腹腔鏡手術(shù)對子宮內(nèi)膜癌細胞轉(zhuǎn)移潛能影響的實驗研究

黃守國，秦 杰，陳 瑾，程 虹，蒙 秋，張 靜，王海燕

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道最常見的惡性腫瘤之一，占女性生殖道惡性腫瘤的20% ～30%。手術(shù)治療的目的在于切除癌變組織及癌細胞可能轉(zhuǎn)移或已轉(zhuǎn)移的病灶，并同時進行全面的手術(shù)病理分期。傳統(tǒng)的子宮內(nèi)膜癌手術(shù)方法對患者創(chuàng)傷較大，術(shù)后恢復慢。隨著腹腔鏡儀器的完善及器械的革新，腹腔鏡微創(chuàng)手術(shù)治療子宮內(nèi)膜癌，效果更好［1－3］。本研究對子宮內(nèi)膜癌腹腔鏡手術(shù)、開腹手術(shù)及腹腔鏡下全子宮切除術(shù)后子宮內(nèi)膜標本手術(shù)前后的細胞凋亡率、腫瘤轉(zhuǎn)移促進基因MTA1和轉(zhuǎn)移抑制基因nm23－H1表達水平進行了對比研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選擇我院2009年9月—2011年12月子宮病變 (子宮內(nèi)膜癌Ⅰ期及子宮良性病變)患者60例，根據(jù)患者病情及選擇的手術(shù)方法分為3組。子宮內(nèi)膜癌Ⅰ期要求行腹腔鏡手術(shù)者20例進入腹腔鏡手術(shù)組:年齡47～73歲，平均(59.2±7.2)歲。子宮內(nèi)膜癌Ⅰ期患者要求行開腹手術(shù)者20例進入開腹手術(shù)組:年齡48～70歲，平均 (58.8±6.9)歲。子宮良性病變無生育需求，要求行腹腔鏡下全子宮切除術(shù)者20例進入空白對照組:年齡49～69歲，平均 (57.7±6.3)歲?；颊咝g(shù)前均未進行化療、放療、生物治療等其他治療，排除其他系統(tǒng)合并癥及系統(tǒng)腫瘤等。

1.2 主要儀器與試劑 流式細胞儀:美國BD公司生產(chǎn)，熒光PCR儀:BIO－RAD公司，型號:MJ OPTICON2(美國)，Taq酶:貨號DR001A(TaKaRa，日本)，ReverTra Ace－a－反轉(zhuǎn)錄試劑盒:貨號FSK－100(TOYOBO，日本)，PCR擴增引物:MTA1、nm23－H1及β－actin的mRNA，設(shè)計引物探針所用軟件為Primer express 2.0軟件，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，常規(guī)的化學試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 標本采集 3組患者標本均在術(shù)前0.5 h(排除患者本身日常生活及手術(shù)準備影響)內(nèi)采取子宮內(nèi)膜組織，術(shù)后即刻 (保證離體子宮內(nèi)膜組織的細胞凋亡率及基因表達未受其他因素影響)取子宮內(nèi)膜組織，并置于－80℃冰箱待測。

1.3.2 流式細胞儀測定細胞凋亡率

1.3.2.1 單細胞懸液的制備 取受檢組織0.5～1.0 g，置于重疊的100目銅網(wǎng)及300目尼龍網(wǎng)上，切成1 mm×1 mm×1 mm碎塊，以眼科鑷持碎塊在網(wǎng)上揉搓，邊搓邊用磷酸緩沖液(PBS)將搓下的細胞沖洗液置于網(wǎng)下方的平面皿中，直至將組織搓完，收集細胞懸液于10 ml離心管中，以800 r/min離心5 min，以2 ml PBS液漂洗，再以1 500 r/min離心5 min，棄上清液，調(diào)整細胞數(shù)為106/ml，4℃保存。

1.3.2.2 細胞凋亡率的檢測 將細胞溶液吸人5 ml試管中，1 500 r/min離心5 min，以PBS液漂洗后再離心，PBS液漂洗后以100目篩網(wǎng)過濾，1 500 r/min再離心5 min，加入PI工作液0.5 ml(工作濃度為10 μg/ml)，室溫避光反應(yīng)30 min。用流式細胞儀檢測細胞凋亡率及細胞周期。檢測前以標準熒光微球調(diào)整儀器的變異系數(shù)并穩(wěn)定在2%以內(nèi)，上機收集2×104個細胞，熒光強度以對數(shù)放大，光散射數(shù)據(jù)存軟盤，測試完畢后用Modifit軟件 (BD公司提供)分析數(shù)據(jù)。分析時用設(shè)門方法(橫坐標前向角，縱坐標側(cè)向角)將壞死細胞框除，計算細胞凋亡率。細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.3.3 實時熒光定量RT－PCR檢測MTA1、nm23－H1基因表達水平

1.3.3.1 引物探針 基因序列如下

1.3.3.2 引物探針/基因序列 (1)H β－actin forward/5'GGA TGC AGA AGG AGA TCA CTG 3';(2)H β－actin probe/FAM－CAG GAG GAG CAA TGA TCT TGA TCT TCATTGTGCBHQ1; (3)H β－actin reverse/5'CGA TCC ACA CGG AGT ACT TG 3'; (4)H MTA1 forward/5'CCT ACC TGC CCA TCA ACA GCG C3';(5)h MTA1 probe/FAM－CCA TCA AGG CCG AGTGCACGGCGC－BHQ1;(6)HMTA1reverse/5'TCAGCA CCA GCG GGC TCT G3';(7)H nm23－H1forward/5'TTT GAG CAG AAA GGA TTC C3';(8)h nm23－H1 probe/FAM－TGT TGG TCT GAA ATT CAT GCA AGC TTC C－BHQ1;(9)h nm23－H1 reverse/5'AAC GTA GTG TTC CTT GAG3'。

1.3.3.3 人子宮內(nèi)膜 (癌)組織總RNA的提取 (1)從超低溫冰箱中取出人子宮內(nèi)膜 (癌)組織樣本，迅速用剪刀剪下約0.25 g樣品，置于預(yù)先加入200 μl RNAisoTMPlus的1.5 ml EP管中。 (2)在RNAisoTMPlus溶液中破碎人子宮內(nèi)膜(癌)組織，補充800 μl RNAisoTMPlus，混勻。在冰上靜置5 min，再加入200 μl氯仿，蓋緊后劇烈振蕩15 s(氯仿沸點低、易揮發(fā)，振蕩時應(yīng)小心離心管蓋突然彈開)。待溶液充分乳化后，在冰上靜置5 min。(3)4℃，13 000 r/min高速離心樣品15 min后，將上層水相移至新管中，然后加入等體積的異丙醇，冰上放置10 min，4℃，13 000 r/min離心10 min。(4)棄上清，用1 ml 75%乙醇〔焦碳酸二乙酯 (DEPC)水配制〕洗滌沉淀，來回顛倒數(shù)次，4℃，13 000 r/min離心5 min。(5)棄上清，空氣干燥RNA 10 min，用20 μl DEPC水溶解，立即取2 μl RNA做反轉(zhuǎn)錄，剩余18 μl－80℃凍存。

1.3.3.4 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 抽提的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄:取2 μl RNA模板做逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系如下:RNA的熱變性，先配好以下體系:25 μmol/L 隨機引物 (random primer)1 μl，DEPC 水 9 μl，RNA 2 μl，總共12 μl。65 ℃ 水浴5 min 后迅速在冰上冷卻2 min，簡短離心收集反應(yīng)液。反應(yīng)液配置 (20 μl體系) 第一步變性后的 RNA 溶液 12 μl，5×RT buffer 4 μl，dNTP mixture(各 10 mmol)2 μl，RNase Inhibitor(10 U/μl)1 μl，Rever Tra Ace 1 μl;RT 反應(yīng)程序:30 ℃ 10 min，42 ℃20 min，99℃ 5 min，4℃ 5 min。

1.3.3.5 熒光定量PCR反應(yīng) 配制反應(yīng)體系共25 μl:10 PCR buffer 2.5 μl，2.5 mmol dNTP 2 μl，dH2O 16 μl，15 μmol/L 引物 1+1 μl，15 μmol/L 探針 0.3 μl，5 U/μl Taq 0.2 μl，Template 2 μl，PCR buffer成分:100 mmol Tris－ HCl緩沖液 (pH=8.3)，500 mmol KCl，15 mmol MgCl2;反應(yīng)過程:94℃ 2min，94℃ 5 s，55℃，30 s，40個循環(huán)，讀取羧基熒光素 (FAM)熒光數(shù)值;30℃ 5 s。樣本同一個檢測指標基因統(tǒng)一上機，每個標本分別做2個待檢測基因以及內(nèi)參β肌動蛋白 (β－actin)的熒光定量PCR。

1.4 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料細胞凋亡率及基因表達量均采取配對樣本的t檢驗，以P＜0.001為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 平均細胞凋亡率 腹腔鏡手術(shù)組術(shù)后子宮內(nèi)膜癌平均細胞凋亡率較術(shù)前增高，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.001);開腹手術(shù)組和空白對照組手術(shù)前后子宮內(nèi)膜癌平均細胞凋亡率無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0.001，見表1)。

2.2 MTA1基因表達量 腹腔鏡手術(shù)組術(shù)后子宮內(nèi)膜癌組織MTA1基因表達量較術(shù)前降低，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.001);開腹手術(shù)組和空白對照組手術(shù)前后MTA1基因表達量無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0.001，見表1)。

2.3 nm23－H1基因表達量 腹腔鏡手術(shù)組術(shù)后子宮內(nèi)膜癌組織nm23－H1基因表達量較術(shù)前增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001);開腹手術(shù)組和空白對照組手術(shù)前后nm23－H1基因表達量無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0.001，見表1)。

表1 3組標本手術(shù)前后細胞凋亡率、MTA1基因及nm23－H1基因表達量的比較Table 1 Comparison of specimens cell apoptosis rate，MTA1 gene and nm23－H1 gene expression amount before and after surgery in three groups

3 討論

腫瘤的發(fā)生源于細胞的異常增殖，表現(xiàn)為自主性生長的生物學行為。正常情況下，細胞的增殖與凋亡維持組織中細胞總數(shù)的動態(tài)平衡，一旦細胞的增殖異?；蚣毎蛲霭l(fā)生異常，均可導致細胞的惡性轉(zhuǎn)化，發(fā)生腫瘤。隨著研究工作的不斷深入，越來越多的資料表明，細胞凋亡異常在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中占有重要位置。隨著細胞凋亡研究在醫(yī)學、生物學各個領(lǐng)域的不斷深入，發(fā)現(xiàn)細胞凋亡的誘導因素多種多樣。同一種組織和細胞受到不同因素的誘導，其凋亡的結(jié)果不盡相同，而一種誘導因素對不同的組織和細胞誘導凋亡的結(jié)果也不盡相同。細胞凋亡受體內(nèi)、體外多種因素的影響，如系統(tǒng)信息、離子輻射及病毒感染等引起的細胞損傷、釋放細胞生長因子、細胞之間的相互作用以及激素釋放水平的變化，均影響細胞凋亡［4－5］。

本研究發(fā)現(xiàn)，在腹腔鏡手術(shù)機體環(huán)境改變時，子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡率由術(shù)前的 (3.55±0.60)%升高至術(shù)后的 (25.23±2.16)%，差異有顯著性;空白對照組正常子宮內(nèi)膜細胞的凋亡情況手術(shù)前后無明顯變化;開腹手術(shù)對子宮內(nèi)膜癌細胞的凋亡率亦未見明顯影響。這說明腹腔鏡手術(shù)時機體環(huán)境的改變作為一種誘因只影響子宮內(nèi)膜癌細胞的凋亡狀態(tài)，且是一種升調(diào)節(jié)，而對正常子宮內(nèi)膜細胞的凋亡情況沒有影響。同時本研究還表明子宮內(nèi)膜癌細胞的凋亡情況不受開腹手術(shù)刺激的影響，可見腹腔鏡手術(shù)刺激作用有助于子宮內(nèi)膜癌細胞的凋亡。

MTA1基因是從大鼠乳腺癌細胞系13762NF細胞中分離發(fā)現(xiàn)的，MTA1基因以共價修飾組蛋白、編碼轉(zhuǎn)錄因子、參與信號傳導途徑、調(diào)節(jié)有關(guān)基因的表達等方式，調(diào)節(jié)細胞的生長，影響腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。在MTA1過度表達的腫瘤一般均表現(xiàn)為深的漿膜層腫瘤浸潤度、高的淋巴結(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移率和顯著的血管腫瘤侵襲性［6］。nm23基因是從K－1735鼠黑色素瘤細胞株中用消減雜交法分離出來的一種與惡性腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因，即腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。人類nm23基因cNDA有兩個亞型即nm23－H1、nm23－H2。發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤與未發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移者相比，nm23－H1的表達水平明顯降低，未發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤患者的nm23－H1表達陽性率明顯高于發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移者［7］。

本研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌腹腔鏡術(shù)前轉(zhuǎn)移促進基因MTA1的表達水平明顯高于術(shù)后，轉(zhuǎn)移抑制基因nm23－H1的表達水平明顯低于腹腔鏡術(shù)后，兩者差異均有顯著性;子宮內(nèi)膜癌開腹手術(shù)組及空白對照組正常子宮內(nèi)膜組織中MTA1、nm23－H1基因表達量無明顯差異;子宮內(nèi)膜癌腹腔鏡術(shù)后轉(zhuǎn)移促進基因MTA1表達量明顯低于子宮內(nèi)膜癌開腹術(shù)后，而轉(zhuǎn)移抑制基因nm23－H1表達量明顯高于子宮內(nèi)膜癌開腹術(shù)后。這說明在腹腔鏡手術(shù)時，機體腹腔內(nèi)環(huán)境的改變對子宮內(nèi)膜癌組織MTA1基因的表達呈降調(diào)節(jié)，nm23－H1基因的表達成升調(diào)節(jié)，通過影響細胞轉(zhuǎn)移參與調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜癌細胞的轉(zhuǎn)移潛能，而開腹手術(shù)對MTA1、nm23－H1基因的表達無明顯影響，同時說明正常子宮內(nèi)膜組織中以上兩基因的表達水平不受腹腔鏡手術(shù)環(huán)境改變的影響。

綜上，本實驗研究發(fā)現(xiàn):腹腔鏡手術(shù)后子宮內(nèi)膜癌細胞的凋亡率明顯上升，其機制可能與機體受腹腔鏡氣腹刺激，內(nèi)環(huán)境動態(tài)失衡有關(guān)，并且可能通過升調(diào)節(jié)nm23基因的表達和降調(diào)節(jié)MTA1基因的表達，從而抑制其轉(zhuǎn)移潛能。而腹腔鏡手術(shù)對子宮內(nèi)膜細胞凋亡率無影響，且不影響其nm23、MTA1基因的表達，這可能與機體細胞所處的功能狀態(tài)有關(guān)。從而可以得出腹腔鏡手術(shù)用于治療子宮內(nèi)膜癌具有抑制其細胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力的作用，是一種安全的手術(shù)方法。

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