與大莖野生種雜交，其染色體大多以n+n的方式傳遞，少數(shù)以2n+2n的方式。2n=60的大莖野生種與割手密(2n=64)雜交，染色體呈n+n傳遞；而2n=80的大莖野生種與割手密雜交，染色體大多呈2n+n傳遞，少數(shù)以n+n的方式傳遞[11]。

1.2 甘蔗屬與近緣屬雜交后代的染色體遺傳方式

1.2.1 與蔗茅屬雜交 通常把斑茅歸類到蔗茅屬，但Lloyd et al[13]通過分子研究認為斑茅屬于Tripidium屬。斑茅具有生物量大、抗旱耐瘠、適應性廣和宿根性強等優(yōu)良性狀，是甘蔗品種改良的重要種質[14]。對斑茅的利用已有一百多年，但由于甘蔗與斑茅之間的真正雜交種無花粉或花粉不育，難以進行屬間雜交，因此未能選育到斑茅真實雜種。2001年，海南甘蔗育種場以甘蔗與斑茅雜交的F1代做母本大量雜交獲得了少量的BC1雜種，隨后育成一批BC2等更多高世代材料[15]。

鄧祖湖等[16]對熱帶種Badila與海南斑茅92-105雜交得到的崖城96-66染色體數(shù)以及Badila再與崖城96-66雜交得到的崖城96-40染色體數(shù)研究表明，甘蔗與斑茅F1代染色體遺傳方式為n+n。黃永吉等[17]研究表明，甘蔗與斑茅BC1代染色體以2n+n的方式傳遞。Wu et al[1]研究表明，甘蔗與斑茅雜交BC1后代存在超2n+n的染色體傳遞現(xiàn)象。Huang et al[18]研究表明,甘蔗與斑茅雜交的BC2、BC3代染色體傳遞方式基本符合n+n，其中斑茅染色體存在不斷丟失現(xiàn)象。Yang et al[19]對新臺糖10號與YCE03-01(BC2)雜交后代BC3和BC4研究表明，從BC3到BC4斑茅染色體數(shù)量大約減少了一半，但有少數(shù)后代減少數(shù)量超過或少于一半?？赡茉谌旧w分離過程中，斑茅染色體基數(shù)(x=10)少于10條，因此染色體按隨機的方式分配。

在甘蔗染色體傳遞研究中，親本染色體遺傳給后代大多不是親本原來一倍體的染色體數(shù)目，染色體數(shù)目發(fā)生了增減。D′Hont et al[20]研究表明，熱帶種BNS3066與斑茅IK76-48的雜交種并非70條染色體，而是39條來自熱帶種，25～26條來自斑茅。此外，也有雜種中熱帶種的染色體數(shù)為48～52條[21]。Piperidis et al[22]研究認為，利用GISH技術可以觀察到熱帶種和割手密之間的染色體重組，Huang et al[18]研究表明，甘蔗與斑茅雜交后代存在染色體易位現(xiàn)象，染色體易位發(fā)生在斑茅染色體的末端，且易位現(xiàn)象可以穩(wěn)定遺傳。甘蔗與斑茅之間有很大的遺傳距離[23-25]，屬間的染色體易位可以發(fā)生在BC1、BC2和BC3代，這種遺傳變異對甘蔗的育種改良有積極的意義[18]。

滇蔗茅與甘蔗的親緣關系較近[26]。林秀琴等[27]研究表明，甘蔗與滇蔗茅屬間遠緣雜交的F1代染色體以n+n方式遺傳，BC1代以2n+n方式遺傳。王先宏等[28]對甘蔗栽培品種與昆明蔗茅雜交產生的F1代進行GISH研究表明，甘蔗與蔗茅雜種F1代染色體組成為n+n及2n+n；F1代再與新臺糖10號雜交，親本染色體在子代中的染色體傳遞方式為2n+n；F2代與新臺糖10號回交獲得的BC1代中，染色體以n+n的方式傳遞。在甘蔗種間及屬間雜交時，雜種后代染色體數(shù)目比雙親各自單倍的配子體染色體數(shù)目之和多，這種現(xiàn)象源于母本一方染色體的“二倍化”。王先宏等[29]認為，母本染色體在子代中以2n方式傳遞。

1.2.2 與河八王雜交 河八王是甘蔗的近緣屬野生種，具有耐旱、耐瘦、分蘗力強等優(yōu)點。劉昔輝等[30]研究表明，甘蔗與河八王雜交F1代染色體傳遞方式為：n+n和n+2n，BC1染色體傳遞方式為n+n。段維興等[31]認為，甘蔗與河八王雜交的BC1和BC2代染色體均以n+n方式傳遞。以上說明，河八王或河八王后代和甘蔗雜交(回交)中，甘蔗染色體以配子n的方式傳遞給下一代。

1.3 甘蔗屬與斑割復合體雜交后代的染色體遺傳方式

國內外對斑茅和割手密的利用都是用甘蔗與斑茅或割手密雜交，再以雜種為父本與甘蔗進行“高貴化”回交。甘蔗與割手密雜交的F1代可育；但甘蔗與斑茅是屬間雜交，其F1代不育或育性極低，難以進一步雜交。利用斑茅與割手密雜交獲得斑割復合體，再與甘蔗進行雜交和回交，既有可能結合野生種質的優(yōu)異性狀，又可以解決甘蔗與斑茅雜交后代不育的難題。劉許輝[32]和黃玉新等[33]研究表明，粵糖93-159和桂糖02-761與斑割復合體GXAS07-6-1雜交的F1代染色體遺傳方式為n+n。此外，甘蔗與斑割復合體雜交時，斑茅在親子間傳遞過程中存在染色體丟失，但未發(fā)現(xiàn)有染色體的交換和易位現(xiàn)象。

綜上所述，由于遺傳背景復雜，在有性雜交過程中甘蔗后代的染色體傳遞往往不符合經典的細胞遺傳規(guī)律。在甘蔗遠緣雜交中，由于配子染色體的不平衡分配，染色體傳遞呈現(xiàn)多種形式，包括n+n、n+2n、2n+n和超2n+n等方式。鄭成木[34]研究認為，甘蔗細胞染色體數(shù)目變化可能是由于祖親(不同物種)的細胞周期不同，使得在雜種中來自不同物種的染色體行為不同步，導致細胞分裂過程中染色體分配不均衡所造成。在傳遞配子過程中，親本出現(xiàn)少于體細胞、配子原本的數(shù)目，與染色體的丟失有關[35]。在甘蔗育種中，減數(shù)分裂異常導致了2n配子的產生，熱帶種形成的2n配子使得“高貴種”的高糖基因得以保留。吳嘉云等[36]鑒定了甘蔗和斑茅雜交后代的抗性表明，2n及超2n配子的出現(xiàn)提高了雜交后代的抗性。因此，深入了解2n配子的形成規(guī)律將有利于提高甘蔗育種效率。

2 GISH技術在甘蔗染色體研究中的應用

甘蔗是復雜的異源多倍體植物，染色體數(shù)目眾多且形態(tài)小、相似性高，給染色體識別帶來了較大的困難。以往的研究大多根據(jù)細胞學水平的計數(shù)和核型分析，無法準確闡明甘蔗遠緣雜交后代染色體的遺傳行為。原位雜交是根據(jù)核酸分子堿基配對的原則，將經放射性或非放射性的外源核酸序列如基因組DNA與染色體經過變性的DNA互補配對，結合成專一的核酸雜交分子，再經一定的檢測手段將待測核酸在染色體上的位置顯示出來[37]。通過熒光素檢測雜交位點的原位雜交稱為熒光原位雜交。其中，將不同物種的基因組DNA標記為探針的技術稱為基因組原位雜交技術，主要應用于鑒定種間親緣關系及異源染色質。近年來GISH技術發(fā)展迅速，使甘蔗細胞學研究進展明顯。GISH技術還可用來研究甘蔗染色體重組。早期，Price[38]認為甘蔗雜交后代熱帶種與割手密不發(fā)生重組。1996年，D′Hont et al[39]利用GISH技術研究栽培種R570(2n≈115)，發(fā)現(xiàn)該品種有約10%的熱帶種和割手密的重組染色體。羅宗蘋[40]對新臺糖25號和新臺糖16號進行GISH，區(qū)分出了熱帶種血緣和割手密血緣，以及發(fā)生交換、重組的染色體。GISH也是對遠緣雜交后代中的染色體進行鑒定的有效工具，用不同標記的雙親DNA探針可將來自不同親本的染色體區(qū)分開。若親緣關系不密切，如屬間關系，進行基因組原位雜交會出現(xiàn)明顯的紅綠熒光信號，從而清晰地判斷染色體來源。林秀琴等[41]應用GISH技術，鑒定出甘蔗屬熱帶種與滇蔗茅遠緣雜交F1代含雙親本的染色體。應用GISH技術能夠了解和探明現(xiàn)代甘蔗品種的復雜性，同時為甘蔗屬的分類和染色體遺傳提供證據(jù)[42]。

3 oligo-FISH技術在甘蔗染色體研究中的應用

甘蔗染色體大小相似，利用傳統(tǒng)FISH技術識別具有挑戰(zhàn)性。近年來隨著甘蔗基因組參考序列研究取得突破，使開發(fā)甘蔗染色體或染色體區(qū)域的特異寡核苷酸(oligo)探針成為可能。oligo探針可為每條異源或同源染色體產生唯一條形碼。oligo-FISH技術是根據(jù)已測序的基因組序列設計覆蓋染色體部分片段的oligo作為探針的FISH技術，寡核苷酸探針是人工合成的，適用于染色體識別與核型構建[43]。oligo探針可分為染色體條形碼和染色體涂染。染色體涂染是將整條染色體上oligo用來設計探針，從而達到對物種某一單條染色體進行涂染的目的[25]。已有學者利用oligo-FISH技術觀察和追蹤水稻[44]、柑橘[45]、玉米[46]和楊樹[47]等植物的染色體有絲分裂和減數(shù)分裂時期的形態(tài)變化。

Piperidis et al[48]結合olig-FISH與GISH技術，研究了現(xiàn)代甘蔗品種及其親本代表種的基因組結構，證實了熱帶種的染色體基數(shù)為10，并推測割手密經過染色體融合后，基數(shù)從10到9再到8的逐步演化。Meng et al[49]基于高粱基因組設計和合成了染色體特異oligo探針，對割手密SES208(2n=8x=64)進行FISH，證實了割手密的染色體重排導致染色體基數(shù)由10減少到8。目前利用oligo-FISH技術已識別了熱帶種和割手密染色體，但對甘蔗近緣屬細胞學研究較少。染色體基數(shù)為8的割手密oligo探針對甘蔗近緣屬染色體識別效果不理想，因此開發(fā)基數(shù)為10的oligo染色體全涂染探針對甘蔗屬及甘蔗屬復合體中的芒屬、河八王屬和蔗茅屬材料進行染色體鑒定具有重要意義。

oligo-FISH技術能夠識別單個染色體，為甘蔗復雜基因組的組裝奠定了基礎，是研究甘蔗染色體的有利工具。隨著研究深入，利用oligo-FISH技術可對甘蔗與野生種質雜交進行精確的染色體遺傳研究。FISH技術不僅可以用來鑒定斑茅染色體，也可以用來鑒定其他近緣屬物種。目前，河八王、蔗茅、滇蔗茅等野生近緣屬已經成功與甘蔗屬雜交獲得后代。斑茅作為重要的野生種質資源，斑茅血緣的滲入提高了甘蔗雜交后代的抗性。將甘蔗與斑茅雜交高世代中的染色體和表型相聯(lián)系，進一步把抗性材料的優(yōu)良性狀鎖定在某一或某些染色體上，深入挖掘抗性基因，將能更好地利用野生種質資源，創(chuàng)制優(yōu)良親本、材料或品種。

4 展望

本文從甘蔗染色體遺傳方式、GISH技術和oligo-FISH技術應用等方面綜述了甘蔗染色體遺傳研究進展，為分析甘蔗以及近緣屬物種基因組結構提供細胞學依據(jù)。oligo-FISH技術的發(fā)展使之前研究的數(shù)量關系發(fā)展到精確的染色體識別上，有利于了解甘蔗近緣屬野生種質材料的細胞遺傳信息，可將oligo-FISH與GISH結合用于探明甘蔗品種的染色體核型，輔助甘蔗基因組的組裝。