廣東省佛山市新生兒葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥篩查與基因突變分析

袁偉曦 邵巧儀 張澎怡 劉麗雅 劉海平

廣東省佛山市婦幼保健院新生兒疾病篩查中心，廣東佛山 528000

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥是一種由于基因突變導(dǎo)致葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性降低的伴X 染色體連鎖不完全顯性遺傳性疾病[1-2]。目前，已知的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥的致病突變已達(dá)240 種，以點突變?yōu)橹?。全球受葡萄?6-磷酸脫氫酶缺乏癥影響的人數(shù)已超4 億[3-5]。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥患者多無明顯臨床癥狀，但常因藥物、食物、感染等誘發(fā)急性溶血，嚴(yán)重者會危及生命。因此，早篩查、早確診是有效預(yù)防葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥發(fā)作的重要手段。我國葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥的發(fā)病率呈現(xiàn)“南高北低”的地域特點，廣東、廣西、海南、云南等地是本病的高發(fā)區(qū)[6-10]。了解當(dāng)?shù)匦律鷥浩咸烟?6-磷酸脫氫酶缺乏癥的分子特征，可更好地推動該地區(qū)出生缺陷防控工作的開展。本研究通過收集廣東省佛山地區(qū)新生兒葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥篩查數(shù)據(jù)及基因檢測情況，旨在了解本地區(qū)新生兒葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥基因突變的分布特征，為本地區(qū)新生兒葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥的防控提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇廣東省佛山市婦幼保健院新生兒疾病篩查中心轄區(qū)內(nèi)的各助產(chǎn)機構(gòu)2019 年1 月至2020 年12 月出生的156 227 名新生兒為研究對象，其中男83 978 名，女72 249 名。

1.2 研究方法

1.2.1 主要檢測試劑及儀器 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶測定試劑盒（廣州市豐華生物工程有限公司）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因檢測試劑盒（PCR+導(dǎo)流雜交法）（廣東凱普生物科技股份有限公司）、全自動熒光免疫分析儀AutoTRFIA-4（廣州市豐華生物工程有限公司）、PCR 擴增儀（杭州博日科技股份有限公司）、醫(yī)用核酸分子雜交儀HB-2012A（廣東凱普生物科技股份有限公司）。

1.2.2 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥篩查 收集于新生兒出生2～7 d 采集其足跟血所制作的干血片，采用葡萄糖-6-磷酸脫氫酶測定試劑盒（熒光分析法）和全自動熒光免疫分析儀AutoTRFIA-4 檢測其葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性，所有實驗操作均嚴(yán)格按照試劑盒及儀器操作說明書進(jìn)行。樣本測定值≤2.20 U/gHb，判斷為初篩陽性，提示存在葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏或減少的情況；樣本測定值＞2.20 U/gHb，判斷為初篩陰性[11]。

1.2.3 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因檢測 召回初篩陽性者，經(jīng)監(jiān)護(hù)人同意后采集其末梢血進(jìn)行基因檢測。制作干血片，撕取9 mm×9 mm 干血片進(jìn)行DNA 提取、PCR 擴增、雜交，讀取膜條上的基因檢測結(jié)果。所有操作步驟嚴(yán)格遵照試劑盒說明書進(jìn)行。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因檢測試劑盒可檢測人類葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因6 個外顯子的14 種突變位點：c.95A ＞G、c.392G ＞T、c.487G ＞A、c.592C ＞T、c.871G ＞A、c.1024C ＞T、c.1311C ＞T、c.1360C＞T、c.1376G＞T、c.1388G＞A、c.493A＞G、c.1387C＞T、c.1004C＞T、c.1381G＞A。若葡萄糖-6-磷酸脫氫酶初篩陽性者的導(dǎo)流雜交結(jié)果未見異常，則將該樣本送至廣東凱普生物科技股份有限公司進(jìn)行一代測序（檢測葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因的外顯子2、5、6、9、11、12）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 24.0 對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料采用例數(shù)和百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 初篩人群特征

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥初篩陽性者6361 例，初篩陽性率為4.07%（6361/156 227）。其中男5683例，女678 例，男性人群中初篩陽性率為6.77%（5683/83 978），女性人群中初篩陽性率0.94%（678/72 249），男性初篩陽性率高于女性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=3378.22，P ＜0.05）。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥初篩陽性者中共召回2556 例，召回成功率為40.18%，其中575 例（男538 例，女37 例）同意進(jìn)行葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥基因檢測。

2.2 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥初篩陽性的基因符合情況

575 例葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥初篩陽性者共檢出550 例攜帶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥突變基因，25 例未檢出異常；繼續(xù)進(jìn)行一代測序，結(jié)果顯示有9 例檢出試劑盒檢測范圍外的c.517T＞C 突變，16例未檢出突變。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥篩查試驗（熒光分析法）的基因符合率為97.22%（559/575）。

2.3 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥基因突變分布特征

共檢出10 種基因突變類型：c.1376G＞T、c.1388G＞A、c.95A ＞G、c.1311C ＞T、c.871G ＞A、c.1024C ＞T、c.392G＞T、c.517T＞C、c.1360C＞T、c.487G＞A。見表1。基因突變類型的檢出率排前3 位的分別為c.1376G＞T（31.07%）、c.1388G＞A（30.74%）、c.95A＞G（17.36%），占總突變的79.17%。c.517T＞C 突變的檢出率為1.49%。

表1 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥基因突變分布特征

3 討論

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥是我國南方地區(qū)的高發(fā)疾病，人群患病率為4.0%～20.0%[12]，本研究數(shù)據(jù)顯示本地區(qū)新生兒葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥篩查陽性率為4.07%，與廣東省其他地區(qū)，如廣州（4.20%）、東莞（3.60%）、江門（4.14%）的篩查陽性率接近[13-15]。男性新生兒的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥初篩陽性率明顯高于女性，這可能是由于葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥是伴X 染色體連鎖不完全顯性遺傳病，男性僅攜帶一條X 染色體，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥基因發(fā)生突變，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥篩查即為陽性；女性有2 條X 染色體，且X 染色體會出現(xiàn)隨機失活[16-17]，這使女性葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥雜合突變攜帶者的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性可表現(xiàn)為異常、正?；蛱幱谂R界值附近，這些酶活性表現(xiàn)為正?；蚺R界值附近的女性雜合突變攜帶者極易被漏診。有研究表明，女性雜合突變攜帶者暴露在氧化性刺激中時，也會出現(xiàn)急性溶血，危及生命健康[18]。

本研究通過對葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥初篩陽性者進(jìn)行基因檢測，其基因符合率為97.22%，提示本地區(qū)選取的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性臨界值在篩查葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥患者時具有較高的特異性。

本地區(qū)新生兒以c.1376G＞T、c.1388G＞A、c.95A＞G 3 種突變?yōu)橹?，這與我國最常見的3 種突變類型一致[11，19-21]。本研究發(fā)現(xiàn)本地區(qū)新生兒葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥初篩陽性者攜帶c.1311C ＞T 突變的比例達(dá)7.27%，且攜帶c.1311C＞T 半合子突變的新生兒的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性異常，提示c.1311C＞T 突變可能影響其活性。雖然c.1311C＞T 是同義突變，但其常復(fù)合同義突變c.1365-13T＞C，由于這兩個突變位點距離接近，可能干擾葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥基因的轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥患者酶活性的降低[22-24]。提示可將c.1311C＞T 作為導(dǎo)向指標(biāo)，即當(dāng)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性異常者檢出c.1311C＞T 突變時，需對樣本進(jìn)行進(jìn)一步測序，以驗證該受檢者是否復(fù)合其他類型的突變，盡可能避免漏診葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥患者。此外，本研究發(fā)現(xiàn)本地區(qū)新生兒c.517T＞C 突變的攜帶率為1.49%，c.517T＞C 突變屬于葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥的Ⅱ類致病位點，在廣東省其他城市的檢出率為1.00%左右[25]，因此，在對廣東地區(qū)人群開展葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥基因檢測時，需將c.517T＞C 位點納入檢測范圍，避免漏診。

近年來，我國加大了對出生缺陷防控的投入力度，部分省市已對該地區(qū)新生兒推行免費新生兒疾病篩查政策，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥作為南方地區(qū)新生兒疾病篩查的重要項目，應(yīng)制訂適合本地區(qū)的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性臨界值及基因檢測范圍，以更好地推動本地區(qū)新生兒出生缺陷防控事業(yè)的發(fā)展。