脯氨酸羥化酶3 在乳腺癌中的表達(dá)及其對(duì)乳腺癌細(xì)胞惡性表型的影響

王 楊 趙梓彤 宋詠梅 張柏林

1.國(guó)家癌癥中心 國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院乳腺外科，北京 100021；2.國(guó)家癌癥中心 國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021

據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究中心發(fā)布的全球腫瘤流行病統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)（GLOBOCAN 2018）顯示，全球每年新增乳腺癌病例達(dá)208 萬例，死亡62.6 萬例[1]。近年來，雖然乳腺癌的診斷和治療取得了顯著進(jìn)步，但仍面臨許多難題，乳腺癌的發(fā)病機(jī)制仍不夠清楚。近年來乳腺癌分子靶向治療得到越來越多的關(guān)注[2]，因此尋找合適的靶向治療位點(diǎn)，進(jìn)行基因靶向治療逐漸成為乳腺癌的研究熱點(diǎn)。

脯氨酸羥化酶3（Egl nine homolog 3，EGLN3）屬于脯氨酸羥化酶家族，該家族酶類通過羥化缺氧誘導(dǎo)因子α（hypoxic inducible facter-α，HIF-α）保守的脯氨酸殘基來調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)氧的反應(yīng)，起到氧傳感器的作用[3]。目前大多數(shù)EGLN3 相關(guān)腫瘤研究中，EGLN3 通常作為一種腫瘤抑制因子發(fā)揮作用，在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)了其蛋白水平的表達(dá)下調(diào)，與預(yù)后呈正相關(guān)[4-7]，但其在乳腺癌中的表達(dá)及功能尚不明確。本研究旨在探討EGLN3 在乳腺癌中的表達(dá)情況及對(duì)乳腺癌細(xì)胞惡性表型的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 TCGA 和GTEx 數(shù)據(jù)庫(kù)樣本 收集TCGA 和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)中乳腺癌組織樣本及正常組織樣本，使用GEPIA 網(wǎng)站（http://gepia.cancer-pku.cn）分析兩組間EGLN3 mRNA 表達(dá)的差異。

1.1.2 臨床樣本 選取2010 年1 月至2017 年12 月中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）乳腺外科收治的經(jīng)病理確診的52 例女性乳腺癌患者的癌組織及癌旁組織（病灶周圍病理組織檢查未見癌組織的正常組織），其中Luminal 型27 例，Her2 過表達(dá)型9 例，三陰型16 例，組織提取后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩；颊咂骄挲g（45.12±10.84）歲，所有患者術(shù)前均未接受化療或放療。本研究所采用的人體標(biāo)本經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意。

1.2 主要儀器設(shè)備及試劑

EGLN3 的小干擾RNA 試劑（O0619，廣州市銳博生物科技有限公司）；xCELLigence RTCA MP 系統(tǒng)[艾森生物（杭州）有限公司]；兔抗EGLN3 抗體（O105174583，1 mg/ml，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；β-actin抗體（B178893，1 mg/ml，Sigma-Aldrich 公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（0000361591，美國(guó)Progmega 公司）和real time PCR kit（0234845532002，加拿大ABM 公司）；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000（1831591，美國(guó)Life Technologies 公司）；BCA 試劑盒（20200625，蘇州新賽美生物科技有限公司）；RNA 抽提試劑盒（20191231，蘇州新賽美生物科技有限公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 乳腺癌細(xì)胞（ZR-75-1、SK-BR-3、MDA-MB-453、BT474、MCF-7、T47D、MDA-MB-231、CAL-51、HS578T、MDA-MB-468、HCC1937）的培養(yǎng)條件為90% DMEM 培養(yǎng)基，加10%胎牛血清；正常乳腺上皮細(xì)胞（MCF-10A）的培養(yǎng)條件為DMEM/F12+表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（20 ng/ml）+氫化可的松（0.5 μg/ml）+霍亂霉素（100 ng/ml）+胰島素（10 μg/ml），加5%馬血清。細(xì)胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6 孔板，設(shè)置空白對(duì)照組（NC）、轉(zhuǎn)染敲降組1（siRNA-1）、轉(zhuǎn)染敲降組2（siRNA-2）、轉(zhuǎn)染敲降組3（siRNA-3），基因轉(zhuǎn)染步驟參照LipofectamineTM3000 試劑盒說明書進(jìn)行。選取EGLN3 高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231轉(zhuǎn)染EGLN3 siRNA，檢測(cè)其蛋白水平。

1.3.3 real-time PCR 在Bio-rad 儀器上進(jìn)行real-time PCR 反應(yīng)，依據(jù)SYBR-Green 法半定量，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次。反應(yīng)體系如下：1×SYBR-Green Premix EX Taq（perfect real-time）試劑（10 μl），50 ng DNA（1 μl），基因引物0.1 μmol/L（1 μl），用去離子水補(bǔ)齊終體積共20 μl。反應(yīng)條件為95℃5 min（預(yù)變性）；95℃5 s（變性）、60℃31 s（退火+延伸），40 個(gè)循環(huán)；95℃5 s、60℃15 s（熔解曲線）。通過分析產(chǎn)物的溶解曲線來確定擴(kuò)增的特異性，特異性的引物序列包括EGLN3 正向：5’-AGTACATCGTGCCCTGTCTG-3’，反向：5’-GTGTCGCTTGGAGACGCC-3’；GAPDH 正 向：5’-TGTTGCCATCAATGACCCCTT-3’，反向：5’-CTCCACGACGTACTCAGCG-3’。

1.3.4 Western blot 制備12%的SDS-PAGE 分離膠和5%的積層膠。提取細(xì)胞總蛋白后，利用BCA 試劑盒進(jìn)行酶標(biāo)儀法蛋白定量，取等量蛋白，加入等體積緩沖液，100℃加熱5 min，待蛋白變性后上樣。全程100 V 電壓跑電泳，直至染料到達(dá)最下沿。以0.35 A恒流濕轉(zhuǎn)30 min，將PVDF 膜放入封閉液中（1×PBS+5%脫脂奶粉），室溫封閉1 h。封閉液按一定比例稀釋一抗，裝入雜交袋中，4℃過夜。1×PBST 室溫漂洗3 次，每次7 min。封閉液按一定比例稀釋二抗，雜交袋室溫孵育1 h。1×PBST 室溫漂洗3 次，每次7 min。將Western blot Chemiluminescence Luminol Kit 的A 液和B 液等量混合，滴在膜上，使之完全覆蓋硝酸纖維素膜。用FUJIFILM 儀器進(jìn)行曝光。

1.3.5 細(xì)胞增殖 轉(zhuǎn)染24 h 后將細(xì)胞應(yīng)用胰蛋白酶消化，培養(yǎng)基終止消化后，以每孔2000 個(gè)細(xì)胞接種于xCELLigence RTCA MP E-plate 96 孔板，以6 h 為細(xì)胞貼壁時(shí)間對(duì)得到的生長(zhǎng)曲線用RTCA Software 進(jìn)行細(xì)胞指數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化分析細(xì)胞的增殖情況。

1.3.6 克隆形成實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染24 h 后將細(xì)胞應(yīng)用胰蛋白酶消化，培養(yǎng)基終止消化后，以每孔1000 個(gè)細(xì)胞接種于6 孔板內(nèi)，5～6 d 換液，培養(yǎng)10～14 d 后觀察細(xì)胞克隆形成群落情況。

1.3.7 Transwell 實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染24 h 后將細(xì)胞應(yīng)用胰蛋白酶消化，培養(yǎng)基終止消化后，Transwell 小室內(nèi)加入含2% Matrix 膠的雙無DMEM 培養(yǎng)基100 μl，此后取細(xì)胞計(jì)數(shù)1×105個(gè)置于小室內(nèi)，下層加入800 μL含20%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，培養(yǎng)20～24 h，取出觀察結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用GraphPad Prism 8 以及R 語言作圖，組間比較采用配對(duì)t 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGLN3 mRNA 在乳腺癌組織及正常組織中的表達(dá)情況

TCGA 和GTEx 數(shù)據(jù)庫(kù)共收錄1085 例乳腺癌組織和291 例正常組織的相關(guān)信息，結(jié)果顯示，乳腺癌組織EGLN3 mRNA 表達(dá)高于正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖1。

圖1 EGLN3 mRNA 在乳腺癌組織及正常組織的表達(dá)情況

2.2 乳腺癌組織及癌旁組織EGLN3 mRNA 表達(dá)情況

乳腺癌組織EGLN3 mRNA 表達(dá)高于癌旁組織，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01），見圖2A。在不同分型的亞組分析中，三陰型及Luminal 型乳腺癌組織EGLN3 mRNA 表達(dá)高于癌旁組織，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.01），Her2 型乳腺癌組織與癌旁組織EGLN3 mRNA表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >0.05），見圖2B。

圖2 乳腺癌組織及其癌旁組織EGLN3 mRNA 中的表達(dá)情況

2.3 正常乳腺上皮細(xì)胞及乳腺癌細(xì)胞中EGLN3 蛋白的表達(dá)情況

EGLN3 蛋白在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、CAL-51、MDA-MB-468 和HCC1937 中高表達(dá)，而在正常乳腺上皮細(xì)胞及其他乳腺癌細(xì)胞中不表達(dá)。見圖3。

圖3 EGLN3 在正常乳腺上皮細(xì)胞及各乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況

2.4 轉(zhuǎn)染siRNA 敲降EGLN3 后的Westernblot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

siRNA-1 與siRNA-3 中EGLN3 蛋白表達(dá)下降，siRNA-2 中EGLN3 蛋白表達(dá)未下降。見圖4。

圖4 轉(zhuǎn)染siRNA 敲降EGLN3 后的Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 敲降EGLN3 對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖、克隆形成的影響

敲降EGLN3 后，乳腺癌細(xì)胞的增殖能力、細(xì)胞克隆形成能力均下降。見圖5。

圖5 敲降EGLN3 對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖、克隆形成的情況

2.6 敲降EGLN3 對(duì)乳腺癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力的影響

敲降EGLN3 后乳腺癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力下降。見圖6。

圖6 敲降EGLN3 對(duì)乳腺癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，HIF 本身并不能感受氧分壓的變化，需要脯氨酸羥化酶來感受氧分壓變化，并使HIF-1α 的數(shù)量保持穩(wěn)定[8]。HIF-1α 可以激活多種致癌途徑基因的表達(dá)，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及促紅細(xì)胞生成素，促進(jìn)腫瘤血管生成[9-10]，同時(shí)HIF-1α 可通過介導(dǎo)丙酮酸激酶同工酶2 的轉(zhuǎn)錄參與腫瘤細(xì)胞代謝重編程[11]，也可通過誘導(dǎo)E-鈣黏蛋白缺失，通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化增強(qiáng)腫瘤的侵襲性[12]。

目前已知的研究中，EGLN3 屬于HIF-1α 的負(fù)調(diào)節(jié)因子，廣泛存在于生物體內(nèi)[13-15]，EGLN3 可以作為支架蛋白，促進(jìn)表皮生長(zhǎng)因子受體的內(nèi)化作用從而調(diào)節(jié)其活性[16-17]，也可以通過調(diào)控血小板源性生長(zhǎng)因子通路控制腫瘤生長(zhǎng)和血管結(jié)構(gòu)，這些非HIF 途徑相關(guān)靶蛋白通路的發(fā)現(xiàn)暗示其蘊(yùn)藏了更多的潛力[18-19]。在人膠質(zhì)瘤中，EGLN3 的功能缺失可以造成明顯的細(xì)胞增殖[20]，也可以通過p53 抑制干細(xì)胞相關(guān)基因NANOG的表達(dá)，抑制結(jié)腸癌干細(xì)胞特性[3]。在胰腺癌中，過表達(dá)EGLN3 可以抑制胰腺癌細(xì)胞接受放療后的增殖及克隆能力，加速細(xì)胞凋亡[21]，EGLN3 的低表達(dá)也與肝癌患者的不良預(yù)后相關(guān)[22]。但同時(shí)其在部分腫瘤中卻發(fā)揮相反的作用，如在人類頭頸部鱗狀細(xì)胞癌之中，敲降EGLN3 后，腫瘤細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下生長(zhǎng)能力明顯減弱[23]，在胰腺癌中，EGLN3 可通過調(diào)控羥脯氨酸水平，促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[24]。

本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siRNA 后細(xì)胞的增殖、克隆形成、侵襲、遷移均有所減弱，提示敲降EGLN3 可以抑制乳腺癌細(xì)胞的惡性表型，因此推斷EGLN3 促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移，起到癌基因的作用。同時(shí)在細(xì)胞系Western blot 檢測(cè)中，EGLN3 蛋白在乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、CAL-51、MDA-MB-468 和HCC1937 中高表達(dá)，這4 種細(xì)胞系同屬于三陰型乳腺癌細(xì)胞系[25]，侵襲能力較強(qiáng)，因此推斷EGLN3 高表達(dá)可能是高侵襲型乳腺癌細(xì)胞系的特點(diǎn)之一。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)EGLN3 在乳腺癌中高表達(dá)，在乳腺癌細(xì)胞中敲降EGLN3 的表達(dá)后，細(xì)胞的增殖、克隆形成、侵襲和遷移能力均下降。EGLN3 可能作為癌基因，在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)為乳腺癌的診斷及防治提供證據(jù)，為乳腺癌的生物治療提供理論基礎(chǔ)。