胡雪松,衛(wèi)佳楠,王洪斌,吳麗娜,王凱,孫夕林*
腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)是腫瘤細(xì)胞及其生活的內(nèi)環(huán)境,不僅包括腫瘤細(xì)胞本身,還包括周圍的各種細(xì)胞及生物分子,在研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展和生物學(xué)行為中起著重要作用。19世紀(jì)80年代Paget[1]首次提出“種子-土壤”理論,TME 作為為腫瘤生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)支持的土壤,是腫瘤生理結(jié)構(gòu)和功能的重要組成部分,為腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為提供必需的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境[2]。分子影像學(xué)(molecular imaging)是在活體狀態(tài)下,應(yīng)用影像學(xué)方法對(duì)人或動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)胞和分子水平的生物學(xué)過程進(jìn)行成像、定性和定量的研究。分子影像學(xué)作為一種多學(xué)科交叉、融合的學(xué)科,是醫(yī)學(xué)影像學(xué)的發(fā)展方向和未來,在監(jiān)測(cè)腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中TME 內(nèi)的一些分子改變及環(huán)境變化方面具有巨大研究潛力,包括腫瘤細(xì)胞內(nèi)pH改變[3-5]、大量新生血管生成[6-8]、腫瘤組織乏氧[9-11]、酶和蛋白質(zhì)的異常表達(dá)[12-14]等,并能夠做出相應(yīng)特異性診斷,判定預(yù)后,監(jiān)測(cè)療效和腫瘤復(fù)發(fā)等情況,對(duì)基礎(chǔ)及臨床研究具有重大意義。
磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)具有高空間分辨率和深組織穿透能力,特別適合用于軟組織高分辨率成像[15-16]。與此同時(shí),19F 原子高自旋量子數(shù)、高靈敏度(H 質(zhì)子的83%,僅次于H)、廣泛化學(xué)位移和可忽略的人體背景信號(hào)等特點(diǎn)引起了研究者的興趣[17-19]。將19F-MRI與分子影像相結(jié)合,利用氟原子高磁敏感率、高生物安全性及高M(jìn)R 成像能力的特點(diǎn),可在分子水平上實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)各組織器官的生物學(xué)行為。
納米醫(yī)學(xué)是將納米顆粒應(yīng)用于疾病診斷和治療的一門學(xué)科,利用納米技術(shù)可將多種材料如金屬[20-22]、硅及二氧化硅[23-26]等應(yīng)用于構(gòu)建這類納米顆粒。迄今為止,已有大量納米藥物被設(shè)計(jì)用于治療各種疾病,尤其是針對(duì)于腫瘤的治療[27]。納米顆粒尺寸較小,通常在腫瘤組織的滯留和穿透方面發(fā)揮重要作用[28]。隨著納米技術(shù)的不斷發(fā)展,已設(shè)計(jì)出大量針對(duì)于TME 改變的智能環(huán)境響應(yīng)型納米分子成像探針,這些探針能精準(zhǔn)識(shí)別組織和器官的微小環(huán)境變化,使分子構(gòu)象發(fā)生改變,并通過體外分子水平19F-MR 成像方式,早期識(shí)別異常。由于TME復(fù)雜多變,針對(duì)腫瘤pH、酶、各種離子、氧化還原變化等特性的TME 響應(yīng)型納米分子成像探針的研究成為熱點(diǎn),筆者對(duì)TME響應(yīng)型19F-MR納米分子成像探針的特點(diǎn)及應(yīng)用進(jìn)行討論,以期為新型探針的制備提供理論依據(jù)。
相對(duì)于正常組織(pH 為7.35~7.45),TME 的pH 明顯降低,范圍在6.5~6.9 之間,這與腫瘤組織的糖酵解代謝上調(diào)以及乳酸生成增加有關(guān)[3]。近年來,針對(duì)TME 中pH 改變而設(shè)計(jì)的pH 響應(yīng)型19F-MR 納米分子成像探針的研究成為熱點(diǎn)。Chen等[3]設(shè)計(jì)合成一種新型納米分子成像探針,由于葉酸受體在腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá),因此將葉酸偶聯(lián)到金納米粒子(AuNPs)表面,AuNPs再通過對(duì)酸不穩(wěn)定的腙鍵共價(jià)偶聯(lián)到熒光功能化的介孔二氧化硅納米顆粒(FMSNs)上,得到Au-FMSNs,再將19F 對(duì)比劑六氟苯(C6F6)封裝于FMSNs 中,最終制得pH 響應(yīng)型19F-MR納米分子成像探針C6F6@Au-FMSNs。對(duì)于pH為中性(pH=7.4)的正常細(xì)胞或PBS 溶液,pH 觸發(fā)的19F 生物傳感器未被激活,19F-MR 呈現(xiàn)低信號(hào)。而在pH 為酸性的TME 中,由于葉酸的主動(dòng)靶向,探針能夠順利進(jìn)入腫瘤細(xì)胞,腙鍵在細(xì)胞內(nèi)酸性pH中被裂解,導(dǎo)致FMSNs 釋放19F 對(duì)比劑,19F 分子由束縛態(tài)變?yōu)橐后w狀態(tài),弛豫時(shí)間有明顯改變,T1 大大縮短,19F-MR 信號(hào)明顯增強(qiáng)。通過對(duì)19F-MR 信號(hào)變化的監(jiān)測(cè),間接反映出TME 中pH值的變化,對(duì)腫瘤早期診斷和定位具有重要意義。
Zhu 等[29]將二甲基咪唑四氟硼酸鹽BMMIBF4封裝在可溶于酸性溶液的聚合物中,獲得pH 響應(yīng)型19F-MR 納米分子成像探針。BMMIBF4被封裝后,19F信號(hào)消失,19F NMR峰明顯降低,說明BMMIBF4完全封裝于聚合物中(圖1)。將該探針在不同pH 條件下進(jìn)行MR成像,結(jié)果顯示,在pH=7.4時(shí)被封裝的BMMIBF4的T2*非常短(T2*<TE),幾乎沒有19F信號(hào);而當(dāng)pH為6.4和5.0時(shí),19F信號(hào)隨時(shí)間增加逐漸增強(qiáng),提示pH 觸發(fā)的氟劑釋放導(dǎo)致MRI T2*延長(zhǎng),19F-MR信號(hào)開啟,且pH 5.0比pH 6.4的信噪比更高(達(dá)到188)。該探針的pH 響應(yīng)特性能使其在細(xì)胞和分子水平對(duì)TME中pH改變做出響應(yīng),并通過MRI等成像手段對(duì)19F信號(hào)進(jìn)行監(jiān)測(cè),及早察覺TME改變并做出相應(yīng)治療策略。
相對(duì)于正常細(xì)胞,腫瘤細(xì)胞內(nèi)離子濃度尤其是Na+和Cl-濃度明顯升高[30-34]。Smith 等[33]研究結(jié)果也表明,與正常肝細(xì)胞相比,肝癌細(xì)胞中Na+和Cl-濃度增加了兩倍多。Zhang 等[35]研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)離子強(qiáng)度的變化會(huì)導(dǎo)致離子反應(yīng)聚合物在溶液中的構(gòu)象和遷移率發(fā)生改變,在鹽溶液中共聚物OEGMA-co-TFEA 中的OEGMA 側(cè)鏈上的醚氧原子可與Na+緊密結(jié)合,由于高氟化聚合物片段的聚集,TME中離子含量明顯升高,導(dǎo)致這些基團(tuán)的T2弛豫時(shí)間非常短,19F-MR信號(hào)明顯降低。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn),腫瘤細(xì)胞中的Na+濃度大約為癌前和正常乳腺細(xì)胞的3 倍,此外,在人乳腺癌MCF-7 腫瘤細(xì)胞中得到的19F NMR T2 值(82.3 ms)遠(yuǎn)低于正常細(xì)胞T2 值(124.2 ms)。因此,這些離子聚合物納米分子成像探針的19F-MR T2可以作為一種非侵入性檢測(cè)指標(biāo),對(duì)TME中離子改變做出實(shí)時(shí)響應(yīng)。
酶涉及多種人類疾病,如癌癥、自身免疫性疾病等,在藥物開發(fā)和疾病診斷方面具有重要研究意義,對(duì)哺乳動(dòng)物酶活性的檢測(cè)和成像亦可作為生物成像的最終目標(biāo)之一[12]。半胱天冬酶-3 和-7 (Caspase-3 和-7)是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志,以酶原形式在細(xì)胞內(nèi)胞漿中高表達(dá),Caspase-3/7活性被用作評(píng)價(jià)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的抗腫瘤治療的生物標(biāo)志物,且在凋亡早期表達(dá)情況明顯高于凋亡晚期及死細(xì)胞。利用這一特性,Akazawa等[12]設(shè)計(jì)了高度功能化且具有19F信號(hào)響應(yīng)開關(guān)的納米分子成像探針FLAME-DEVD 2,其中FLAME 由液體全氟碳核和堅(jiān)固的二氧化硅外殼組成;DEVD 2 是Caspase-3/7 酶的底物肽序列,該探針表面通過DEVD 2連接Gd3+復(fù)合物,基于其順磁弛豫增強(qiáng)效應(yīng)(proton relaxation enhancement,PRE),即順磁分子中的未成對(duì)電子與原子核之間的偶極-偶極相互作用引起原子核弛豫速率加快的現(xiàn)象[36],探針中PFCs 的T2 值被有效抑制,19F-MR 信號(hào)減弱。而在腫瘤組織微環(huán)境中,Caspase-3/7 酶高表達(dá),納米探針進(jìn)入后,Caspase-3/7 酶可裂解底物肽DEVD 2,使Gd3+復(fù)合物與FLAME 分離,淬滅作用消失,T2值延長(zhǎng),19F-MR信號(hào)顯著增強(qiáng)。
酯酶是一類廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)領(lǐng)域的酶,具有催化酯類水解的功能,在腫瘤組織中高表達(dá),通過調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)的活性參與物質(zhì)代謝、運(yùn)輸和基因表達(dá)等生物過程[37-38]?;诩{米分子成像探針的酶響應(yīng)特性,Guo 等[39]設(shè)計(jì)了一種酶響應(yīng)型19F-MR 上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針Gd3+-NaYF4:Yb3+/Er3+,用于檢測(cè)TME 中磷脂酶A2 (PLA2)活性。該探針以全氟-15-冠-5-醚(PFCE)為疏水核心,配以磷脂殼層,基于19F-MR 信號(hào)T2 的PRE 效應(yīng),當(dāng)一個(gè)氟化基團(tuán)通過酶底物與Gd3+配合物連接時(shí),19F-MR 信號(hào)被Gd3+淬滅。PLA2 在多種病理?xiàng)l件下存在[40-42]。因此這些納米分子成像探針進(jìn)入TME后,由于PLA2的含量增多,導(dǎo)致磷脂殼降解,19F核的流動(dòng)性增加,氟原子的T2 弛豫時(shí)間延長(zhǎng),19F NMR顯示91.9 ppm處單線態(tài)峰的信號(hào)顯著增加,19F-MR 信號(hào)開啟,并且在5.0~200 U/L 范圍內(nèi)隨PLA2含量的增加,19F-MRI信號(hào)呈線性增強(qiáng)趨勢(shì)。
腫瘤細(xì)胞的快速生長(zhǎng)將導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量急劇增多、體積迅速增大,從而導(dǎo)致組織供血不足,進(jìn)而引發(fā)腫瘤細(xì)胞乏氧及酸性微環(huán)境的產(chǎn)生[9]。針對(duì)腫瘤組織乏氧的特點(diǎn),Kadakia 等[43]設(shè)計(jì)一種可同時(shí)利用19F-MR和熒光兩種手段檢測(cè)細(xì)胞缺氧狀況的雙模態(tài)納米分子成像探針CuATSMF3-Fl。正常組織中由于Cu2+存在導(dǎo)致19F 和熒光信號(hào)淬滅,探針在19F NMR 譜中未出現(xiàn)峰值,無19F-MR 信號(hào)產(chǎn)生。而在低氧的TME 中,Cu2+被還原為Cu+,淬滅作用消失,相應(yīng)19F-MR和熒光信號(hào)在納米探針的配體支架脫膜時(shí)開啟,在19F NMR 譜圖中70.2 ppm處可觀察到尖銳的峰,19F-MR 和熒光信號(hào)均明顯增強(qiáng)。利用該納米分子成像探針的還原響應(yīng)特性結(jié)合19F-MR成像通過對(duì)TME的檢測(cè)能夠鑒別出正常細(xì)胞和乏氧細(xì)胞,早期識(shí)別低氧腫瘤,實(shí)現(xiàn)腫瘤早期診斷及治療。
Tang 等[44]設(shè)計(jì)并合成一種兩親性氧化還原反應(yīng)響應(yīng)型19F 聚合物和近紅外吸收吲哚箐綠(ICG)分子自組裝的級(jí)聯(lián)多響應(yīng)型19F NMR 納米分子成像探針1-ICG NPs。探針含有19F 基團(tuán),通過可被還原裂解的二硫鍵連接到聚乙二醇上。由于自組裝限制,19FNMR 未檢測(cè)到峰值;而當(dāng)1-ICG NPs 溶液與還原型谷胱甘肽共同孵育后,二硫鍵斷裂,19F NMR 顯示在62.7 ppm 處有19F 峰出現(xiàn)并逐漸升高,信噪比呈不斷增加趨勢(shì),隨后在外部施加808 nm的激光治療,19F NMR出現(xiàn)更高、更尖銳的峰,出現(xiàn)明顯的第二次19F-MR 信號(hào)放大。級(jí)聯(lián)過程產(chǎn)生的最大信噪比約提高64 倍。利用該納米分子成像探針的分步雙級(jí)信號(hào)激活放大響應(yīng)特性,可有效提高19F-MR對(duì)TME的診斷靈敏度。
隨著納米技術(shù)的不斷發(fā)展,研究者們?cè)O(shè)計(jì)研發(fā)出種類繁多的智能環(huán)境響應(yīng)型納米分子成像探針,這些納米分子成像探針具有特異靶向性、高信噪比及原位顯示深部組織等優(yōu)勢(shì),特別是,在其合成過程中加入19F 小分子核團(tuán),這類新型納米探針在腫瘤復(fù)雜微環(huán)境改變的特定刺激下,構(gòu)象發(fā)生改變,19F核團(tuán)暴露,從而使19F-MR 信號(hào)明顯升高,最終達(dá)到19F-MR 腫瘤微環(huán)境分子成像的目的。同時(shí),隨著一些硬件軟件技術(shù),如雙1H/19F 射頻線圈和超快脈沖序列的不斷研發(fā),19F-MR 的精度和靈敏度得到極大提高,對(duì)氟信號(hào)的檢測(cè)敏感度更高。但是,TME 復(fù)雜多樣,變化不盡相同,智能環(huán)境響應(yīng)型19F-MR 納米分子成像探針合成過程中又涉及多種級(jí)聯(lián)反應(yīng),設(shè)計(jì)及操作步驟復(fù)雜,這都為研發(fā)性能優(yōu)越的智能環(huán)境響應(yīng)型19F-MR 納米分子成像探針帶來了巨大的挑戰(zhàn)。但相信不久的將來,通過研究者們不斷努力,這些瓶頸問題一定會(huì)被逐一攻克,使基于智能環(huán)境響應(yīng)型納米探針的腫瘤19F-MR 微環(huán)境分子成像能夠在體敏感地針對(duì)TME變化做出精準(zhǔn)監(jiān)測(cè),從而為TME分子水平在體動(dòng)態(tài)可視化、研究TME 分子機(jī)制、及時(shí)研發(fā)全新的診斷及治療策略開辟全新的技術(shù)方法和途徑。
作者利益沖突聲明:全體作者均聲明無利益沖突。