抗體介導(dǎo)骨再生的研究進(jìn)展

楊 瑤，陳方淳,3*

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，重慶，401120；2.口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶，401120；3.重慶市高校市級(jí)口腔生物醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶，401120）

創(chuàng)傷、骨腫瘤切除、骨髓炎手術(shù)清創(chuàng)等多種原因造成的骨缺損仍然是臨床醫(yī)生所面臨的一大難題。傳統(tǒng)的自體骨和異體骨移植占每年骨移植的90%以上[1,2]。但是，骨移植有許多缺點(diǎn)，如供體有限、供體部位的發(fā)病率高（如感染、疼痛、出血和神經(jīng)損傷）及成本較高[3]。骨組織工程旨在協(xié)調(diào)生物材料支架、細(xì)胞和分子信號(hào)的生物學(xué)優(yōu)勢(shì)，以介導(dǎo)骨再生。目前，骨組織工程有多種形式，包括基因治療，干細(xì)胞治療及蛋白質(zhì)治療。其中蛋白質(zhì)治療，使用生長(zhǎng)因子或細(xì)胞因子，包括靶向運(yùn)輸和載體持續(xù)釋放治療蛋白。外源性骨誘導(dǎo)生長(zhǎng)因子包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、血管生長(zhǎng)因子等，他們具有良好的生物相容性，已被用于骨組織工程[4,5]。其中TGF-β超家族中的骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）在骨愈合中的作用已經(jīng)被廣泛研究，其中內(nèi)源性BMP2在骨再生的初始級(jí)聯(lián)中起著至關(guān)重要的作用[4]。有在2002年重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 (recombinant human bone morphogenetic protein 2,rhBMP-2)和rhBMP-7已被美國(guó)食品和藥物管理局（Food and Drug Administration,FDA）批準(zhǔn)用于脊柱融合等骨相關(guān)疾病的治療[6]。rhBMP2不僅被證明可以促進(jìn)新骨形成，招募骨母細(xì)胞，而且還可以促進(jìn)血管生成[7]。然而，rhBMP2使用的過程中也有一些自身局限，如使用量需超出生理劑量，在體內(nèi)半衰期短、生物活性低等不足[8]。且近年來(lái)隨著臨床使用增多，rhBMP2的并發(fā)癥報(bào)道迅速增多，發(fā)生率約為20-70%，主要包括嚴(yán)重水腫、骨塌陷、愈合不良、異位成骨等，嚴(yán)重者可致生命威脅[9]。

理想的骨再生法可以加速和擴(kuò)大宿主的再生反應(yīng)，但不會(huì)引起有害的副作用。對(duì)于研究者來(lái)說(shuō)使用一種可以全身或者局部遞送治療藥物然后激活或者結(jié)合體內(nèi)內(nèi)源性因子尤其是骨形態(tài)發(fā)生蛋白的骨再生方法是值得深入探索的一項(xiàng)研究。

免疫球蛋白G（IgG）是體液免疫的主要構(gòu)成要素，具有結(jié)構(gòu)保守的N-糖基化Fc端，以及兩個(gè)具有特異性抗原識(shí)別能力的Fab端，包括四型（IgG1，IgG2，IgG3及IgG4），其中IgG1與IgG2為主要應(yīng)用類型[10]。傳統(tǒng)的IgG抗體治療主要利用Fab端中和靶向抗原的作用，目前超過20多種單克隆抗體已成功用于治療腫瘤、自身免疫性疾病與感染性疾病等[11]。但是抗體在骨再生方面的研究較少，所以本篇文章主要是總結(jié)抗體介導(dǎo)的骨再生的研究現(xiàn)狀。

1 抗體介導(dǎo)骨再生的概念

在2011年Freire等人針對(duì)重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（rhBMP2）的不良免疫反應(yīng)以及超生理劑量等問題提出了抗體介導(dǎo)的骨再生技術(shù)，顯示了在動(dòng)物模型中利用抗體捕捉內(nèi)源性骨形態(tài)發(fā)生蛋白可促進(jìn)骨形成的可能性[12]。首先，他們提出假設(shè)為能夠參加AMOR的抗體分子必須具有下列特性:1.對(duì)內(nèi)源性BMP-2有較高親和力；2.BMP-2抗原表位能與BMP-2受體結(jié)合區(qū)域的遠(yuǎn)程；3.Ab-BMP2免疫復(fù)合物能夠與骨祖細(xì)胞細(xì)胞表面的BMP2受體結(jié)合；4.Ab-BMP-2免疫復(fù)合物能夠介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)；5.Ab-BMP2免疫復(fù)合物對(duì)成骨分化有調(diào)節(jié)作用；6.抗體在宿主中不存在有害的局部或全身免疫反應(yīng)。針對(duì)以上假設(shè)，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：并不是所有的抗體形成免疫復(fù)合物后能夠與細(xì)胞表面的受體結(jié)合及進(jìn)一步促進(jìn)骨形成；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示：與對(duì)照組相比，只有鼠源性單克隆抗體4B12和3G7可以顯著增加顱頂骨缺損模型中的骨密度。此外，單克隆抗體（mAb）組顯示形成骨量比多克隆抗體（pAb）組多17-24%，猜測(cè)這可能是由于pAb和mAb之間的免疫特性差異造成的，因?yàn)槎嗫寺】贵w會(huì)與許多表位反應(yīng)，其中一些表位可能阻斷了內(nèi)源性BMP-2與其細(xì)胞受體之間的結(jié)合從而抑制了成骨。之后研究人員使用嵌合型單克隆抗體克服鼠源性單抗可能帶來(lái)的潛在不良免疫反應(yīng)，在大鼠顱頂骨缺損模型第6周時(shí)評(píng)估了骨充填率，鼠源性單克隆抗體組的骨充填率為7%-42%[12]，嵌合單克隆抗體為8%-46%[13]，兩者成骨能力無(wú)明顯顯著差異，這可能是與鼠和人的BMP2基因有顯著的同源性有關(guān)（92.2%）[14]。因此決定AMOR潛力的抗體的關(guān)鍵特征在很大程度上是未知的。此外其他研究進(jìn)一步顯示，抗體不僅能夠?qū)?nèi)源性BMP2招募到骨缺損區(qū)域并與之結(jié)合，還能與內(nèi)源性BMP4和BMP7結(jié)合進(jìn)一步增強(qiáng)內(nèi)源性信號(hào)和促進(jìn)成骨促進(jìn)骨再生的能力[15]。2014年，Ansari等人評(píng)估了大鼠顱頂骨缺損局部應(yīng)用1ug/ml至100ug/ml的不同劑量的單克隆抗體的成骨效能，根據(jù)組織形態(tài)學(xué)和顯微CT檢查結(jié)果顯示了25ug/ml的濃度可以形成最大骨量，同時(shí)在抗體植入的部位發(fā)現(xiàn)大量的細(xì)胞浸潤(rùn)。且該研究在體外進(jìn)一步探索了Ab-BMP2免疫復(fù)合物與C2C12細(xì)胞（成肌細(xì)胞）結(jié)合后細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，結(jié)果顯示Ab-BMP2免疫復(fù)合物組細(xì)胞高表達(dá)Runx2和p-Smad1，而抑制成骨細(xì)胞分化的因子Smad6的表達(dá)無(wú)明顯改變[16]。因此猜測(cè)Ab-BMP2免疫復(fù)合物通過經(jīng)典的Smad信號(hào)通路促進(jìn)骨生成。Qingqing Wu等人進(jìn)一步體外研究證明：Ab-BMP2免疫復(fù)合物與干細(xì)胞表面的BMP2受體結(jié)合后，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)BMP2/Smad/Runx2信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞成骨分化[17]。但是免疫復(fù)合物具體的作用方式及通路還需進(jìn)一步探索。目前，對(duì)于rhBMP2及抗體介導(dǎo)的骨再生所形成的骨質(zhì)還有一些爭(zhēng)議。在Ansari[16]、Freire[13]及Moshaverinia[18]等人的研究中rhBMP2和Ab-BMP2免疫復(fù)合物組及rhBMP2和抗BMP2抗體組沒有觀察到骨礦化的差異。但是在有的研究中發(fā)現(xiàn)植入rhBMP2組的顱骨缺損部位表現(xiàn)出異常的組織學(xué)形態(tài)，伴有營(yíng)養(yǎng)不良型性鈣化[8]。無(wú)論如何，根據(jù)所有這些事實(shí)，可以得出結(jié)論，局部應(yīng)用抗體促進(jìn)骨愈合的能力與rhBMP2相當(dāng)且可能要優(yōu)于rhBMP2。

1.1 抗體糖基化改性

有研究表明抗體的糖基化修飾可能會(huì)改變抗體結(jié)合抗原的能力及Fc端介導(dǎo)的效應(yīng)，同時(shí)糖基化的靶向修飾已經(jīng)成為生產(chǎn)免疫治療藥物的重要部分。Qingqing Wu等人改變了抗BMP2抗體的唾液酸化，以研究糖基化對(duì)抗體介導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響[19]。體外研究顯示：Ab-BMP2免疫復(fù)合物能通過結(jié)合BMP2受體在體外刺激骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，但誘導(dǎo)潛能不受體外唾液酸化程度的顯著影響。但是在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)：過度唾液酸化的Ab-BMP2免疫復(fù)合物介導(dǎo)成骨的能力增強(qiáng)，而去唾液酸化組的成骨能力受到抑制。唾液酸化對(duì)BMP2-ICs成骨潛能的影響在體內(nèi)和體外研究中是不一致的，這些相互矛盾的結(jié)果表明Ab-BMP2免疫復(fù)合物中的BMP2不是決定免疫復(fù)合物在體內(nèi)成骨潛能的唯一部分。這些問題需要進(jìn)一步研究。

2 抗體介導(dǎo)的骨再生研究模型

上述研究都是是采用大鼠顱頂骨缺損模型，后續(xù)有用較大型的兔子的顱骨缺損模型[13]，及犬及非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物下頜骨節(jié)段連續(xù)性缺損模型及脛骨不連續(xù)缺損模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[20,21,22]。在犬的下頜骨節(jié)段連續(xù)性缺損模型觀察12周后，與rhBMP2組相比，單克隆抗體組形成的骨密度更高且人的正常骨密度相當(dāng)。同樣在獼猴的下頜骨及脛骨缺損模型中，也有相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。之前的體內(nèi)研究都是采用原位成骨模型，而在Qingqing Wu等人的研究中采用了異位成骨模型，即在小鼠皮下注射包含抗體及細(xì)胞的藻酸鹽微球[17]。與原位成骨模型相比，皮下植入的皮內(nèi)環(huán)境減少了內(nèi)源性骨形成細(xì)胞、骨刺激細(xì)胞因子、機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)及其他相關(guān)因素的影響。藻酸鹽微球被用作載體來(lái)傳遞和固定細(xì)胞，Abs或rhBMP2。微球不具有任何骨誘導(dǎo)功能。因此，異位成骨模型在理論上確保了新形成的骨是由于植入的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞（iPSC-derived mesenchymal stromal cells,iMSC）（Induced pluripotent stem cells,iPSCs）、抗BMP2單克隆抗體、rhBMP2或它們的組合效應(yīng)的成骨潛能。體內(nèi)研究顯示：抗體的促骨再生效果優(yōu)于直接使用rhBMP2，表現(xiàn)為在rhBMP2誘導(dǎo)下局部形成營(yíng)養(yǎng)不良性鈣化，而抗體組所誘導(dǎo)的新生骨則具有生理性板層狀骨小梁結(jié)構(gòu)，TRAP染色抗體組陽(yáng)性細(xì)胞增多，猜測(cè)這可能與抗體植入局部出現(xiàn)了支持骨改建的破骨細(xì)胞相關(guān)。

在所有采用局部使用抗體的動(dòng)物研究中，未報(bào)告任何種類的不良免疫反應(yīng)，包括血清病、急性過敏反應(yīng)和細(xì)胞因子釋放綜合征及局部皮膚反應(yīng)。低濃度局部使用的治療性單克隆抗體的不良發(fā)生率相對(duì)較低且安全性較高。在人類臨床試驗(yàn)開始之前，需要更嚴(yán)格的毒理學(xué)研究及深入研究。

3 抗體介導(dǎo)的骨再生的支架

不同的骨缺損可能需要不同的物理性質(zhì)的支架材料，其中鈦、生物陶瓷，羥基磷灰石和可吸收明膠海綿三者各有優(yōu)勢(shì)；ACS和藻酸鹽具有很高的生物相容性和生物降解性，適用于不需要抗壓強(qiáng)度的骨內(nèi)缺損[18]；而Ti及生物陶瓷因其具有較強(qiáng)的剛性，適用于在整形外科和頜骨的骨缺損[23]。

Moshaverinia 等人展示了一種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和抗體的共囊技術(shù)結(jié)合到RGD偶聯(lián)藻酸鹽水凝膠體系[18]。他們的研究再次證實(shí)了抗原抗體復(fù)合物和干細(xì)胞上的BMP2受體之間的交叉連接，且體內(nèi)骨量增加明顯。而Qingqing Wu等人則通過采用包含iMSCs和抗體的藻酸鹽微球體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠皮下植入iMSCs +3G7組的位點(diǎn)顯示出顯著的骨形成和血管形成，且該組的實(shí)驗(yàn)效果優(yōu)于3G7組[17]。因此干細(xì)胞和生物分子的同時(shí)應(yīng)用可以為組織工程提供一個(gè)改善骨缺損愈合的微環(huán)境。

4 總結(jié)

對(duì)于臨床醫(yī)生，骨缺損的重建是最具挑戰(zhàn)性的問題之一。在這方面，尋找新的方法來(lái)克服傳統(tǒng)方法的一些缺點(diǎn)對(duì)研究人員來(lái)說(shuō)是十分必要的。該文章表明，局部應(yīng)用抗體將內(nèi)源性生物活性分子吸引到缺陷部位進(jìn)一步促進(jìn)骨再生的方法具有可行性，但是如果將其用于臨床需要更多方位的研究。