農(nóng)作物種子檢測(cè)中SSR與SNP分子標(biāo)記方法的比較分析

李巧英

（山西省農(nóng)業(yè)種子總站，太原 030006）

隨著分子生物學(xué)理論和分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記逐漸應(yīng)用在農(nóng)作物種子檢測(cè)中，實(shí)現(xiàn)了在基因水平上分析農(nóng)作物品種信息。品種間的差異通過(guò)多個(gè)位點(diǎn)DNA 序列長(zhǎng)度不同或堿基組成不同表現(xiàn)出來(lái)，利用不同檢測(cè)平臺(tái)展示指紋信息，便于分析各品種不同位點(diǎn)的基因型，進(jìn)行比對(duì)。分子標(biāo)記法快速檢測(cè)，避免了應(yīng)用傳統(tǒng)檢測(cè)方法受自然環(huán)境條件和人員主觀因素等影響的困惑。

分子標(biāo)記是一種以DNA 序列變異為基礎(chǔ)的標(biāo)記，在生物體基因組中，DNA 序列差異是生物遺傳多樣性的直接體現(xiàn)，通過(guò)研究這些差異可進(jìn)行品種間親緣關(guān)系的分析。分子標(biāo)記在生物體中分布廣泛，多態(tài)性高，信息量豐富，遺傳穩(wěn)定，利用分子標(biāo)記進(jìn)行種子基因分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果及時(shí)可靠，在農(nóng)作物種子質(zhì)量監(jiān)控、品種身份鑒定、品種權(quán)保護(hù)、品種審定、基因定位和遺傳育種等方面具有重要的意義。經(jīng)過(guò)研究與改進(jìn)，第1 代分子標(biāo)記方法由于各種問(wèn)題與缺陷逐漸被淘汰，目前SSR 和SNP 分子標(biāo)記是農(nóng)作物種子檢測(cè)中應(yīng)用的優(yōu)良標(biāo)記方法。

1 檢測(cè)原理

SSR（簡(jiǎn)單重復(fù)序列）第2 代DNA 分子標(biāo)記，是生物體內(nèi)存在的以l～6 個(gè)核苷酸為重復(fù)單元的DNA 序列，由于寡核苷酸重復(fù)序列和重復(fù)次數(shù)不同形成長(zhǎng)短不一的核苷酸片段。將作物品種在某一位點(diǎn)的特異核苷酸序列作為標(biāo)記，根據(jù)核苷酸鏈兩端保守的基因序列設(shè)計(jì)不同的引物，將這些DNA 片段擴(kuò)增出來(lái)，分析比較待測(cè)樣品在該位點(diǎn)的基因序列，確定品種基因型，分析品種間的遺傳關(guān)系。SSR 標(biāo)記是一種共顯性標(biāo)記，等位變異多，試驗(yàn)重復(fù)性好，數(shù)據(jù)分析簡(jiǎn)便，且易于樣品間結(jié)果比對(duì)和與數(shù)據(jù)庫(kù)信息比較。

SNP（單核苷酸多態(tài)性）第3 代DNA 分子標(biāo)記，是指生物體內(nèi)同一位點(diǎn)的不同等位基因之間由于插入、缺失、轉(zhuǎn)換或顛換引起的單個(gè)核苷酸差異，多為轉(zhuǎn)換和顛換。堿基差異是基因組中遺傳變異的最小結(jié)構(gòu)單位，直接導(dǎo)致遺傳物質(zhì)的不同，利用SNP 分子標(biāo)記檢測(cè)這種差異可以幫助區(qū)分不同品種和研究品種間的關(guān)系。SNP 標(biāo)記在整個(gè)基因組中數(shù)量多，高密度分布，靈敏度高，突變頻率較低，易于基因分型，是一種二態(tài)性標(biāo)記，單個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)的區(qū)分能力較弱，需要結(jié)合多個(gè)特異位點(diǎn)組合形成特定指紋區(qū)分品種，要求高通量檢測(cè)平臺(tái)。

SSR 與SNP 標(biāo)記方法中，SSR 標(biāo)記是以檢測(cè)品種特定位點(diǎn)的核苷酸片段長(zhǎng)度作為評(píng)價(jià)依據(jù)，SNP標(biāo)記是以統(tǒng)計(jì)分析多個(gè)位點(diǎn)的堿基組成變化作為分析手段。SNP 標(biāo)記在生物體基因組中的密度比SSR標(biāo)記高，遺傳穩(wěn)定性也高，在農(nóng)作物種子檢測(cè)中不同標(biāo)記方法適合不同的檢測(cè)需要，具有不同的應(yīng)用價(jià)值。

2 檢測(cè)平臺(tái)

2.1 SSR 分子標(biāo)記法檢測(cè)平臺(tái)SSR 分子標(biāo)記法常用的檢測(cè)平臺(tái)有變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和熒光毛細(xì)管電泳。變性聚丙烯酰胺凝膠電泳是利用4.5%或6%的聚丙烯酰胺凝膠作為支持物分離PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)固定、染色后形成特異的指紋圖譜，分析目標(biāo)DNA 片段的遷移率，與Marker 標(biāo)記條帶進(jìn)行比較，確定PCR 產(chǎn)物的大小，通過(guò)指紋信息比較待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品，或與數(shù)據(jù)庫(kù)信息比對(duì)，確認(rèn)品種信息。變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)平臺(tái)需要將待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品相鄰泳道同時(shí)電泳，或?qū)⒋郎y(cè)樣品與相應(yīng)Maker 目的條帶比較，估算DNA 片段大小。這種電泳方法能比較SSR 標(biāo)準(zhǔn)指紋數(shù)據(jù)庫(kù)中目前沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)樣品指紋信息的品種，不需要標(biāo)準(zhǔn)樣品的DNA 作參照，但這種電泳檢測(cè)方法數(shù)據(jù)精確度低，1～5bp 差異不明顯[1]，自動(dòng)化程度低。

熒光毛細(xì)管電泳檢測(cè)平臺(tái)是根據(jù)引物擴(kuò)增范圍和目的等位基因的分布特征將40 對(duì)引物進(jìn)行分組，設(shè)立十重?zé)晒饷?xì)管電泳體系[2]，將不同顏色熒光標(biāo)記的引物和具有自身分布特征的位點(diǎn)分為1 組，多重電泳?；蚍治鰞x分離PCR 產(chǎn)物，數(shù)據(jù)分析軟件（GeneMarker 或SSR 指紋分析器）分析待測(cè)樣品在該位點(diǎn)的基因特征，將檢測(cè)結(jié)果與SSR 指紋數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，確定待測(cè)樣品的指紋信息，分析品種身份。熒光毛細(xì)管電泳檢測(cè)平臺(tái)只分析檢測(cè)樣品，不需用標(biāo)準(zhǔn)樣品的DNA 作參照，但要求該標(biāo)準(zhǔn)樣品的指紋信息在SSR 指紋數(shù)據(jù)庫(kù)中完整備案。熒光毛細(xì)管電泳檢測(cè)平臺(tái)檢測(cè)結(jié)果精確，峰值圖可以明顯標(biāo)示品種間單個(gè)位點(diǎn)1bp 的差異。由此可知，熒光毛細(xì)管電泳比變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)到的等位基因和基因型數(shù)目多，區(qū)分品種的能力強(qiáng)。

2.2 SNP 分子標(biāo)記法檢測(cè)平臺(tái)SNP 分子標(biāo)記方法常用的檢測(cè)平臺(tái)有KASP 檢測(cè)平臺(tái)和芯片平臺(tái)。KASP 技術(shù)是根據(jù)引物末端特異匹配的堿基進(jìn)行SNP 分型，擴(kuò)增時(shí)需要多個(gè)特異的SNP 引物及兩個(gè)通用熒光探針和兩個(gè)通用淬滅探針[3]，經(jīng)過(guò)幾個(gè)PCR 擴(kuò)增循環(huán)后，淬滅探針已被切碎，熒光探針退火結(jié)合到新合成的、無(wú)淬滅基團(tuán)的互補(bǔ)鏈上，發(fā)出熒光，通過(guò)SNP 分型儀檢測(cè)熒光信號(hào)，數(shù)據(jù)分析軟件KlusterCallerTM自動(dòng)確定該位點(diǎn)上的堿基，確定品種基因型。KASP 技術(shù)通過(guò)Pherastar SNP 分型儀掃描一塊1536 微孔板用時(shí)80s，時(shí)間短，效率高。

SNP 芯片是將大量特定的探針?lè)肿佑行虻毓潭ㄔ谝恍K硅片、玻片或硝酸纖維素膜等載體上，加入已標(biāo)記的待測(cè)樣品，進(jìn)行雜交，掃描信號(hào)的強(qiáng)弱與分布，確定目的基因的種類。SNP 芯片一次能夠平行分析大量基因，檢測(cè)幾十萬(wàn)到上百萬(wàn)個(gè)位點(diǎn)，且性能穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)方便。但芯片設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)成本較高，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，目前市場(chǎng)上還沒(méi)有完善的種子質(zhì)量檢測(cè)SNP 芯片目錄，需要定制特定的SNP 芯片，不適合小樣本量檢測(cè)和大范圍推廣應(yīng)用。

SSR 與SNP 標(biāo)記方法在數(shù)據(jù)分析方面各有優(yōu)勢(shì)，SSR 標(biāo)記方法是將每份待測(cè)樣品分別與40 個(gè)位點(diǎn)依次對(duì)應(yīng)，獨(dú)立分析；SNP 標(biāo)記可以將所有檢測(cè)樣品對(duì)應(yīng)1 對(duì)引物，在1 張指紋圖中疊加分析，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)簡(jiǎn)單，更容易實(shí)現(xiàn)整合。

3 在農(nóng)作物種子檢測(cè)中的應(yīng)用

3.1 SSR 技術(shù)在農(nóng)作物檢測(cè)中的應(yīng)用王鳳格等[2]用SSR 分子標(biāo)記法構(gòu)建了中國(guó)玉米審定品種SSR 標(biāo)準(zhǔn)指紋數(shù)據(jù)庫(kù)，繪制了玉米審定品種40 對(duì)SSR 引物的等位基因分布圖，為玉米種子真實(shí)性檢測(cè)提供標(biāo)準(zhǔn)樣品參照；蓋樹(shù)鵬等[4]篩選出6 對(duì)雙親互補(bǔ)型SSR 引物，檢測(cè)6 個(gè)玉米雜交種種子純度，能準(zhǔn)確鑒定出樣品中的自交株和異型株，與田間鑒定結(jié)果差異不顯著；黃殿成等[5]從引進(jìn)人才、儀器設(shè)備、試驗(yàn)操作、檢測(cè)成本和工作效率等方面，總結(jié)種子企業(yè)應(yīng)用SSR 分子標(biāo)記法鑒定棉花品種真實(shí)性和種子純度，體現(xiàn)了SSR 分子標(biāo)記在企業(yè)經(jīng)營(yíng)管理中發(fā)揮的重要作用。截至2020 年，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒布了基于SSR 標(biāo)記的玉米、水稻、小麥、馬鈴薯等20余種作物的品種鑒定方法標(biāo)準(zhǔn)[6]，在種業(yè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。

3.2 SNP 技術(shù)在農(nóng)作物檢測(cè)中的應(yīng)用北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心開(kāi)發(fā)的SNP 芯片MaizeSNP3072[7]、MaizeSNP384[8]用于玉米品種真實(shí)性鑒定；中國(guó)水稻研究所開(kāi)發(fā)的96 個(gè)SNPs KASP 檢測(cè)和50K 個(gè)SNPs 芯片用于鑒定水稻真實(shí)性[6]；金名捺等[9]利用水稻全基因組9K SNP 芯片分析水稻栽培種黃華占和野生稻Y605，開(kāi)發(fā)特異SNP 位點(diǎn)檢測(cè)，根據(jù)基因分型，能準(zhǔn)確區(qū)分兩個(gè)品種；匡孟等[10]基于KASP技術(shù)，利用SNPline 平臺(tái)從棉花63K 全基因組芯片中篩選到26個(gè)SNP核心標(biāo)記快速檢測(cè)棉花雜交種純度。利用SNP 標(biāo)記法鑒定水稻、玉米、小麥品種真實(shí)性3項(xiàng)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)通過(guò)審定[6]，棉花和油菜、大白菜等蔬菜作物的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建正在完善中。

4 小結(jié)

SSR 和SNP 兩種標(biāo)記方法在檢測(cè)通量、數(shù)據(jù)分析和試驗(yàn)操作中各有優(yōu)勢(shì)，在不同的檢測(cè)項(xiàng)目中發(fā)揮各自的作用。李雪等[11]對(duì)11 套玉米種子雜交種和親本進(jìn)行試驗(yàn)，用40 對(duì)SSR 引物和3072 個(gè)SNP位點(diǎn)的數(shù)據(jù)比較兩種標(biāo)記方法在玉米種子真實(shí)性鑒定中的應(yīng)用，分析結(jié)果表明，這兩種方法在種子真實(shí)性鑒定方面具有較好的一致性，且這兩種標(biāo)記方法在區(qū)分品種能力和位點(diǎn)穩(wěn)定性等方面差異較小。SSR 分子標(biāo)記引物數(shù)量少，適合少量樣本檢測(cè)，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，檢測(cè)結(jié)果精確度低，熒光毛細(xì)管電泳自動(dòng)化程度高，結(jié)果精確，但儀器設(shè)備、試劑及儀器維護(hù)成本較高；SNP 分子標(biāo)記實(shí)現(xiàn)了位點(diǎn)和樣本高通量檢測(cè)，儀器操作智能化，試驗(yàn)數(shù)據(jù)易整合，但數(shù)據(jù)缺失和分型誤差頻率較高，購(gòu)置儀器、試劑和芯片定制成本高。SSR 和SNP 兩種標(biāo)記方法和檢測(cè)平臺(tái)各有優(yōu)缺點(diǎn)，今后應(yīng)積極發(fā)揮SSR 標(biāo)記的靈活性，繼續(xù)開(kāi)發(fā)SNP 技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，適應(yīng)市場(chǎng)需要。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的不斷優(yōu)化完善和檢測(cè)成本的逐漸降低，兩種標(biāo)記方法在農(nóng)作物種子檢測(cè)中將有更廣闊的應(yīng)用前景。