基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究麻黃附子細(xì)辛湯治療哮喘的分子作用機(jī)制

加夢還 張彩榮 馮龍飛

1.宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西宜春 336000；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院針灸科，江蘇南京 210000；3.宜春學(xué)院美容醫(yī)學(xué)院，江西宜春 336000

哮喘是呼吸系統(tǒng)常見的慢性疾病，以喘息、胸悶、咳嗽、呼吸短促等癥狀為主要臨床表現(xiàn)，其病因復(fù)雜，涉及遺傳、環(huán)境等多種因素[1]。當(dāng)前，哮喘的藥物治療主要使用支氣管擴(kuò)張劑和糖皮質(zhì)激素，感染期合并應(yīng)用抗生素，雖取得一定的效果，病情暫時(shí)得到控制，但遠(yuǎn)期效果不甚理想。麻黃附子細(xì)辛湯出自《注解傷寒論》，麻黃、附子、細(xì)辛可化痰宣肺、止咳平喘，現(xiàn)代臨床研究表明，麻黃附子細(xì)辛湯治療哮喘具有顯著效果[2]。為進(jìn)一步明確麻黃附子細(xì)辛湯對哮喘的具體作用機(jī)制，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，整合多項(xiàng)藥物與疾病數(shù)據(jù)庫，以期為臨床研究提供新思路。

1 資料與方法

1.1 資料來源

本研究使用的數(shù)據(jù)庫及軟件有：通用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（www.uniprot.org）、毒性與基因比較數(shù)據(jù)庫（ctdbase.org）、中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（tcmspw.com）、STRING 數(shù)據(jù)庫（string-db.org）、網(wǎng)絡(luò)圖形拓?fù)浞治雠c編輯軟件（Cytoscape3.7.2）、人類基因組注釋數(shù)據(jù)庫(david.ncifcrf.gov)、微生信分析平臺(tái)（www.bioinformatics.com.cn）、Venny2.1.0（bioinfogp.cnb.csic.es）。

1.2 麻黃附子細(xì)辛湯中活性成分及靶點(diǎn)的篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)檢索中藥麻黃、附子、細(xì)辛，以口服生物利用度≥30%，類藥性≥0.18 為條件，篩選其中的活性成分并獲取相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 疾病靶基因的篩選

在毒性與基因比較數(shù)據(jù)庫中，通過關(guān)鍵詞“Asthma”篩選出哮喘相關(guān)靶基因。

1.4 麻黃附子細(xì)辛湯靶基因的篩選

將“1.2”中藥物靶點(diǎn)錄入U(xiǎn)niprot 數(shù)據(jù)庫中，進(jìn)行基因標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.5 麻黃附子細(xì)辛湯治療哮喘靶點(diǎn)

將藥物活性成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)通過維恩圖取交集，從而初步獲取麻黃附子細(xì)辛湯作用于哮喘的治療靶點(diǎn)。

1.6 麻黃附子細(xì)辛湯-哮喘關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（proteinprotein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將上述得到的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫，利用Cytoscape 3.7.2 計(jì)算進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩苑治?，?gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.7 KEGG 通路富集和GO 生物過程分析

將上述關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫中，以FDR＜0.01 為篩選條件，其結(jié)果分別以條形圖和氣泡圖予以顯示。

1.8 麻黃附子細(xì)辛湯關(guān)鍵活性成分-哮喘靶點(diǎn)的KEGG 通路

將通過文獻(xiàn)分析獲取的與KEGG 有關(guān)的信號(hào)通路及關(guān)鍵活性成分，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2，構(gòu)建麻黃附子細(xì)辛湯關(guān)鍵活性成分-哮喘靶點(diǎn)的KEGG 通路。

2 結(jié)果

2.1 活性成分

篩選得到麻黃、附子、細(xì)辛中的活性成分，包括共有成分，共32 種，口服生物利用度排名前5 位的主要活性成分為槲皮素、木犀草素、山柰酚、β-谷甾醇、柚皮素。

2.2 藥物與疾病靶點(diǎn)維恩圖建立

將“2.1”中活性成分經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后得到234 個(gè)靶基因。將在毒性與基因比較數(shù)據(jù)庫中檢索篩選到的486 個(gè)哮喘靶基因與麻黃附子細(xì)辛湯的靶基因構(gòu)建維恩圖，獲得110 個(gè)麻黃附子細(xì)辛湯治療哮喘的共同靶基因。見圖1。

圖1 麻黃附子細(xì)辛湯-哮喘靶基因維恩圖

2.3 關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選及PPI 分析

取度值、中介中心性、接近中心性平均值以上的靶基因作為關(guān)鍵靶點(diǎn)，在110 個(gè)靶點(diǎn)中得到TP53、腫瘤壞死因子等30 個(gè)靶點(diǎn)，預(yù)測這些靶點(diǎn)是麻黃附子細(xì)辛湯治療哮喘的關(guān)鍵靶基因。將藥物與疾病的共同治療靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫中，得到藥物-疾病靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。見圖2。

圖2 藥物-疾病靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 KEGG 信號(hào)通路分析與GO 富集分析

將30 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入人類基因組注釋數(shù)據(jù)庫中，得到15 條與哮喘相關(guān)的KEGG 信號(hào)通路，并繪制氣泡圖。見圖3。GO 富集顯示生物過程124 個(gè)，分子功能24 個(gè)，細(xì)胞組成12 個(gè)。富集結(jié)果以數(shù)量值前5 位予以展示，見圖4。

圖4 GO 富集分析條形圖

2.5 麻黃附子細(xì)辛湯關(guān)鍵活性成分-核心靶點(diǎn)-疾病信號(hào)通路

利用Cytoscape 3.7.2 以槲皮素、木犀草素、山奈酚、柚皮素、β-谷甾醇為主要成分構(gòu)建麻黃附子細(xì)辛湯關(guān)鍵活性成分-核心靶點(diǎn)-疾病信號(hào)通路圖，見圖5。圖中長方形代表核心靶點(diǎn)，箭頭代表活性成分，橢圓形代表信號(hào)通路，菱形代表疾病。

圖5 麻黃附子細(xì)辛湯關(guān)鍵活性成分-核心靶點(diǎn)-疾病信號(hào)通路

3 討論

3.1 關(guān)鍵活性成分分析

中醫(yī)理論認(rèn)為，哮喘的發(fā)生與脾、肺、腎之間的關(guān)系最為密切。在肺虛中，患者表現(xiàn)出營衛(wèi)不固，御外無力，易感外邪，免疫力下降；脾虛則表現(xiàn)出免疫系統(tǒng)的功能紊亂和低下；腎虛中，患者表現(xiàn)出下丘腦、垂體、腎上腺和內(nèi)分泌的功能發(fā)生紊亂或者低下[3]。中醫(yī)認(rèn)為補(bǔ)虛固本，理氣祛痰是治療哮喘的關(guān)鍵[4]。槲皮素是一種植物衍生的黃酮類化合物，具有廣泛的抗炎、抗氧化應(yīng)激以及免疫調(diào)節(jié)作用[5]。Park 等[6]發(fā)現(xiàn)槲皮素可通過調(diào)節(jié)哮喘小鼠的T-bet 和GATA-3 基因的表達(dá)，抑制Th2 型細(xì)胞因子表達(dá)，促進(jìn)Th1 型細(xì)胞因子γ 干擾素的表達(dá)，從而減輕哮喘小鼠氣道高反應(yīng)性。木犀草素屬于天然的黃酮類化合物，可抑制Th2 型細(xì)胞因子的合成[7]，故其具有抗氧化、抗過敏、免疫調(diào)節(jié)等作用。Jang 等[8]研究證實(shí)，通過抑制Th2 細(xì)胞因子，木犀草素可以對過敏性哮喘發(fā)揮治療作用。山柰酚同樣屬于黃酮類化合物，也具有抗癌、抗炎、抗病毒等功能。柚皮素屬于二氫黃酮類化合物，史瑩等[9]在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中研究證明，柚皮素在體外可以抑制與哮喘病理發(fā)生有關(guān)的炎癥因子。β-谷甾醇是植物甾醇類成分之一，研究表明，β-谷甾醇具有抗哮喘作用[10]。

3.2 關(guān)鍵靶基因分析

為深入研究麻黃附子細(xì)辛湯治療哮喘的作用機(jī)制，本研究篩選出30 個(gè)關(guān)鍵靶基因。其中TP53 對促進(jìn)凋亡[11]和抗炎應(yīng)答[12]起到調(diào)節(jié)作用，從而參與哮喘發(fā)生和全過程，基質(zhì)金屬蛋白酶2、9 是參與哮喘炎癥反應(yīng)的過程，與哮喘的氣道重塑有關(guān)[13-14]。腫瘤壞死因子基因可激活單核巨噬細(xì)胞，產(chǎn)生炎癥介質(zhì)[15]，白細(xì)胞介素-6 為重要的炎癥因子，主要由上皮細(xì)胞，T、B 細(xì)胞，單核巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生[16-17]，在發(fā)生哮喘時(shí)增高，病情緩解后漸漸恢復(fù)到正常水平，參與哮喘的全過程[18-19]。Lee 等[20]實(shí)驗(yàn)證明，CCL2 基因在小鼠過敏哮喘模型的支氣管上皮細(xì)胞中表達(dá)顯著。AKT1 是通過影響炎癥因子白細(xì)胞介素-1β 的表達(dá)，從而參與哮喘的過程[21]。PPARG 可通過調(diào)節(jié)炎癥在哮喘中起作用[22]。FOS 和JUN 可促進(jìn)哮喘中黏附分子的增值[23-24]。

3.3 KEGG 通路分析

對核心靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路富集分析，進(jìn)一步研究麻黃附子細(xì)辛湯治療哮喘的作用機(jī)制，與哮喘密切相關(guān)KEGG 信號(hào)通路有：腫瘤壞死因子信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路等15 個(gè)信號(hào)通路。Zhang 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)Th2 細(xì)胞功能，介導(dǎo)細(xì)胞免疫、炎癥反應(yīng)等過程，在治療哮喘的過程中發(fā)揮作用。哮喘的易感性也可能與先天免疫成分編碼基因的變異有關(guān)，病原體通過Toll 樣受體激活氣道上皮的先天性免疫反應(yīng),誘發(fā)氣道炎癥，繼而導(dǎo)致哮喘急性加重，使其成為哮喘的生物學(xué)候選基因[26]。FoxO信號(hào)通路是氧化還原的重要轉(zhuǎn)錄通路，參與細(xì)胞的氧化、還原、凋亡的全過程，但少有文獻(xiàn)報(bào)道其與哮喘之間的關(guān)系。磷脂酰肌醇3 激酶主要表現(xiàn)在細(xì)胞增殖方面，Akt 激酶可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和代謝，阻斷該信號(hào)通路可以改變氣道結(jié)構(gòu)，減輕氣道重塑，調(diào)節(jié)細(xì)胞分化及炎癥因子的產(chǎn)生，從而治愈哮喘[27]。

綜上，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對麻黃附子細(xì)辛湯治療哮喘的作用機(jī)制進(jìn)行初步討論，為臨床實(shí)驗(yàn)提供了理論依據(jù)，為進(jìn)一步的試驗(yàn)提供了可能性。