急性髓系白血病DNA異常甲基化及治療進(jìn)展

馮秀娟， 吳 濤， 白 海

（中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院全軍血液病中心，甘肅 蘭州730050）

急性髓系白血?。╝cute myeloid leukaemia，AML）是一組造血細(xì)胞異常增殖和分化抑制造成的惡性克隆性血液疾病，具有明顯異質(zhì)性，有單個或多個分子遺傳學(xué)事件參與其發(fā)病[1]。世界衛(wèi)生組織（World Health Organization,WHO）根據(jù)白血病患者臨床特點(diǎn)及形態(tài)學(xué)（morphology,M）、細(xì)胞免疫學(xué)（immunology,I）、細(xì)胞遺傳學(xué)（cytogenetic,C）、分子生物學(xué)（molecular biology,M）異常制定了MICM分型，指導(dǎo)臨床對白血病的診斷分型、個體治療和預(yù)后判斷。隨著現(xiàn)今醫(yī)學(xué)的發(fā)展及患者的期望值升高，對白血病的治療方案愈來愈趨向于個體化、精準(zhǔn)化、靶向化。DNA甲基化作為AML表觀遺傳學(xué)調(diào)控的常見模式，對其研究促進(jìn)了近年來DNA甲基化治療藥物的發(fā)展，給AML的靶向治療提供更多選擇。

DNA甲基化在AML中的致病機(jī)制

DNA甲基化過程廣泛存在于哺乳動物細(xì)胞內(nèi)，在表觀遺傳修飾和染色質(zhì)穩(wěn)定性中起關(guān)鍵作用。有研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化能夠關(guān)閉某些基因的活性，導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象以及DNA與蛋白質(zhì)的相互作用方式發(fā)生變化，進(jìn)而調(diào)控基因的表達(dá)。而近年針對表觀遺傳學(xué)中DNA甲基化的研究發(fā)現(xiàn)，DNA的異常甲基化與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切，其主要致癌機(jī)制為，抑癌基因啟動子區(qū)被異常甲基化致抑癌基因表達(dá)沉默進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[2]。大量關(guān)于AML的研究中發(fā)現(xiàn)，異常的DNA甲基化水平是AML顯著的病理特征。另有部分專家認(rèn)為DNA異常甲基化參與影響骨髓分化，是造成白血病的又一發(fā)生機(jī)制[3-4]。

DNA甲基化的生物學(xué)特點(diǎn)

DNA甲基化由DNA甲基化酶（DNA methyltransferase，DNMT）介導(dǎo)，DNMT維持細(xì)胞內(nèi)DNA甲基化正常進(jìn)行，將甲基化標(biāo)簽從親代鏈復(fù)制到子代鏈[5-6]。DNMT以S-腺苷-L-甲硫氨酸作為甲基來源，將DNA中胞嘧啶的第5位碳原子甲基化，從而轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶 （5-methylcytosine,5-mC），這些甲基化基因序列可有效抑制DNA的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致相關(guān)基因表達(dá)缺失，進(jìn)而導(dǎo)致疾病發(fā)生。在哺乳動物基因組中，DNA甲基化的主要位點(diǎn)是CpG二核苷酸，其在基因組中呈不均勻分布。在某些區(qū)域，CpG序列的密度較平均密度高10～20倍，這些區(qū)域被稱為CpG島，常位于基因上游調(diào)控區(qū)的啟動子區(qū)。在啟動子區(qū)的CpG島通常處于非甲基化狀態(tài)，使基因正常表達(dá)。CpG島區(qū)域的胞嘧啶異常甲基化可影響基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，導(dǎo)致腫瘤抑制基因突變和缺失，負(fù)調(diào)控因子缺失或者失活，使正?；虮磉_(dá)沉寂，最終導(dǎo)致機(jī)體腫瘤發(fā)生。

DNA甲基化在AML中的修飾作用

AML DNA甲基化異常包括低甲基化和高甲基化，低甲基化可致染色體不穩(wěn)定，使基因異?；罨鏏ML患者中DNMT3A基因的缺失和突變將導(dǎo)致AML腫瘤細(xì)胞基因組DNA總甲基化水平降低，促使癌基因活化，患者預(yù)后不良。與大多數(shù)基因組相比，高甲基化則常發(fā)生在基因啟動子區(qū)域，導(dǎo)致基因沉默，如血液惡性腫瘤中抑癌基因高甲基化則導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、發(fā)展[7-8]。

AML患者中常見DNA甲基化的相關(guān)基因

AML中常見的甲基化調(diào)節(jié)蛋白包括DNMT3A、10-11易位癌基因家族成員2（ten-eleven translocation 2，TET2）、異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）1/2。DNMT3A催化CpG核苷酸殘端胞嘧啶甲基化，TET2則催化甲基化的5-mC羥基化形成5-羥甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5-hmC）達(dá)到去甲基化。IDH1/2催化異檸檬酸鹽氧化脫羧作用產(chǎn)生α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid，α-KG），而α-KG是TET2羥化反應(yīng)必需的底物。一旦這些調(diào)節(jié)蛋白基因突變就會造成DNA異常甲基化。

一、DNMT3A

DNMT3A編碼的DNMT參與從頭甲基化，在基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5’碳位共價鍵結(jié)合1個甲基基團(tuán)，能阻斷轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物與DNA的結(jié)合，從而抑制基因表達(dá)，參與細(xì)胞的生長、分化、調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)DNMT3A基因沉默可導(dǎo)致造血干細(xì)胞增殖和分化功能受損，故當(dāng)造血干細(xì)胞攜帶DNMT3A突變時，可表現(xiàn)為白血病前期階段，當(dāng)機(jī)體伴發(fā)其他突變時可進(jìn)展為AML。所以DNMT3A基因也被大多數(shù)研究認(rèn)為是驅(qū)動基因[9]。Jones等[10]研究發(fā)現(xiàn)DNMT3A基因缺失和突變可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞基因組DNA總甲基化水平降低，促使癌基因活化。臨床上伴該突變AML患者的生存期縮短，復(fù)發(fā)風(fēng)險增加，常提示預(yù)后不良。此外，DNMT3A突變在疾病演變過程中穩(wěn)定，可以成為檢測白血病微小殘留?。╩inimal residual disease，MRD）的分子標(biāo)志物。

二、TET2

TET2編碼TET2蛋白，是生物體內(nèi)存在的α-KG和Fe2+依賴的雙加氧酶，該蛋白可以催化5-mC轉(zhuǎn)化為5-hmC，是DNA去甲基化過程中的一種重要酶，能阻止干細(xì)胞、祖細(xì)胞的不可控生長，進(jìn)而阻止腫瘤形成。TET2突變使TET2蛋白功能丟失，從而導(dǎo)致造血干細(xì)胞異常增殖及分化。目前TET2突變與AML患者預(yù)后尚無共識性結(jié)論，其在疾病進(jìn)展過程中表現(xiàn)不穩(wěn)定，在復(fù)發(fā)時經(jīng)常丟失，故不能作為監(jiān)測MRD的穩(wěn)定指標(biāo)。

三、IDH1/2

IDH基因突變通過使組蛋白和DNA的甲基化來降低相關(guān)分化調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，導(dǎo)致造血細(xì)胞分化受阻和惡性克隆的形成，引起AML發(fā)生、發(fā)展。AML中IDH突變亞型常見的有IDH1、IDH2。羅麗卿等[11]研究發(fā)現(xiàn)IDH基因突變更多見于正常核型的AML患者，常伴發(fā)核仁磷蛋白1（nucleophosmin 1，NPM1）基因突變，與療效密切相關(guān)，是提示預(yù)后不良的分子標(biāo)志物。IDH1、IDH2突變在疾病演變過程中高度穩(wěn)定，可考慮作為監(jiān)測MRD的潛在分子標(biāo)志物。

DNA異常甲基化對AML患者預(yù)后的影響

基因啟動子的高甲基化狀態(tài)是影響AML患者預(yù)后的重要風(fēng)險因素[2,6,8-9]。CpG島甲基化狀態(tài)影響蒽環(huán)類藥物的敏感性，故糾正表觀遺傳學(xué)異常可以逆轉(zhuǎn)復(fù)發(fā)特異性基因表達(dá)譜，恢復(fù)化療藥物敏感性，產(chǎn)生更強(qiáng)的細(xì)胞毒作用。另DNA甲基化對AML的預(yù)后與受影響的基因有關(guān)，如抑癌基因乳腺癌缺失基因1（deleted in breast cancer 1，DBC1）參與細(xì)胞周期調(diào)控，但有研究顯示DBC1基因CpG島甲基化的染色體核型正常的AML患者10年生存率明顯低于非甲基化患者[7]。CCAAT/增 強(qiáng) 子 結(jié) 合 蛋 白α（CCAAT/enhancer binding protein,C/EBPα）雙突變是預(yù)后良好的標(biāo)志，超過70%可長期生存，而DNA甲基化導(dǎo)致該基因靜默的AML患者近80%會復(fù)發(fā)。且患者常發(fā)生DNA甲基化的相關(guān)基因均提示預(yù)后不良，表示DNA異常甲基化與AML患者的預(yù)后明確相關(guān)，且目前相關(guān)研究多提示預(yù)后不良。

DNA甲基化在AML治療中的進(jìn)展

目前臨床上針對研究DNA甲基化的藥物有：去甲基化治療藥物如地西他濱及阿扎胞苷（azacitidine,AZA）；蒽環(huán)類化療藥物如多柔比星、伊達(dá)比星；降低哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）甲基化的藥物如西羅莫司等。雖然目前對該類藥物應(yīng)用較為廣泛，但其合理用藥方面仍存在一些問題亟待解決。

一、去DNA甲基化

目前去DNA甲基化藥物主要為DNMT抑制劑，可分為核苷類和非核苷類2類，核苷類去甲基化藥物中的AZA和地西他濱是目前獲準(zhǔn)應(yīng)用于臨床較廣泛的去甲基化藥物。DNA高甲基化導(dǎo)致抑癌基因不表達(dá)從而導(dǎo)致細(xì)胞分化功能受抑制是AML重要的發(fā)生機(jī)制[12]，AZA和地西他濱通過抑制DNMT1使DNA去甲基化，借助逆轉(zhuǎn)甲基化過程，重新激活抑癌基因發(fā)揮治療血液腫瘤效果。臨床上主要用于原始細(xì)胞20%～30%的AML或原始細(xì)胞＞30%但無法耐受常規(guī)化療的老年患者[7]。

1.地西他濱：地西他濱（5-氮雜-2’-脫氧胞嘧啶核苷）作為脫氧核苷酸類似物，其中的5-氮雜胞嘧啶部分可代替胞嘧啶，被摻入DNA鏈中（5-氮雜-2’-脫氧胞嘧啶核苷是一種天然2’-脫氧胞苷酸的腺苷類似物，可直接作用于DNA）。氮雜胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷片段DNMT識別為天然的底物，5-氮雜胞嘧啶的第5位氮原子被甲基化。正常的胞嘧啶第5位是碳原子，甲基化修飾后可通過C-5位的β消除來使DNA與甲基化酶解離；而5-氮雜胞嘧啶的5位氮原子被甲基化后，不能發(fā)生上述β消除，使DNMT保持與DNA的共價結(jié)合，從而抑制該酶的功能，使DNA低甲基化[13]。有研究表明低濃度的甲基化抑制劑可促進(jìn)造血干細(xì)胞增殖，高濃度則抑制其增殖[14-15]。后通過臨床用藥亦證實(shí)地西他濱高劑量用藥與化療藥物的細(xì)胞毒性類似，骨髓抑制作用較明顯，低劑量用藥則主要實(shí)現(xiàn)去甲基化的作用，使腫瘤細(xì)胞DNA甲基化降低，重新激活抑癌基因，控制腫瘤細(xì)胞增殖[16]，從而治療白血病。

有研究應(yīng)用地西他濱20 mg/（m2·d）×5 d標(biāo)準(zhǔn)足劑量單藥治療高危骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome，MDS）和AML患者各10例，老年患者總有效率達(dá)77.8%，完全緩解（complete response，CR）率33.3%[17]，高于國內(nèi)外相關(guān)研究報道[18-19]；其中70歲以上老年患者占CR患者的83.3%，表明高齡老年患者對地西他濱的治療可能更為敏感，具體機(jī)制待進(jìn)一步研究明確。此項(xiàng)研究在對比診斷、性別、美國東 部 腫 瘤 協(xié) 作 組 （Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG）評分、白細(xì)胞計數(shù)、是否高危、是否合并基礎(chǔ)疾病及地西他濱治療療程是否≥3個等影響地西他濱療效因素的分析中，發(fā)現(xiàn)治療療程是否≥3個是地西他濱治療后能否達(dá)CR的影響因素（P＜0.05）。在接受3～26個療程的12例患者中，6例（50.0%）獲得CR，4例為AML患者，1例持續(xù)地西他濱治療26個療程但從未緩解的AML患者穩(wěn)定生存了26個月。MD安德森癌癥中心的一項(xiàng)Ⅲ期臨床對照研究顯示，地西他濱臨床CR率優(yōu)于常規(guī)支持治療和小劑量AZA，中位生存期未獲顯著延長，分別為7.7個月和5個月（P＝0.108）[20]。Blum等[21]將地西他濱劑量增至20 mg/（m2·d），共10 d，在接受中位3個療程治療后，總有效率為64%，其中47%患者達(dá)到CR，總生存（overal survival，OS）期和無進(jìn)展生存（progress free survival，PFS）期分別為55周和46周。表明應(yīng)延長地西他濱治療周期，以確保機(jī)體有足夠的機(jī)會作出反應(yīng)，原因可能為低濃度時地西他濱的去甲基化作用可重新激活抑癌基因，控制腫瘤細(xì)胞增殖，使腫瘤細(xì)胞分化、凋亡。而只有通過不斷持續(xù)地去甲基化治療，才能達(dá)到最大緩解。即使未達(dá)血液學(xué)緩解，持續(xù)的去甲基化治療也可改善患者癥狀，延緩疾病進(jìn)展，國內(nèi)外相關(guān)研究的結(jié)論一致[17,22-24]。另有報道顯示，地西他濱可有效提高DNMT3A突變相關(guān)AML患者的CR率及OS率[13,16]。

2.AZA：AZA亦稱5-氮雜胞苷，是一種胞嘧啶核苷類藥物，使5-氮雜胞嘧啶的第5位氮原子代替正常的胞嘧啶第5位碳原子被甲基化，從而阻止DNA的過度甲基化，作用機(jī)制基本同地西他濱。Sockel等[25]報道10例出現(xiàn)分子學(xué)復(fù)發(fā)的AML患者，中位應(yīng)用5個周期AZA進(jìn)行干預(yù)，隨訪10個月，7例患者出現(xiàn)MRD下降，并維持CR。MD安德森癌癥中心的Ⅲ期臨床對照研究中，AZA較常規(guī)支持治療組的CR率雖未明顯增加，但OS期明顯延長[20]。2010年的一項(xiàng)多中心、隨機(jī)、對照、開放性Ⅲ期臨床試驗(yàn)（AZA-001研究）結(jié)果顯示，相對傳統(tǒng)治療，AZA對高風(fēng)險的MDS患者療效更好，中位OS期更長（P＜0.000 1）[26]。據(jù)此數(shù)據(jù)，2008年歐洲聯(lián)盟批準(zhǔn)AZA用于治療MDS和骨髓原始細(xì)胞比例＜30%的AML患者。2015年公布的一項(xiàng)隨機(jī)、開放性Ⅲ期臨床試驗(yàn)研究（AZA-AML-001）顯示，對年齡≥65歲且骨髓原始細(xì)胞比例＞30%的新發(fā)AML患者，與傳統(tǒng)支持治療相比，AZA治療組顯著提高患者的1年生存率（34.2%比46.5%），且未達(dá)到CR的患者中位OS期自4.2個月延長至6.9個月（P＝0.017 0）[27]。2016年歐洲聯(lián)盟批準(zhǔn)AZA可治療骨髓原始細(xì)胞任何比例的老年AML患者。此后Pleyer等[28]選取與AZA-AML-001研究標(biāo)準(zhǔn)相同的407例新發(fā)AML患者進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩隊(duì)列中AZA治療患者的中位OS期分別為10.8個月和9.9個月，同時還比較了407例新發(fā)AML患者中符合AZA-AML-001研究納入標(biāo)準(zhǔn)與符合WHO的AML診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者數(shù)據(jù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩隊(duì)列患者的中位OS期分別為10.8個月和11.8個月。由此得出AZA作為一線用藥在實(shí)際臨床中治療骨髓原始細(xì)胞比例＞30%、白細(xì)胞計數(shù)≤15×109/L的AML患者有效，治療符合WHO AML診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者亦有效。目前國內(nèi)外研究均顯示AZA在治療AML患者中療效顯著，尤其對化療藥物耐受性較差的老年患者，且AZA對高風(fēng)險MDS或復(fù)發(fā)AML患者，在異基因造血干細(xì)胞移植后再以AZA進(jìn)行鞏固性治療可顯著減少或延緩疾病復(fù)發(fā)，延長患者 的OS期[29-30]。

有研究用小劑量地西他濱治療MDS患者，結(jié)果顯示患者生活質(zhì)量得到改善，延遲向白血病轉(zhuǎn)化，但對OS率無影響[31]。Welch等[32]使用20 mg/（m2·d）×10 d或5 d地西他濱治療116例具有不良遺傳學(xué)異常和分子學(xué)異常的AML或MDS患者，結(jié)果其緩解率高于低中71例AML/MDS患者。對去甲基化藥物治療AML/MDS的薈萃研究顯示，與常規(guī)治療方案相比，去甲基化藥物可以增加OS率（33.3%比21.4%）和總有效率（23.7%比13.4%），但進(jìn)一步亞組分析顯示AZA組OS率改善，而地西他濱組OS率無改善。因此，AZA是目前唯一臨床證實(shí)改善AML/MDS患者OS的去甲基化藥物[33]。

二、降低mTOR

mTOR參與細(xì)胞周期調(diào)控的多個步驟，是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長的關(guān)鍵蛋白，mTOR被異常激活后會促使癌細(xì)胞的高速分化，而當(dāng)西羅莫司與mTOR結(jié)合，其活性被抑制后能使細(xì)胞周期阻滯在G1期，抑制細(xì)胞異常增殖與分化。近年的研究證明，mTOR是抗癌、免疫抑制和抗衰老治療的重要靶點(diǎn)。石曉東等[34]在小鼠體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)DNMT3A可致mTOR的甲基化降低，而基因表達(dá)上調(diào)，上調(diào)的mTOR可進(jìn)一步調(diào)控下游基因引發(fā)白血病。預(yù)示mTOR可作為含有該類突變的AML潛在治療靶點(diǎn)。后通過檢測用西羅莫司處理前后有DNMT3A突變及無DNMT3A突變的AML患者原始腫瘤細(xì)胞的增殖及凋亡情況，證明了西羅莫司可通過靶向異常的mTOR基因發(fā)揮有效抑制DNMT3A突變原始腫瘤細(xì)胞的增殖并引起白血病細(xì)胞凋亡的作用，為臨床試驗(yàn)用藥提供了參考證據(jù)[35]。

三、蒽環(huán)類化療藥物

蒽環(huán)類藥物是AML誘導(dǎo)緩解的基本藥物，臨床常用的如多柔比星、伊達(dá)比星、米托蒽醌（屬蒽醌類衍生物）。蒽環(huán)類化療藥物雖具有廣譜抗瘤性，抗瘤作用強(qiáng)，療效確切，但其不良反應(yīng)亦較明顯。有研究表明通過使用比常規(guī)化療藥物更高劑量的蒽環(huán)類藥物，雖在一定程度上可改善患者預(yù)后，延長患者生存期，但也同時增加不良反應(yīng)及耐藥性。故研究作用于DNA甲基化靶點(diǎn)的藥物，減少藥物對身體各器官的不良反應(yīng)對治療AML非常重要[7]。

目前，臨床上去甲基化藥物治療AML療效不理想，主要與不規(guī)范使用有關(guān)。首先，DNA甲基化過程可逆，去甲基化藥物不能去除白血病干細(xì)胞，當(dāng)獲得療效后應(yīng)持續(xù)應(yīng)用，停止使用疾病就會復(fù)發(fā)。其次，去甲基化藥物缺乏基因特異性，任何基因甲基化都可能受到影響，治療過程中可能造成某些癌基因或抑癌基因異?；罨蜢o默，導(dǎo)致難治耐藥白血病發(fā)生。所以在去甲基化藥物治療前明確患者的甲基化狀態(tài)顯得尤為重要[7]。而在對包括DNMT3A基因在內(nèi)的諸多基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測，可利用分子生物學(xué)手段為個體化治療和靶向治療提供理論基礎(chǔ)。