非洲豬瘟病毒及其分子檢測技術(shù)研究進(jìn)展

呂美慧，曹際娟，李海濤，郭 昕，劉 俊

(1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院 ，遼寧 大連116000； 2.大連民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116605；3.天津市理化分析中心有限公司，天津 300051； 4.成都海關(guān)技術(shù)中心，四川 成都 610041)

1 流行現(xiàn)狀分析

ASF最早于1921年在肯尼亞暴發(fā)，隨后相繼擴(kuò)散至歐洲、中美洲、非洲和亞洲等多個國家。自2018年以來先后傳播到蒙古、越南、柬埔寨、老撾、朝鮮、菲律賓、緬甸、韓國、印度尼西亞等亞太國家。由該疫病的傳播范圍可以發(fā)現(xiàn)，此病毒可以不受地域限制進(jìn)行大范圍傳播，傳染性強(qiáng)，世界上所有開展養(yǎng)豬業(yè)的國家均有感染該病毒的風(fēng)險。2018年8月3日，經(jīng)中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心確診，ASF在我國沈陽首次發(fā)現(xiàn)[10]。隨后在江蘇、浙江等各個省份也陸續(xù)爆發(fā)。目前疫病仍在持續(xù)中[11]。2019年3月起豬肉價格快速上漲[12]，人民生活受到一定影響。由此可見，與往年爆發(fā)的生豬疫病、禽流感等不同，ASF的傳播范圍更廣，負(fù)面影響更大、程度更深，人民損失更重。

據(jù)中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部報導(dǎo)，2020年以來，全球共有26個國家和地區(qū)發(fā)生了2197起家豬和7238起野豬共計9435起非洲豬瘟疫情?？梢姺侵挢i瘟的傳播仍在繼續(xù)，對ASF的防控工作也勢在必行。

2 ASF檢測技術(shù)研究進(jìn)展

由于ASFV的感染機(jī)制極為復(fù)雜，基因型多，目前尚未研制出有效的疫苗，只能通過捕殺患病豬切斷傳染源，無害化處理，從而控制疫病傳播[13]。但這一方法會造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此對可能患病的豬群應(yīng)進(jìn)行早期ASFV檢測從而避免擴(kuò)大傳染尤為重要。ASFV的快速檢測主要分為兩大類：一類是分子生物學(xué)檢測，一類是免疫學(xué)檢測。

2.1 分子生物學(xué)檢測

2.1.1 常規(guī)PCR

PCR即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種用于擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可以看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制[14]，PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡單、迅速、對樣品的純度要求低等優(yōu)點(diǎn)。

LUO Yuzi,Atim Stella A等[15]根據(jù)GenBank中所有ASFV的vp72基因序列的高度保守區(qū)，設(shè)計了一對特異性引物，建立了一種PCR檢測方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，檢測限為每次反應(yīng)60個DNA拷貝。特異性實(shí)驗(yàn)未觀察到非ASF的擴(kuò)增信號。對來自不同地理區(qū)域的14株代表I、V、VIII和IX基因型的14株ASFV進(jìn)行檢測與OIE推薦的方法相比具有足夠的靈敏度與準(zhǔn)群性。多序列比對表明，本研究中使用的引物具有足夠的保守性，足以覆蓋這些基因II型菌株，可以靈敏、通用地檢測ASFV。

2.1.2 實(shí)時熒光定量PCR

我國在一段時期中的經(jīng)濟(jì)發(fā)展理念是先發(fā)展，之后再進(jìn)行治理，這種模式雖然能夠取得一定的經(jīng)濟(jì)效益，但是這也在一定程度上對生態(tài)造成了破壞。而隨著生態(tài)環(huán)境的進(jìn)一步惡化、水土流失和土地荒漠化的問題更加突出。因此，應(yīng)該采取一定的措施進(jìn)行營林護(hù)林工程的建設(shè)。在十八大的會議上，我國提出了“五位一體”建設(shè)規(guī)劃，其中比較重要的內(nèi)容是綠色發(fā)展的理念，這個理念的提出充分體現(xiàn)了我國進(jìn)行生態(tài)文明建設(shè)的決心和改善生態(tài)環(huán)境建設(shè)的目標(biāo)。對林地進(jìn)行管理的強(qiáng)化不僅能夠提升林場的經(jīng)濟(jì)效益，同時還能在一定程度上實(shí)現(xiàn)林業(yè)規(guī)模的擴(kuò)大，為實(shí)現(xiàn)生態(tài)文明和經(jīng)濟(jì)建設(shè)提供堅實(shí)的基礎(chǔ)。

實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法[16]。實(shí)時熒光PCR有效解決了常規(guī)PCR只能終點(diǎn)監(jiān)測的問題，使PCR技術(shù)得到進(jìn)一步優(yōu)化[17]。

曾少靈[18]等，依據(jù)ASFV的VP73基因保守序列，設(shè)計了一對特異性引物建立了ASFV實(shí)時熒光PCR檢測方法。與OIE推薦用于檢測ASFV的實(shí)時熒光PCR和普通PCR方法進(jìn)行比對，靈敏度與OIE熒光PCR方法相當(dāng)，但比普通PCR方法高出至少10倍,最低檢測限可達(dá)10拷貝/uL。通過對大量樣品的檢測得到此方法對ASF的各基因型具有普遍適用性。臨床試驗(yàn)結(jié)果與OIE結(jié)果一致。

多重?zé)晒舛縋CR，是在PCR反應(yīng)體系中加入2對或2對以上引物，達(dá)到同時擴(kuò)增出多個DNA片段的目的，反應(yīng)原理，反應(yīng)試劑和操作過程與PCR大致相同[19]。多重?zé)晒舛縋CR為臨床樣品中多重病毒基因的同時檢測提供了一種快速、敏感和特異的技術(shù)手段。多種病原體在同一反應(yīng)管內(nèi)同時檢出，既節(jié)約了時間又避免了大量試劑的浪費(fèi)[20]。

Felicity J Haines等[21]，建立了一種單步、多重、實(shí)時的多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法，用于同時鑒別診斷豬瘟病毒(CSFV)和非洲豬瘟病毒(ASFV)以及外源性內(nèi)控RNA(IC-RNA)。結(jié)合單一提取方法引物和探針組合檢測三種靶核酸CSFV、ASFV和IC-RNA。實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后檢測限為5個豬瘟病毒基因組拷貝數(shù)和22個單鏈抗體基因組拷貝數(shù)。這種檢測方法針對目前所描述的24種ASFV基因型中的8種進(jìn)行檢測，有良好的特異性與敏感性。

直擴(kuò)熒光定量PCR即一種無需提取DNA，直接從樣品中擴(kuò)增ASFV靶基因的一種熒光定量PCR方法。直擴(kuò)熒光定量PCR采用了高耐受性的DNA聚合酶，不容易受樣品中抑制因子的影響，無需提取核酸，因此從一定程度上降低了交叉污染的可能性，增強(qiáng)了該技術(shù)的檢測實(shí)用性能。

張彩虹等[22]，根據(jù)ASFV的VP72基因序列，設(shè)計了一對特異性引物和探針，建立了免提取DNA直接檢測樣品中ASFV的熒光定量PCR方法。結(jié)果顯示，對ASFV檢測敏感性可達(dá) 1×10-6，與OIE推薦的熒光PCR的檢測敏感相似。特異性實(shí)驗(yàn)與6種其他病毒未出現(xiàn)交叉反應(yīng)。分別用建立的直擴(kuò)熒光定量PCR方法和OIE推薦的傳統(tǒng)的熒光定量PCR方法對240 份豬全血臨床樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，240份臨床樣品均未檢出ASFV，該結(jié)果與OIE推薦的傳統(tǒng)的熒光PCR的檢測結(jié)果一致。由于未對24種基因型進(jìn)行覆蓋率檢測，此種方法仍有待進(jìn)一步研究。

2.1.3 微滴式數(shù)字PCR

微滴式數(shù)字PCR是在PCR擴(kuò)增前對樣品進(jìn)行微滴化處理，每個微滴經(jīng)PCR擴(kuò)增后，對每個微滴逐個進(jìn)行檢測，根據(jù)陽性微滴的個數(shù)與比例和泊松分布原理即可得出靶分子的起始拷貝數(shù)[23]。新型的微滴數(shù)字PCR完全可以應(yīng)用于ASFV的檢測并且具有更高的靈敏度，并且不依賴內(nèi)參基因與Ct值即可確定靶分子的數(shù)目。

原霖等[24]根據(jù)ASFV的P72基因序列，設(shè)計了一對特異性引物和探針，建立了微滴數(shù)字PCR技術(shù)，并與OIE提供的PCR技術(shù)進(jìn)行對比。結(jié)果顯示，該方法的最低檢測限可達(dá)0.8拷貝·μL-1，敏感性高于PCR，特異性實(shí)驗(yàn)顯示不與豬常見的6種病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，而且重復(fù)性較好。用微滴數(shù)字PCR與qPCR技術(shù)分別對78份臨床病料進(jìn)行ASFV的檢測，兩種檢測方法得到的結(jié)果相同，此方法同樣未對24種基因型進(jìn)行覆蓋率檢測，所以仍有待進(jìn)一步研究。

2.1.4 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法(LAMP)

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法是一種新型的恒溫核酸擴(kuò)增方法，是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件下(63 ℃左右)保溫30～60分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增[25]。LAMP與PCR相比，LAMP不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)等過程，是一種全新的核酸擴(kuò)增方法，具有簡單、快速、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)?？刹灰蕾嚾魏螌ｉT的儀器設(shè)備而實(shí)現(xiàn)快速檢測，檢測成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR。

WANG Deguo，YU Jianghan等[26]，通過設(shè)計了以ASFV 的P10基因?yàn)榘悬c(diǎn)的引物，優(yōu)化反應(yīng)體系，建立了ASFV的LAMP技術(shù)。結(jié)果表明，LAMP技術(shù)能夠準(zhǔn)確、特異地檢測出ASFV，檢出限為6拷貝·μL-1。此技術(shù)可對ASFV的一部分基因Ⅱ型與一些未在基因庫中查到的基因型有特異性。采集了240份烹調(diào)豬肉樣品。其中，我們研制的ASFV核酸實(shí)時燈檢測法和目測燈法均未檢測出陽性，與OIE推薦的傳統(tǒng)的熒光PCR的檢測結(jié)果一致。

2.1.5 重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)與重組酶介導(dǎo)核酸擴(kuò)增(RAA)

重組酶聚合酶擴(kuò)增，重組酶與引物結(jié)合形成的蛋白-DNA復(fù)合物。當(dāng)引物定位了同源序列，就會發(fā)生鏈交換反應(yīng)形成并啟動DNA合成，對模板上的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增。整個過程進(jìn)行得非常快，一般可在十分鐘之內(nèi)獲得可檢出水平的擴(kuò)增產(chǎn)物[27]。

重組酶介導(dǎo)核酸擴(kuò)增技術(shù)，是一種利用重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和DNA聚合酶在等溫條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增的技術(shù)，5-20分鐘就可實(shí)現(xiàn)儀器擴(kuò)增。與RPA不同的是，RAA擴(kuò)增法使用的是從細(xì)菌或真菌中獲得的重組酶[28]。

FAN Xiaoxu, LI Lin等[29]，以ASFV的 B646L基因p72為靶點(diǎn)分別設(shè)計了一對特異性引物，對兩種基于重組酶的等溫擴(kuò)增法RPA法和RAA法進(jìn)行了評價。結(jié)果表明，RPA和RAA的分析靈敏度分別為每次反應(yīng)93.4和53.6拷貝，且不與其他非ASFV有交叉反應(yīng)。它們對所有24種ASFV基因型都具有普遍的特異性。收集了152份ASFV樣本。比較了實(shí)時RPA/RAA檢測與實(shí)時PCR檢測的性能。實(shí)時RPA/RAA與實(shí)時PCR檢測結(jié)果的一致。但相較于PCR，RAA與RPA仍存在假陽性的結(jié)果并且靈敏度較低。

2.2 免疫學(xué)檢測

ELISA法即酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)，利用抗原抗體之間專一的共價結(jié)合的特性，對檢體進(jìn)行檢測[30]。此方法適合于大量動物群體樣本檢測的需要,是當(dāng)前在動物疫病的檢疫和監(jiān)測中應(yīng)用最為廣泛的免疫學(xué)檢測技術(shù)[31]。

膠體金試紙條技術(shù)是采用膠體金免疫層析技術(shù)研制而成，該技術(shù)是在免疫滲透技術(shù)的基礎(chǔ)上建立的一種簡易快速的免疫學(xué)檢測技術(shù)[32]。通過抗原抗體結(jié)合，并利用膠體金呈現(xiàn)顏色反應(yīng)，檢測抗原抗體。但是，目前為止，未見采用免疫學(xué)方法檢測非洲豬瘟病毒的研究報道。

3 結(jié) 語

ASF是一種急性、熱性的傳染病，在豬群中可大范圍傳染，為防止此疫病在中國進(jìn)一步流行，加強(qiáng)對此病毒檢測調(diào)查和主動監(jiān)測排查工作刻不容緩。OIE推薦的檢測方法包括病毒分離、熒光抗體檢測以及常規(guī)和實(shí)時PCR檢測[33]。由于病毒分離過程復(fù)雜、耗時長，通常用于確證診斷和分子研究。中國流行的ASFV屬于強(qiáng)毒株，感染豬一般在未產(chǎn)生抗體或少量抗體時已經(jīng)死亡，并且在臨床癥狀出現(xiàn)的兩天前，受ASF感染的豬大量散播病毒[34]，所以當(dāng)前檢測主要針對抗原進(jìn)行。在病原學(xué)檢測技術(shù)中，LAMP需要四個甚至更多的引物，引物設(shè)計通常十分復(fù)雜。PCR技術(shù)具有高靈敏度，特異性，快速的優(yōu)點(diǎn)，可以在癥狀出現(xiàn)前完成檢測，是目前實(shí)驗(yàn)室常用的檢測方法[35]。

隨著國家的嚴(yán)格管控與人民安全意識的提高，大量養(yǎng)殖企業(yè)對ASF疫情進(jìn)行實(shí)時監(jiān)控[36]，這將使ASF在中國傳播速度逐漸放緩。