陰道微生態(tài)與HPV感染及宮頸病變相關(guān)性的研究進(jìn)展>

季璇，蔡云朗>

(1.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009； 2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 婦產(chǎn)科，江蘇 南京 210009)

研究[1]表明宮頸癌是全球女性第2大惡性腫瘤，僅次于乳腺癌，2018年我國(guó)新增宮頸癌患者約96 000例，占全世界新發(fā)宮頸癌的18%，其中死亡病例大約為26 000例。從癌前病變最后發(fā)展到宮頸癌是一個(gè)連續(xù)漫長(zhǎng)的過(guò)程，持續(xù)的高危型人乳頭瘤病毒(HPV)感染是其發(fā)生、發(fā)展的生物學(xué)病因，宮頸癌患者的HPV感染率高達(dá)99.7%[2]，然而，宮頸上皮細(xì)胞的病變并不是由HPV單獨(dú)感染直接引起的，還需要其他因素的協(xié)同和促進(jìn)。1889年英國(guó)醫(yī)師Stephen Paget提出著名的“種子- 土壤學(xué)說(shuō)”[3]，認(rèn)為腫瘤的轉(zhuǎn)移由腫瘤細(xì)胞的主動(dòng)攻擊及“土壤”(靶器官)共同決定。病毒感染也同樣如此，HPV是否定植并且破壞宮頸黏膜，從而一步步演變?yōu)閷m頸癌，不只是由病毒的毒力所決定，陰道微生態(tài)(“土壤”)的平衡狀態(tài)也至關(guān)重要。因此，探討陰道微生態(tài)與HPV感染及宮頸病變的相關(guān)性和發(fā)展機(jī)制，尋找新的臨床預(yù)警指標(biāo)，可以為HPV感染和癌前病變的防治提供新的思路，從而有效降低宮頸癌的發(fā)病率。作者擬針對(duì)陰道微生態(tài)與HPV感染及宮頸病變的相關(guān)性研究進(jìn)展作一綜述。

1 HPV特性及其分型

1.1 HPV特性及致病機(jī)制

HPV是無(wú)包膜的雙鏈DNA病毒，編碼8種主要蛋白質(zhì)，6種位于“早期識(shí)別區(qū)域”(E1、E2、E4、E5、E6和E7)，兩種位于“晚期識(shí)別區(qū)域”(L1和L2)。E1和E2參與病毒DNA復(fù)制和早期轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)；E4有助于病毒從上皮表面逃逸；E5、E6和E7是病毒致癌基因，其表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞永生化和轉(zhuǎn)化。E6和E7是兩種病毒癌蛋白，它們分別使兩種細(xì)胞腫瘤抑制蛋白P53和PRb失活，導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂，使得細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，從而發(fā)展為癌細(xì)胞，演變成宮頸癌[4]。

1.2 HPV分型

目前已知的HPV型別有200多種，根據(jù)HPV型別與子宮頸癌發(fā)生的危險(xiǎn)性高低分為低危型HPV和高危型HPV。其中高危型中的16、18型與宮頸癌的聯(lián)系最為緊密，此外，在亞洲國(guó)家中58、52型引起的宮頸癌所占比例也不容忽視[5- 6]。

2 HPV感染與宮頸病變

早在1983年，有研究人員[7]就利用原位雜交的方法在4例宮頸癌患者的腫瘤細(xì)胞基因組中檢測(cè)到了HPV- 11相關(guān)的DNA片段，首次提出HPV是導(dǎo)致宮頸癌元兇之一的假說(shuō)，這一假說(shuō)后來(lái)也被多位學(xué)者證實(shí)。WHO在1995年宣布HPV是導(dǎo)致宮頸癌的首要因素。HPV病毒感染的早期發(fā)現(xiàn)及其與宮頸癌病情進(jìn)展的關(guān)系，也逐漸得到了高度重視。2000年Sellors等[8]研究表明，HPV的感染率隨著宮頸病變級(jí)別的升高呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)。研究[9]表明，絕大多數(shù)(90%以上)感染的患者可依靠自身免疫力自行清除，少部分(5%～10%)患者因各種原因發(fā)展為持續(xù)感染，從而一步步演變成宮頸癌。

3 陰道微生物群與HPV感染及宮頸病變的關(guān)系

3.1 陰道微生物結(jié)構(gòu)

健康女性生殖道內(nèi)寄居著多種微生物，與宿主和周圍環(huán)境相互制約與協(xié)調(diào)，維持著動(dòng)態(tài)平衡關(guān)系[10]。Ravel等[11]使用基于Roche 454 FLX的細(xì)菌16S rRNA基因測(cè)序，對(duì)396個(gè)種族不同的育齡婦女的陰道樣本進(jìn)行了分析，總共確定了282個(gè)分類單元，并且通過(guò)分層分類學(xué)將每個(gè)女性的陰道微生物譜分為5種“社區(qū)狀態(tài)類型”(CST)。CST Ⅰ以卷曲乳桿菌為主；CST Ⅱ以加氏乳桿菌為主；CST Ⅲ以惰性乳桿菌為主；CST Ⅳ通常不含乳桿菌屬，而是富含加德納菌屬、普氏菌屬、阿托波氏菌等厭氧菌，陰道pH通常>4.5，被認(rèn)為與細(xì)菌性陰道炎相關(guān)[12]；CST Ⅴ以詹氏乳桿菌為主，由較多的厭氧菌組成。

3.2 陰道微生物群與HPV感染的關(guān)系

正常情況下，陰道微生物群中以產(chǎn)過(guò)氧化氫(H2O2)的乳酸桿菌為優(yōu)勢(shì)菌，一方面，乳酸桿菌可通過(guò)產(chǎn)生乳酸和H2O2來(lái)維持陰道的酸性環(huán)境；另一方面，乳酸桿菌可分泌H2O2、細(xì)菌素及其他抗生物因子，從而抑制或殺滅病原微生物，同時(shí)通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)排斥機(jī)制阻止致病微生物黏附于陰道上皮細(xì)胞，維持陰道微生態(tài)平衡[13]。若乳酸桿菌豐度下降，不再成為優(yōu)勢(shì)菌，其他菌群，如加德納菌、普氏菌屬、纖毛菌屬等厭氧菌屬數(shù)量增多并轉(zhuǎn)為優(yōu)勢(shì)菌群，則陰道微生態(tài)失衡，導(dǎo)致病原微生物入侵。

早在1994年就有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，HR- HPV感染與陰道微生物群的失調(diào)存有一定的聯(lián)系，陰道乳酸桿菌減少、厭氧菌過(guò)度生長(zhǎng)，會(huì)增加高危型HPV的表達(dá)[14]。近年來(lái)，有越來(lái)越多的國(guó)內(nèi)外學(xué)者在這方面進(jìn)行了更深層次的研究。Lee等[15]首次利用高通量測(cè)序方法對(duì)韓國(guó)雙胞胎女性HPV感染對(duì)陰道微生物群組的影響進(jìn)行了橫斷面的研究，觀察到HPV陽(yáng)性的女性陰道微生物群更具多樣性，而乳酸桿菌屬則明顯減少。此外，他們確定了纖毛菌屬為HPV感染的標(biāo)志性微生物，且在9對(duì)單卵雙生的雙胞胎中，HPV陽(yáng)性者惰性乳桿菌比例較未感染HPV的雙胞胎姐妹有明顯的下降(P=0.03)。Brotman等[16]對(duì)北美32名性活躍的絕經(jīng)前婦女進(jìn)行了歷時(shí)16周的縱向研究，在共計(jì)930個(gè)陰道樣本中觀察到CST類型與HPV的感染及持續(xù)時(shí)間顯著相關(guān)(P=0.008)，CST Ⅲ、Ⅳ的女性HPV陽(yáng)性率更高，分別為71%和72%，以加氏乳桿菌為主導(dǎo)的CST Ⅱ可能與急性HPV感染的最快速清除有關(guān)，提出加氏乳桿菌是維持宮頸健康的潛在治療物種。古萍[17]等對(duì)128名女性進(jìn)行隨機(jī)對(duì)照研究，發(fā)現(xiàn)HPV陽(yáng)性者陰道乳酸桿菌計(jì)數(shù)及乳酸桿菌所占陰道細(xì)菌比例較HPV陰性者低,并且隨著乳酸桿菌數(shù)量的增多HPV- DNA載量逐漸減少，且兩組陰道惰性乳桿菌、加氏乳桿菌、卷曲乳桿菌數(shù)量比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？盗醄18]等通過(guò)探討高級(jí)別宮頸鱗狀上皮內(nèi)瘤變 (HSIL) 錐切手術(shù)前后陰道菌群構(gòu)成的差異發(fā)現(xiàn)，HPV陽(yáng)性患者術(shù)后HPV轉(zhuǎn)陰后陰道菌群出現(xiàn)了向常見(jiàn)陰道優(yōu)勢(shì)菌屬轉(zhuǎn)變的趨勢(shì)，由原來(lái)的惰性乳桿菌轉(zhuǎn)變?yōu)橐跃砬闂U菌為優(yōu)勢(shì)菌。駱?lè)频萚19]通過(guò)分析39例高危型HPV感染患者的陰道菌群發(fā)現(xiàn),加德納菌屬在HPV感染組低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變 (LSIL) 型患者中為優(yōu)勢(shì)菌, 乳桿菌屬為HPV陰性者優(yōu)勢(shì)菌。提出高危型HPV感染者陰道菌群多樣性增加，乳酸桿菌豐度下降，加德納菌屬為L(zhǎng)SIL與HPV陰性女性的差異菌, 乳桿菌屬為HPV陰性女性陰道特征菌?？傊?，結(jié)合國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究，可得出HPV陽(yáng)性者陰道內(nèi)乳酸桿菌的數(shù)量明顯下降，除乳桿菌屬之外的其他微生物群種類及數(shù)量增多。

3.3 陰道微生物群與宮頸病變嚴(yán)重程度的關(guān)系

繼研究發(fā)現(xiàn)陰道微生物群與HPV感染的關(guān)系后，研究者也陸續(xù)對(duì)不同程度的宮頸病變患者的陰道微生物群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。Mitra等[20]對(duì)英國(guó)的169名婦女進(jìn)行了研究(20名正常對(duì)照，52例LSIL，92例HSIL和5例浸潤(rùn)性宮頸癌)，結(jié)果顯示隨著宮頸病變程度的加重，陰道微生物群的多樣性增加，而乳酸桿菌的相對(duì)豐度降低，隨著疾病嚴(yán)重程度的增加，CST Ⅳ的患病率也逐步增加，LSIL、HSIL和浸潤(rùn)性宮頸癌的CST Ⅳ患病率分別高出2、3、4倍。此外，與LSIL相比，HSIL患者的纖毛菌屬、厭氧球菌和消化鏈球菌等明顯增多，而詹氏乳桿菌減少。隨后有研究人員[21]對(duì)墨西哥的32名婦女(20例正常對(duì)照、4例宮頸上皮內(nèi)瘤變和8例宮頸癌)的陰道微生物群和陰道黏膜細(xì)胞因子進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)隨著病變嚴(yán)重程度的增加纖毛菌屬和梭狀桿菌的數(shù)量相對(duì)增多，且梭狀桿菌數(shù)量的增加與IL- 4和TGF- 1βmRNA的表達(dá)水平增高有關(guān)，認(rèn)為可能是梭狀桿菌抑制陰道局部免疫應(yīng)答，促進(jìn)HPV免疫逃逸和宮頸病變的發(fā)展。然而這兩項(xiàng)研究均為觀察性研究，缺乏縱向研究數(shù)據(jù)，因此只能證明與疾病狀態(tài)相關(guān)，而不能確定因果關(guān)系。盡管多項(xiàng)研究已表明某些陰道微生物群可能會(huì)增加暫時(shí)性和持續(xù)性HPV感染的機(jī)會(huì)，但仍需要更多的工作來(lái)研究宿主、微生物群、病毒感染與癌變之間的復(fù)雜關(guān)系，為穩(wěn)定陰道微生物群結(jié)構(gòu)的治療策略挖掘潛力，使之能夠有效抵御病原微生物的入侵，這將有更深遠(yuǎn)的臨床意義。

3.4 陰道微生物群介導(dǎo)的HPV感染的潛在機(jī)制

目前尚缺乏明確的相關(guān)機(jī)制的研究，可能的機(jī)制有：(1) 陰道乳酸桿菌通過(guò)分解陰道黏膜上皮內(nèi)的糖原產(chǎn)生乳酸，降低陰道pH值，陰道的酸性環(huán)境可抑制HPV的感染；(2) 乳酸桿菌可產(chǎn)生H2O2促使蛋白抑制劑與其結(jié)合，抑制HPV的復(fù)制；(3) 陰道乳酸桿菌可生產(chǎn)細(xì)菌素等抑制物，來(lái)預(yù)防細(xì)菌性陰道病相關(guān)細(xì)菌的定植，從而維護(hù)宮頸上皮屏障功能，有效抑制HPV進(jìn)入基底角質(zhì)形成細(xì)胞；(4) 當(dāng)與BV相關(guān)的厭氧菌定植時(shí)，這些細(xì)菌會(huì)產(chǎn)生酶和代謝產(chǎn)物，這可能會(huì)破壞宮頸上皮屏障，從而促進(jìn)HPV進(jìn)入。同時(shí)，陰道微生物群還可以通過(guò)作用于幾種細(xì)胞途徑，從而影響宮頸局部免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致HPV持續(xù)感染以及宮頸病變進(jìn)展[17,22- 23]。

4 陰道局部免疫系統(tǒng)與HPV感染的關(guān)系

4.1 HPV感染后的免疫應(yīng)答

研究[24]表明，大部分女性能夠通過(guò)自身免疫系統(tǒng)的監(jiān)測(cè)和防御來(lái)自行清除HPV，避免HPV的持續(xù)性感染。人體免疫系統(tǒng)通常分為固有免疫和適應(yīng)性免疫兩種類型:固有免疫在HPV感染早期發(fā)揮非特異性作用；適應(yīng)性免疫應(yīng)答為機(jī)體防御HPV的第2道防線，可特異性識(shí)別HPV，防止HPV的再感染。固有免疫與適應(yīng)性免疫相互協(xié)調(diào)，共同作用，HPV的防御和有效清除與機(jī)體正常的免疫功能密不可分。因此，若陰道局部免疫屏障受到破壞，則會(huì)增加HPV的易感性和持續(xù)感染率。

4.2 陰道局部固有免疫與HPV感染及宮頸病變的相關(guān)性

當(dāng)病原微生物突破機(jī)體的物理屏障，如皮膚、黏膜等時(shí)，固有免疫可通過(guò)Toll樣受體識(shí)別病原微生物，從而激活樹突狀細(xì)胞(DCs)或巨噬細(xì)胞，并且可同時(shí)調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫[25]。DCs是目前發(fā)現(xiàn)的抗原提呈功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，而DCs中尤其以朗格漢斯細(xì)胞(LC)的抗原提呈能力最為突出。江大瓊[26]等研究發(fā)現(xiàn)，隨著宮頸病變程度加重LC數(shù)量逐漸增多，LC數(shù)量HPV16陽(yáng)性組比陰性組少(P=0.011)，提示當(dāng)感染HPV16后局部的LC數(shù)量將會(huì)減少，這將會(huì)限制啟動(dòng)免疫應(yīng)答，加重HPV16感染甚至發(fā)生持續(xù)感染。巨噬細(xì)胞功能弱于DCs，可分為M1型和M2型，M1型巨噬細(xì)胞主要分泌IL- 1、IL- 6、IFN- γ、TNF- α等細(xì)胞因子殺傷宿主細(xì)胞。自然殺傷細(xì)胞也對(duì)抵抗HPV感染起著重要作用，可分為非多樣性自然殺傷T細(xì)胞(iNKT)與多樣性自然殺傷T細(xì)胞(nNKT)。CD1d作為非典型的MHC- Ⅰ類分子可以將抗原遞呈給iNKT，促使其分泌多種細(xì)胞因子，包括IFN- γ、IL- 4、IL- 10等，以抵抗病毒感染。Hu等[27]研究表明，在HPV陽(yáng)性宮頸組織中觀察到iNKT顯著增加，尤其是在CINⅡ- Ⅲ中，并且隨著宮頸病變程度加重HPV陽(yáng)性宮頸組織中的IFN- γ表達(dá)也增加，認(rèn)為從HPV感染到發(fā)展為CIN的過(guò)程中，宮頸組織中iNKT的聚集表明其可能在抑制免疫中起重要作用，IFN- γ表達(dá)可能與HPV感染狀態(tài)有關(guān)。

4.3 陰道局部適應(yīng)性免疫與HPV感染及宮頸病變的相關(guān)性

T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫是抗HPV感染最重要的一種免疫應(yīng)答方式。研究[28- 29]表明，在高危型HPV感染合并或不合并宮頸病變的患者中，CD4+/CD8+T細(xì)胞的值均表現(xiàn)為降低，可以自行緩解的CINⅠ患者CD4+T細(xì)胞的表達(dá)及CD4+/CD8+T細(xì)胞的值均顯著高于進(jìn)展的CINⅡ和CINⅢ的患者，CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞<1的宮頸癌患者HPV陽(yáng)性率遠(yuǎn)高于比值≥1的患者。

在發(fā)現(xiàn)T淋巴細(xì)胞亞群的失調(diào)與HPV感染及宮頸病變關(guān)系的基礎(chǔ)上，也有越來(lái)越多的國(guó)內(nèi)外學(xué)者從宮頸局部的細(xì)胞因子表達(dá)水平的層面進(jìn)行了研究，有研究對(duì)宮頸局部T細(xì)胞亞群和炎癥因子改變對(duì)HPV感染的影響進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)隨著宮頸病變程度的加重，宮頸局部CD4+/CD8+T細(xì)胞及Th1/Th2細(xì)胞的值均逐漸降低；IFN- γ、IL- 2的含量與HPV感染呈負(fù)相關(guān)，乳酸桿菌的陰性率、IL- 4的含量與HPV感染呈正相關(guān)，且IFN- γ、IL- 2的減少及IL- 4的增多都是HPV感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[30]。Li等[31]對(duì)117例持續(xù)高危型HPV感染女性(43例慢性宮頸炎、35例LSIL、39例HSIL)的宮頸細(xì)胞因子(包括IL- 2、IL- 4、IL- 6、IL- 10、IL- 17A、TNF、IFN- γ)的表達(dá)水平進(jìn)行了研究，并根據(jù)IL- 2和IL- 6的表達(dá)水平進(jìn)行細(xì)胞因子評(píng)分，結(jié)果顯示疾病嚴(yán)重程度與IL- 6水平呈正相關(guān)，與IL- 2水平呈負(fù)相關(guān)。高細(xì)胞因子評(píng)分的HPV陽(yáng)性患者3年內(nèi)發(fā)生HSIL的風(fēng)險(xiǎn)增加，風(fēng)險(xiǎn)比為3.12。其中通過(guò)對(duì)HSIL組的細(xì)胞因子評(píng)分和TCT檢查結(jié)果的比較發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子評(píng)分的診斷敏感性、特異性、Youden指數(shù)以及陽(yáng)性和陰性預(yù)測(cè)值均優(yōu)于TCT。王小花等[32]研究也發(fā)現(xiàn)，HPV陽(yáng)性者Th17細(xì)胞、IL- 17、IL- 6、IL- 4和TGF- β的表達(dá)水平均明顯高于HPV陰性者。Winkle等[33]利用人類3- D陰道或?qū)m頸組織來(lái)探索IL- 36γ在宿主抵御人類女性生殖道病原體中的可能作用，將陰道或?qū)m頸上皮細(xì)胞暴露于病毒或細(xì)菌，并測(cè)定IL- 36γ及其受體的誘導(dǎo)和調(diào)控，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL- 36γ可通過(guò)增加基因表達(dá)使自身及其受體自我擴(kuò)增，并促進(jìn)其他炎癥信號(hào)通路來(lái)刺激免疫應(yīng)答，防止病原微生物的入侵和定植。這也是首次證明女性陰道上皮細(xì)胞中存在IL- 36γ及其受體并在此被病原微生物誘導(dǎo)分化的報(bào)道，證明IL- 36γ是微生物入侵上皮細(xì)胞后免疫激活的驅(qū)動(dòng)因素，在女性生殖道的宿主防御中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。IL- 36γ是一種新的促炎因子，屬于IL- 1細(xì)胞因子家族，呂全省等[34]研究發(fā)現(xiàn)，IL- 36γ可以與IL- 12協(xié)同刺激CD8+T淋巴細(xì)胞的作用，增強(qiáng)其細(xì)胞因子分泌功能。此外，IL- 36γ可以作為免疫佐劑以誘導(dǎo)增強(qiáng)病毒特異性的CD4+T和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，并可促進(jìn)TNF和INF- γ的產(chǎn)生。但目前關(guān)于IL- 36γ與HPV感染及宮頸病變程度的相關(guān)性的研究尚且不多，還需臨床進(jìn)一步驗(yàn)證。

5 總結(jié)與展望

HPV感染是有過(guò)性生活的女性常見(jiàn)的一種病毒感染，但有90%以上的健康女性可自行清除病毒，陰道微生態(tài)的平衡是機(jī)體抵御HPV感染和定植的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，陰道微生態(tài)的改變主要包括陰道內(nèi)微生物群的改變、陰道局部免疫屏障的破壞等，一方面微生態(tài)平衡被打破，可導(dǎo)致HPV趁機(jī)入侵上皮細(xì)胞，造成HPV感染；另一方面可促進(jìn)HPV的持續(xù)感染和宮頸病變的發(fā)生。與此同時(shí)，HPV的感染也會(huì)導(dǎo)致陰道微生態(tài)紊亂，兩者互為因果，相互影響。因此，維持陰道微生態(tài)的平衡有助于防止HPV感染及宮頸病變的發(fā)生，探討陰道微生態(tài)與宮頸HPV感染及宮頸病變的相關(guān)性和發(fā)展機(jī)制，尋找新的臨床預(yù)警指標(biāo)，對(duì)指導(dǎo)臨床治療HPV感染及宮頸病變至關(guān)重要，從根本上預(yù)防宮頸癌的發(fā)生。