重癥監(jiān)護(hù)室患者及物表中分離的碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌分子流行病學(xué)與耐藥機(jī)制分析

陳 濤 唐 嬌 杜晶晶 劉小花 陳 靜

成都市新都區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川成都 610500

由于碳青霉烯類抗菌藥物的大量使用，碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）也開(kāi)始出現(xiàn)，并在全球范圍內(nèi)迅速播散，成為公共衛(wèi)生所面臨的重大威脅[1]。CRKP 除對(duì)以亞胺培南、美羅培南為代表的碳青霉烯類抗菌藥物耐藥外，對(duì)青霉素類、頭孢菌素類、氨基糖苷類、喹諾酮類抗菌藥物也具有高度耐藥性，呈現(xiàn)多重耐藥的現(xiàn)象[2]。成都市新都區(qū)人民醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）微生物實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)顯示，2019 年7 月至2020 年6 月從我院分離到的CRKP 菌株99%均來(lái)自于醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室（intensive care unit，ICU）。醫(yī)院感染管理科、臨床微生物室立即對(duì)我院ICU 環(huán)境物表進(jìn)行了大量的采樣檢測(cè)，結(jié)果在ICU 一個(gè)聽(tīng)診器表面分離到1 株CRKP菌株。本研究對(duì)我院ICU 病房患者及物表中收集的29 株CRKP 的耐藥性與耐藥機(jī)制及同源性進(jìn)行分析，為臨床合理用藥和醫(yī)院感染控制提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 收集我院2019 年7 月至2020 年6 月ICU 病房患者及物表中分離的CRKP 非重復(fù)菌株29 株（患者28 株，物表1 株），作為研究對(duì)象。

1.1.2 儀器與試劑 貝克曼MicroScan WalkAway40 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏分析儀、上海力申Heal Force HPsafe1200LC 生物安全柜、上海力申HF160W CO2培養(yǎng)箱、BIO-RAD Molecular 凝膠成像系統(tǒng)、ABI 3500dx 基因分析儀、Millipore 純水儀、Oxoid 藥敏試驗(yàn)紙片；成都瑞琦哥倫比亞血平板；鄭州安圖MH 瓊脂平板等。

1.2 研究方法

1.2.1 CRKP 菌株鑒定及藥敏試驗(yàn) 采用MicroScan WalkAway40 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏分析儀對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定及藥敏檢測(cè)，同時(shí)K-B 法進(jìn)行補(bǔ)充藥敏試驗(yàn)。藥敏試驗(yàn)結(jié)果嚴(yán)格參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)M100-S27 標(biāo)準(zhǔn)[3]進(jìn)行判讀，替加環(huán)素敏感性參照美國(guó)食品藥品管理局標(biāo)準(zhǔn)[4]進(jìn)行判讀，頭孢哌酮舒巴坦敏感性參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)M100-S23頭孢哌酮標(biāo)準(zhǔn)[5]進(jìn)行判讀。其中敏感率=（藥敏結(jié)果敏感菌株數(shù)/總株數(shù)）×100%；中介率=（藥敏結(jié)果中介的菌株數(shù)/總株數(shù)）×100%。質(zhì)控菌株ATCC700603，購(gòu)自國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心。

1.2.2 碳青霉烯耐藥基因檢測(cè) 煮沸法提取細(xì)菌DNA，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增5 種常見(jiàn)碳青霉烯酶基因，包括A 類（blaKPC）、B 類（blaNDM、blaVIM、blaIMP）和D 類（blaOXA）[6-8]。引物序列及反應(yīng)條件見(jiàn)表1。引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。取擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，將擴(kuò)增陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行一代測(cè)序，結(jié)果與美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，得到CRKP 菌株的耐藥基因類型[9-10]。

表1 碳青霉烯酶基因引物序列及反應(yīng)條件

1.2.3 多位點(diǎn)序列分型（multilocussequencetyping，MLST）提取CRKP 的DNA，參照MLST 網(wǎng)站（http//bigsdb.web.pasteur.fr/kleb-siella/primers-used.html）上公布的肺炎克雷伯菌7 對(duì)管家基因序列合成引物，引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。擴(kuò)增7 對(duì)管家基因的引物序列及反應(yīng)條件見(jiàn)表2。PCR 產(chǎn)物送四川金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與MLST 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，獲得CRKP 菌株的ST 型別。

表2 肺炎克雷伯菌管家基因引物序列及反應(yīng)條件

1.2.4 脈沖場(chǎng)凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）同源性分析 參照美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心PulseNet 提供的PFGE 相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序[11]，對(duì)檢出的MLST 型最多的CRKP 菌株進(jìn)行PFGE 同源性分析，PFGE 條件參照文獻(xiàn)方法操作[11]。根據(jù)電泳結(jié)果顯示的條帶數(shù)進(jìn)行細(xì)菌同源性分組。相同大小且條帶數(shù)都相同為一組，不同條帶數(shù)為另一組。

1.3 數(shù)據(jù)分析

藥敏結(jié)果用WHONET 5.6 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)或百分率表示。

2 結(jié)果

2.1 抗菌藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果

29 株CRKP 菌株耐藥特征表現(xiàn)為對(duì)替加環(huán)素及多黏菌素B 均敏感，對(duì)阿米卡星、慶大霉素的敏感率較高，對(duì)其他抗菌藥物均呈現(xiàn)出較高的耐藥率。見(jiàn)表3。

表3 29 株CRKP 對(duì)常用抗菌藥物敏感性結(jié)果分析[株（%）]

2.2 碳青霉烯酶基因型檢測(cè)結(jié)果

PCR 產(chǎn)物測(cè)序顯示28 株CRKP 攜帶NDM-1，1 株攜帶KPC-2，未檢出其他類型碳青霉烯酶基因。見(jiàn)表4。

2.3 MLST 分型結(jié)果

29 株CRKP 菌株一共檢出6 種MLST 型，其中ST12 型占75.9%（22/29，患者21 株，物表1 株）。ST23型和ST2736 型均占6.9%（2/29），ST1031 型、ST2882型均占3.4%（1/29）。此外，1 株菌MLST 為新ST 型，目前分型數(shù)據(jù)庫(kù)中未收錄。見(jiàn)表4。

表4 耐藥基因型與等位基因型及MLST 結(jié)果

2.4 PFGE 分型結(jié)果

將22 株ST12 型菌株進(jìn)行PFGE 分型，根據(jù)擴(kuò)增條帶的數(shù)目和大小對(duì)菌株之間的同源性進(jìn)行聚類分析，得到6 種型別，A 型11 株，B 型6 株，C 型2 株，D、E、F型各1 株，見(jiàn)圖1。A、B 型均有多株菌存在，且物表分離株為A 型，提示ST12/A 在我院ICU 病區(qū)有院內(nèi)流行趨勢(shì)。

圖1 22 株產(chǎn)NDM-1 型碳青霉烯酶ST12/A 型CRKP 菌株聚類分析

3 討論

CRKP 感染主要與肺炎克雷伯菌定植或感染病史、腸外營(yíng)養(yǎng)，使用第三代頭孢菌素或碳青霉烯類抗生素有關(guān)[12]。由于ICU 病區(qū)主要接收危急重癥患者，多數(shù)患者涉及轉(zhuǎn)院、轉(zhuǎn)科、侵入性治療、手術(shù)治療等，該病區(qū)成為院內(nèi)感染的高發(fā)區(qū)域，也是CRKP 主要流行的區(qū)域[13-15]。本研究中的29 株CRKP 同時(shí)對(duì)青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類等其他β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物高度耐藥，而對(duì)替加環(huán)素、多黏菌素B 均敏感，其耐藥特點(diǎn)與王健等[16]報(bào)道的一致。與河南省臨床分離CRKP 耐藥情況一致[17]。

不同地區(qū)CRKP 的流行基因型不盡相同[18-19]，目前國(guó)內(nèi)報(bào)道多以檢出KPC-2 型酶的ST11 型為主，金屬酶相對(duì)較少[20]。劉婷婷等[21]、張志軍等[22]、張曉慧等[23]、Kong 等[24]報(bào)道及2017 年上海報(bào)道[25]的流行型別均以產(chǎn)KPC-2 的ST11 型CRKP 為 主；Chen 等[26]對(duì) 重慶西南醫(yī)院調(diào)查發(fā)現(xiàn)CRKP 主要攜帶blaIMP-4為主。而本研究顯示我院ICU 病房CRKP 以產(chǎn)NDM-1 型碳青霉烯酶的ST12 型為主要流行型別，未檢出ST11 型，與國(guó)內(nèi)報(bào)道的流行型別完全不一致。NDM-1 酶屬于B 類金屬酶，能夠水解除氨曲南外的所有β 內(nèi)酰胺類抗菌藥物，包括碳青霉烯類藥物[27]，被稱為“超級(jí)細(xì)菌”[28]。B 類金屬碳青霉烯酶對(duì)碳青霉烯類藥物的活性更高，同時(shí)對(duì)其他抗菌藥物耐藥性更高。我院CRKP以產(chǎn)NDM-1 型金屬酶為主要耐藥機(jī)制。CRKP 可在醫(yī)療環(huán)境中廣泛存在，可定植于醫(yī)務(wù)人員手部、患者周?chē)h(huán)境物體表面及醫(yī)療器材等[29]。我院ICU 的聽(tīng)診器表面檢出1 株NDM-1 的ST12/A 型CRKP 菌株，與我院主要流行型別相同，同源性程度較高。醫(yī)院感染管理科及ICU 病區(qū)應(yīng)引起高度重視，加強(qiáng)對(duì)該病區(qū)的多重耐藥菌的管控措施，加強(qiáng)手衛(wèi)生管理，常規(guī)環(huán)境的清潔，有效降低物體表面多重耐藥菌的檢出率[30]。

綜上所述，該院ICU 病區(qū)CRKP 耐藥率高，主要耐藥機(jī)制是產(chǎn)NDM-1 型碳青霉烯酶，物表分離株與該病區(qū)主要流行菌株ST12/A 型別一致，同源性程度較高，可在院內(nèi)患者和環(huán)境中克隆性傳播。因此，及時(shí)監(jiān)測(cè)患者和物表的耐藥菌，避免耐藥菌大范圍暴發(fā)流行意義重大。醫(yī)院感染管理科與臨床相關(guān)科室應(yīng)采取一系列防控措施，如管理決策、教育性干預(yù)、手衛(wèi)生、合理用藥、耐藥菌監(jiān)測(cè)、接觸隔離、去除定植菌等措施來(lái)降低CRKP 的醫(yī)院感染率、定植率，并對(duì)醫(yī)院感染防控對(duì)策提供支持，避免耐藥菌株在醫(yī)院內(nèi)傳播。