林蛙油摻假分子生物學(xué)檢測(cè)方法研究進(jìn)展

陳宇飛，楊 柳

（吉林工商學(xué)院糧食學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130507）

林蛙又稱雪蛤，屬于兩棲綱無(wú)尾目蛙科[1]。林蛙油也稱蛤蟆油、蛤士蟆油，為林蛙雌蛙輸卵管，其主要成分是蛋白質(zhì)，富含18種氨基酸[2]。林蛙油具有補(bǔ)腎益精、養(yǎng)陰潤(rùn)肺、健腦益智和平肝養(yǎng)胃功效用于調(diào)節(jié)陰虛體弱、神疲乏力、心悸失眠、盜汗不止和癆嗽咳血等癥狀[3]。

哈爾濱師范大學(xué)生命學(xué)院趙文閣教授協(xié)同東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物學(xué)院多名教授科學(xué)命名，把原來(lái)稱做中國(guó)林蛙、中國(guó)林蛙長(zhǎng)白山亞種的林蛙，統(tǒng)一命名為東北林蛙。并明確東北林蛙所產(chǎn)的油為“大油”，黑龍江林蛙所產(chǎn)的油為“小油”，其他蛙油均為“偽油”或“假油”[4]。近年來(lái)捕捉野生林蛙的人越來(lái)越多，人為的濫捕亂殺，使野生的林蛙和林蛙油越來(lái)越缺乏，導(dǎo)致林蛙油價(jià)格非常昂貴。一些不法商家以青蛙油、中華大蟾蜍油、牛蛙油和明太魚精巢等冒充林蛙油，牟取暴利。常用于林蛙油摻假檢測(cè)的方法有傳統(tǒng)方法和儀器檢測(cè)方法。傳統(tǒng)檢測(cè)方法有基源鑒別、性狀鑒別、組織學(xué)鑒別和顯微鑒別等[5]。儀器檢測(cè)方法有凝膠電泳法、紅外光譜法、原子吸收光譜法等[6]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR、LAMP等技術(shù)的應(yīng)用，使得林蛙油摻假檢測(cè)能夠更加快速、準(zhǔn)確。本文對(duì)東北林蛙油摻假檢測(cè)的分子生物學(xué)方法進(jìn)行概括，以期為快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行東北林蛙油摻假檢測(cè)提供參考。

1 指紋圖譜法

指紋圖譜是基于食品的固有品質(zhì)特性，運(yùn)用光譜、色譜等現(xiàn)代儀器檢測(cè)得到的能反映該食品內(nèi)部特征的圖譜，具有整體性、系統(tǒng)性、特征性和穩(wěn)定性的特點(diǎn)[7]。李津明等[8]利用高效液相色譜法，測(cè)定10批林蛙油產(chǎn)品，建立指紋圖譜。色譜條件為Dimonsil C18分析柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），柱溫：25 ；流動(dòng)相：乙腈-水（50∶50），分析時(shí)間60 min。在該色譜條件下，可以檢出17個(gè)相應(yīng)位置穩(wěn)定的共有峰，可作為確定林蛙油的指標(biāo)峰。白雪媛[9]通過(guò)高效液相色譜法對(duì)林蛙油樣品進(jìn)行研究，建立了林蛙油指紋圖譜的共有模式，最后確定林蛙油指紋圖譜的色譜條件為：Dimonsil C18（5μ 100A TiANHE?TH 1025 250 mm ×4.6 mm，S/N:06L25514）；流動(dòng)相：乙腈-0.5%磷酸水溶液；柱溫：室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)：209 nm；進(jìn)樣量為15 μL。在己篩選的色譜條件下，35 min內(nèi)可完成林蛙油指紋圖譜的檢測(cè)，該方法具有良好的專屬性、準(zhǔn)確度、精密度、重復(fù)性和穩(wěn)健性，測(cè)定范圍在25～100 μg/mL。姜玢[10]以正二十四烷峰為參照物峰，確定20個(gè)共有峰，建立了中國(guó)林蛙卵油GC數(shù)字化指紋圖譜。獲得了以色譜指紋圖譜指數(shù)F等42參數(shù)對(duì)中國(guó)林蛙卵油GC指紋圖譜的超信息特征數(shù)字化評(píng)價(jià)結(jié)果和系統(tǒng)指紋定量法定量鑒別結(jié)果。姜玢等[11]建立了中國(guó)林蛙卵油高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）數(shù)字化指紋圖譜，以亞油酸為參照物峰，確定21個(gè)指紋峰，獲得了可以判別其質(zhì)量的重要數(shù)字化信息，所建立的中國(guó)林蛙卵油HPLC數(shù)字化指紋圖譜方法穩(wěn)定、可靠，可用于中國(guó)林蛙卵油的質(zhì)量控制。

2 PCR法

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一種將待檢驗(yàn)的DNA序列于生物體細(xì)胞外在酶促作用下進(jìn)行擴(kuò)增，設(shè)計(jì)不同物種特定基因片段的引物大量體外擴(kuò)增DNA，通過(guò)得到的PCR產(chǎn)物而鑒別物種的技術(shù)[12-13]。李小清[14]將長(zhǎng)白山地區(qū)的19個(gè)蛤蟆油樣品進(jìn)行了基源分析，研究了基于蛤蟆油近源物種的線粒體全基因序列中線粒體呼吸鏈特異性基因隔序建立蛤蟆油的特異性PCR鑒定方法，該方法首次建立基于線粒體基因間隔序列特異性PCR技術(shù)的蛤蟆油鑒別方法，可進(jìn)行定量分析，無(wú)需通過(guò)基因測(cè)序，降低了檢測(cè)成本。聶丹丹等[15]對(duì)已報(bào)道的東北林蛙、黑龍江林蛙、黑斑側(cè)褶蛙、牛蛙和中華蟾蜍的COI及cytB基因?yàn)槟０暹M(jìn)行了研究，應(yīng)用PCR擴(kuò)增東北林蛙COI基因，通過(guò)測(cè)序確定東北林蛙亞種，建立了東北林蛙及其產(chǎn)品的鑒別方法。董瑤等[16]以林蛙和林蛙油為原料，以線粒體DNA上cytB為研究對(duì)象，應(yīng)用PCR擴(kuò)增cytB，并測(cè)序確定了林蛙品種，建立了林蛙種屬及林蛙油基源鑒定方法。

3 “LAMP+微流控”法

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop- mediated Isothermal Amplification，LMAP）是Notomi等人在2000年建立的一種新的體外擴(kuò)增特異DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，是在65 恒溫條件下進(jìn)行核酸快速擴(kuò)增，利用2條特異性內(nèi)引物和2條特異性外引物識(shí)別靶基因上的6個(gè)區(qū)域，其DNA聚合酶具有鏈置換活性，數(shù)十分鐘即可完成核酸擴(kuò)增[17]。

LMAP技術(shù)是一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速簡(jiǎn)便的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，近年來(lái)在核酸檢測(cè)領(lǐng)域有著廣泛的研究和應(yīng)用[18]。郭建平等[19]利用LAMP技術(shù)建立了基于顏色判定的快速、靈敏的金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法，將反應(yīng)時(shí)間縮短至60 min。張萌等[20]以棗轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal Transcribed Spacer，ITS）為靶序列，建立了real-time環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)棗花蜜源成分的方法，最低檢測(cè)限為≥1 pg/μL。肖劍等[21]基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)建立了快速檢測(cè)植物蛋白飲料中大豆成分的方法，并以PCR方法為參比方法，對(duì)32種植物蛋白飲料進(jìn)行檢測(cè)應(yīng)用驗(yàn)證，結(jié)果表明，該方法特異性強(qiáng)，32種植物除大豆外，其他均未發(fā)生擴(kuò)增，穩(wěn)定性好，最低檢出限為0.1%（以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)），可以為植物蛋白飲料大豆成分摻雜摻假提供參考。

微流控芯片又稱芯片實(shí)驗(yàn)室，是微型全分析系統(tǒng)的核心，它是把化學(xué)和生物等領(lǐng)域中所涉及的樣品制備、反應(yīng)、分離和檢測(cè)等基本操作單元集成或基本集成到一塊很小的芯片（幾平方厘米）上，由微通道形成網(wǎng)絡(luò)，可以控制流體貫穿整個(gè)系統(tǒng)，用以取代常規(guī)化學(xué)或生物實(shí)驗(yàn)室的各種功能的一種技術(shù)平臺(tái)[22]。

微流控芯片在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。苑寶龍等[23]設(shè)計(jì)制作了一種可以用于農(nóng)藥殘留現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的微流控芯片，7 min內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)對(duì)克百威和樂(lè)果的快速檢測(cè)，最低檢出限分別為0.02 mg/L、0.06 mg/L，對(duì)克百威加標(biāo)回收率為95.0%～103.3%，制作的芯片在1個(gè)月內(nèi)的穩(wěn)定性較好。鞠鶴鵬等[24]建立了一種結(jié)合LAMP和微流控技術(shù)檢測(cè)沙門氏菌、大腸桿菌O157、金黃色葡萄球菌3種食源性致病菌的方法，制成的微流控芯片具有較好的特異性，3種致病菌的檢測(cè)敏感性均可達(dá)到100 cuf/mL，實(shí)現(xiàn)了對(duì)3種致病菌的快速檢測(cè)。周新麗等[25]研制了一套用于牛、羊、豬、鴨和雞源性成分快速檢測(cè)的離心式微流控芯片系統(tǒng)，每次可同時(shí)檢測(cè)5個(gè)樣本，每個(gè)樣本可同時(shí)檢測(cè)5種指標(biāo)，能夠在30 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)半定量檢測(cè)，具有快速、自動(dòng)、高通量的特點(diǎn)。王衛(wèi)芳等[26]研究了林蛙油摻假LAMP檢測(cè)方法、試劑盒以及微流控基因芯片的制備，通過(guò)對(duì)比林蛙油的多種檢測(cè)方法，得出以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的LAMP檢測(cè)方法具有較高的先進(jìn)性和簡(jiǎn)便性，微流控芯片多重檢測(cè)具有低成本、高通量的優(yōu)越性，為林蛙油分子生物學(xué)檢測(cè)提供了新的檢測(cè)手段。

4 結(jié)語(yǔ)

隨著越來(lái)越多的分子生物學(xué)技術(shù)在東北林蛙摻假檢測(cè)中進(jìn)行應(yīng)用，定能克服傳統(tǒng)檢測(cè)方法檢測(cè)靈敏度低、檢測(cè)周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)。東北林蛙油摻假LAMP檢測(cè)試劑盒和微流控芯片等產(chǎn)品的研發(fā)，也將為食品檢驗(yàn)檢疫、海關(guān)出入境等部門進(jìn)行東北林蛙油摻假檢測(cè)提供幫助。