中國紅豆杉羥化酶基因TcCYP725A22的亞細(xì)胞定位及過表達作用分析

廖衛(wèi)芳，付春華，劉志國，繆禮鴻，余龍江

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中國紅豆杉羥化酶基因的亞細(xì)胞定位及過表達作用分析

廖衛(wèi)芳1，付春華2，劉志國1，繆禮鴻1，余龍江2

1 武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023 2 華中科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430074

抗癌藥物紫杉醇生物合成途徑中羥化酶的發(fā)現(xiàn)是當(dāng)今研究的熱點和難點。文中利用前期分析得到的1個新的中國紅豆杉羥化酶基因(GenBank登錄號：MF448646.1)，構(gòu)建了亞細(xì)胞定位載體pCAMIBA1303-EGFP，瞬時侵染洋蔥表皮細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因編碼蛋白定位在細(xì)胞膜。進一步構(gòu)建了植物表達載體pBI121-，經(jīng)根癌農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)轉(zhuǎn)化到中國紅豆杉細(xì)胞中過表達后，利用熒光定量PCR (qRT-PCR) 和液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS) 分析過表達對紫杉醇生物合成的影響。結(jié)果顯示，瞬時轉(zhuǎn)化pBI121-的紅豆杉細(xì)胞中基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于pBI121空載體對照組。隨著基因過表達，幾個已知的紫杉醇合成關(guān)鍵酶基因的表達量也都有不同程度的上調(diào)，且細(xì)胞中各紫杉烷的含量普遍提高。這些結(jié)果說明羥化酶基因極有可能參與紫杉醇的生物合成路徑。

紫杉醇，生物合成途徑，中國紅豆杉，羥化酶，亞細(xì)胞定位，過表達

紫杉醇 (Taxol) 是一種具有顯著抗癌活性的二萜類化合物。但其在紅豆杉屬 () 植物中的含量極低，天然來源的紫杉醇難以滿足臨床藥用需求[1-3]。利用合成生物學(xué)技術(shù)，通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇是解決其供需矛盾的重要手段[4-6]。目前，紫杉醇生物合成路徑中的大部分相關(guān)酶基因已被鑒定出，但其母核有效羥基化途徑的分子機制解析仍是當(dāng)今的研究熱點與難點[7]。

Eisenreich等[8]證實紫杉醇母核上所有羥化修飾均由CYP450 單加氧酶催化完成。在植物中，CYP450普遍為膜結(jié)合蛋白，廣泛參與萜類、黃酮類、植物激素、生物堿類、甾醇類等的合成與代謝途徑[9-11]。CYP450是一個龐大的超基因家族，在CYP450的分類中，為了和其他物種區(qū)分開，植物CYP450被歸為CYP71–CYP99和CYP701–CYP999家族[12]。

紫杉醇母核 (紫杉二烯) 到最終形成紫杉醇需要經(jīng)過C1、C2、C4、C5、C7、C9、C10、C13八個位點的有效羥化[13]。目前已有C2、C5、C7、C10和C13位對應(yīng)的羥化酶基因被解析[14-19]，但母核上尚有較多CYP450羥化酶基因及其功能未被確認(rèn)，尤其是母核上C1、C4和C9位對應(yīng)的CYP450羥化酶基因尚未發(fā)現(xiàn)，是徹底解析紫杉醇生物合成路徑的主要瓶頸[7]。系統(tǒng)分析已從紅豆杉屬植物中鑒定出紫杉醇生物合成羥化酶的基因，可以發(fā)現(xiàn)它們均隸屬于CYP725家族。

本研究基于前期從中國紅豆杉轉(zhuǎn)錄組中分析獲得的1個新的羥化酶基因[20]，擬對其進行克隆及亞細(xì)胞定位分析，并進一步將其在中國紅豆杉細(xì)胞中過表達，探究該基因與紫杉醇生物合成的關(guān)系，為進一步徹底解析紫杉醇生物合成路徑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

中國紅豆杉細(xì)胞系由中國紅豆杉嫩莖誘導(dǎo)的愈傷組織建立，由本實驗室保存。于62#培養(yǎng)基中[21]，25 ℃、黑暗培養(yǎng)。

1.1.2 菌種與質(zhì)粒

農(nóng)桿菌LBA4404、大腸桿菌DH5α由本實驗室保存；農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)購于TaKaRa公司；植物表達載體pCAMBIA1303、pBI121、質(zhì)粒pm-ck CD3-1001均由本實驗室保存；pMD18-T克隆載體購于TaKaRa公司。

1.1.3 試劑

質(zhì)粒小提、瓊脂糖凝膠DNA回收等試劑盒均購自天根生化科技有限公司；限制性內(nèi)切酶均購自Fermentas公司；KOD-Plus-Neo購自TOYOBO公司；In-fusion試劑盒購自Clontech公司；T4 DNA ligase購自Thermo公司；乙酰丁香酮 (AS)、頭孢菌素 (Cef)、卡那霉素 (Kan) 均購自Biosharp公司；引物由奧科鼎盛生物科技有限公司合成；其他試劑購于國藥集團。

1.2 方法

1.2.1基因的克隆

根據(jù)中國紅豆杉基因序列 (GenBank登錄號：MF448646.1)，采用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計特異性引物 (表1)，以cDNA為模板，使用KOD-Plus-Neo進行PCR擴增。

PCR擴增反應(yīng)體系 (20 μL) 為：KOD-Plus-Neo 0.5 μL、10×KOD緩沖液2 μL、dNTP混合物2 μL (2.5 mmol/L)、上下游引物各0.8 μL (10 μmol/L)、Mg2+緩沖液2 μL、模板適量，用ddH2O補至20 μL。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性30 s， 55 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，34個循環(huán)；最后68 ℃延伸10 min。膠回收純化目的基因，末端加A后連接至pMD18-T載體中并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR鑒定陽性克隆，并進行測序驗證。

表1 實驗所用引物

1.2.2亞細(xì)胞定位載體的構(gòu)建及洋蔥表皮瞬時表達

以構(gòu)建好的質(zhì)粒pMD18-T-為模板，設(shè)計引入酶切位點Ⅰ的引物 (表1)，使用KOD-Plus-Neo進行擴增。PCR產(chǎn)物通過凝膠電泳檢測后回收，回收產(chǎn)物用Ⅰ進行酶切，同時用Ⅰ對亞細(xì)胞定位載體pCAMIBA1303進行酶切，于37 ℃反應(yīng)10 min。分別回收酶切產(chǎn)物，用In-fusion法將基因連接到pCAMIBA 1303載體上，得到pCAMIBA1303-EGFP融合表達載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α。菌落PCR鑒定陽性克隆，并提取陽性克隆單菌落質(zhì)粒，酶切驗證后測序。將測序結(jié)果正確的質(zhì)粒，及陽性對照植物細(xì)胞質(zhì)膜的marker 質(zhì)粒pm-ck CD3-1001和陰性對照pCAMIBA-1303空載體，分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101。

將含有目標(biāo)基因質(zhì)粒 (pCAMIBA1303-EGFP)、陽性對照質(zhì)粒 (pm-ck CD3-1001)、陰性對照質(zhì)粒 (pCAMIBA-1303) 的農(nóng)桿菌GV3101分別活化，侵染預(yù)處理過的洋蔥表皮，1/2 MS固體平板培養(yǎng)基上，25 ℃、光周期16 h/8 h培養(yǎng)2 d。用無菌水洗滌附著的農(nóng)桿菌，壓片法制片，于共聚焦顯微鏡下觀察，激發(fā)光為488 nm。

1.2.3在中國紅豆杉細(xì)胞中的過表達

以構(gòu)建好的質(zhì)粒pMD18-T-為模板，設(shè)計引入酶切位點HⅠ和Ⅰ酶切位點的引物 (表1)，使用KOD-Plus-Neo進行PCR擴增。膠回收純化目的基因，然后利用HⅠ和Ⅰ進行雙酶切，將所得酶切目的基因片段與同樣經(jīng)HⅠ和Ⅰ雙酶切的載體pBI121使用T4DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，獲得表達重組質(zhì)粒pBI121-。陽性克隆經(jīng)菌落PCR、酶切鑒定后測序。將測序結(jié)果正確的質(zhì)粒及陰性對照pBI121空載體，分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA 4404。

將LBA 4404陽性克隆接種到10 mL含有 Kan抗性的LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min恒溫培養(yǎng)1–2 d；再取500 μL菌液至50 mL含有 Kan抗性的LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min恒溫培養(yǎng)5–8 h，至菌液600達到0.8–1.0；4 ℃、6 000 r/min離心收集菌體。用0.5 mL 62#培養(yǎng)基將菌體重懸，將懸浮的農(nóng)桿菌接到50 mL 1/6 62#培養(yǎng)基中 (蔗糖濃度改為5 g/L)，再加入20 μL 1 mol/L 的乙酰丁香酮 (AS)，混勻后加入約5 g紅豆杉細(xì)胞，25 ℃、125 r/min黑暗條件下共培養(yǎng)2 d。用真空泵將共培養(yǎng)的紅豆杉細(xì)胞和農(nóng)桿菌通過砂芯漏斗分離，用無菌水洗3次，洗掉紅豆杉細(xì)胞中殘留的農(nóng)桿菌。挑取0.3 g紅豆杉細(xì)胞快速凍存，放于?80 ℃冰箱，用于超表達后基因表達量分析。將剩余的紅豆杉細(xì)胞接種至新的50 mL 62#液體培養(yǎng)基中 (含有300 μg/mL Cef，100 μg/mL Kan)；25 ℃、125 r/min黑暗條件下培養(yǎng)10 d后，用砂芯漏斗抽濾，收集細(xì)胞，?80 ℃保存，用于紫杉烷含量的測定。以轉(zhuǎn)入pBI121空載體的LBA4404菌株介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化作為對照。

1.2.4過表達鑒定及紫杉醇合成關(guān)鍵酶基因的qRT-PCR分析

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化培養(yǎng)2 d后的紅豆杉細(xì)胞用來提取總RNA，并檢測關(guān)鍵酶基因的表達水平。利用特定引物對以及紫杉醇生物合成途徑的關(guān)鍵酶基因紫杉二烯合酶基因()、紫杉烷2α-羥化酶基因()、紫杉烷5α-羥化酶基因()、紫杉烷7β-羥化酶基因()、紫杉烷10β-羥化酶基因()和紫杉烷13α-羥化酶基因()進行qRT-PCR分析，以actin作為內(nèi)參，使用引物如表1所示。

1.2.5過表達紅豆杉細(xì)胞中紫杉烷含量的檢測

將培養(yǎng)10 d后的紅豆杉細(xì)胞取出，50 ℃烘干，充分研磨，均稱取0.15 g粉末于潔凈的10 mL錐形瓶中，加入冰冷的10 mL/g二氯甲烷和10 mL/g甲醇，冰水中超聲助溶30 min，4 ℃提取過夜后，9 000 r/min離心10 min，取上清，用氮吹儀吹干，再加入預(yù)冷的5 mL/g超純水和5 mL/g二氯甲烷，充分振蕩混勻。4 ℃、6 000 r/min離心15 min，吸取下層二氯甲烷相，氮吹儀吹干，最后用500 μL色譜純乙腈溶解，過0.22 μm濾膜，使用安捷倫液質(zhì)聯(lián)用儀1100 LC/MSD XCD Trap檢測紫杉醇、巴卡亭III、10-去乙?；?巴卡亭III、10-去乙酰-紫杉醇、7-表-10-去乙酰紫杉醇、三尖杉寧堿和7-表-紫杉醇7種紫杉烷物質(zhì)的含量。

色譜條件：色譜柱為Agilent Zorbax SB-Phenyl (4.6 mm×250 mm×5 μm)，柱溫為30 ℃；流動相為乙腈和水，時間與梯度 (乙腈含量) 變化具體為T (min)/%B：0/5，10/10，11/50，20/60，30/70，40/90，45/100。流速為1 mL/min；進樣量為20 μL；紫外檢測波長為227 nm。

質(zhì)譜條件：ESI正離子源，電壓為3.5 kV，氮氣40 psi，輔助氣流10 L/min，毛細(xì)管電流 10 nA，毛細(xì)管溫度325 ℃，離子碎片分析范圍為100–1 000/。

2 結(jié)果與分析

2.1 TcCYP725A22基因的克隆

以中國紅豆杉細(xì)胞cDNA為模板，以特異性引物擴增基因全長，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，在1 500 bp左右處出現(xiàn)單一條帶，與目的基因大小一致。片段連接載體pMD18-T測序后，經(jīng)Clustal軟件分析與NCBI中的序列一致。

2.2 TcCYP725A22蛋白的亞細(xì)胞定位

將測序成功的pCAMIBA1303-EGFP重組載體轉(zhuǎn)入GV3101感受態(tài)中，菌落PCR進行陽性克隆鑒定，電泳檢測在1 500 bp左右處出現(xiàn)單一條帶，符合目的基因大小，證明載體構(gòu)建成功。并成功將pm-ck CD3-1001及pCAMIBA1303空載體轉(zhuǎn)入GV3101中，菌落PCR結(jié)果為陽性。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的洋蔥表皮細(xì)胞瞬時表達結(jié)果表明，pCAMIBA1303空載體對照組細(xì)胞內(nèi)各部分均可見綠色熒光 (圖1)。融合表達蛋白TcCY P725A22-EGFP在質(zhì)膜上有熒光信號，其他部位幾乎沒有熒光，在EGFP-pm-ck-Overlay組圖中，可看到綠色熒光與藍色熒光位置重合，即目的基因蛋白的表達位置與細(xì)胞膜的位置重合 (圖2)，可確定TcCYP725A22定位于細(xì)胞膜。

2.3 過表達載體pBI121-TcCYP725A22的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

分別對pMD18T-和植物表達載體pBI121用HⅠ和Ⅰ進行雙酶切，分別回收酶切產(chǎn)物，用T4 DNA連接酶進行連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。提取陽性克隆質(zhì)粒，雙酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示在1 500 bp和13 000 bp左右處出現(xiàn)了兩條特異性條帶，分別與目的基因及pBI121載體大小一致，表明基因已被成功克隆到pBI121質(zhì)粒中 (圖2)。

圖1 TcCYP725A22蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞的定位

圖2 重組載體pBI121-TcCYP725A22的酶切驗證

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pBI121-轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404中，利用菌落PCR鑒定陽性克隆子。使用特異性引物擴增，在1 500 bp處產(chǎn)生特異條帶，與基因大小一致，說明重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA 4404中。

2.4 TcCYP725A22過表達促進紅豆杉細(xì)胞中紫杉醇合成途徑關(guān)鍵酶基因的表達

將轉(zhuǎn)入pBI121-的農(nóng)桿菌擴大培養(yǎng)后，侵染紅豆杉細(xì)胞2 d后，收集細(xì)胞提取RNA，采用qRT-PCR法檢測了及紫杉醇生物合成相關(guān)關(guān)鍵酶基因和的響應(yīng)情況。以轉(zhuǎn)入pBI121空載體的農(nóng)桿菌侵染為對照組，且每實驗重復(fù)3次。

結(jié)果表明，實驗組中的相對表達量是對照組的30.95倍，說明基因在紅豆杉細(xì)胞中成功過表達。且的過表達誘導(dǎo)了紫杉醇生物合成路徑中相關(guān)酶基因的表達 (圖3)。其中，的表達量略微上調(diào)，為對照組的1.3倍；和上調(diào)了2倍；上調(diào)3.42倍；上調(diào)3.67倍；的響應(yīng)最為顯著，上調(diào)了20倍。

圖3 TcCYP725A22過表達紅豆杉細(xì)胞中基因的qRT-PCR分析

2.5 TcCYP725A22過表達促進紅豆杉細(xì)胞中紫杉烷物質(zhì)的積累

采用LC-MS檢測過表達后，紅豆杉細(xì)胞中10-去乙酰基-巴卡亭III (DAB)、巴卡亭III (B-III)、10-去乙酰-紫杉醇 (DAT)、三尖杉寧堿 (CEP)、7-表-10-去乙酰紫杉醇 (EDT)、紫杉醇 (Taxol) 和7-表-紫杉醇 (ETOL) 7種紫杉烷物質(zhì)的含量變化。對照這7種紫杉烷物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜的出峰時間和質(zhì)譜的分子離子峰可以確定它們的保留時間依次為15.6 min、17.0 min、19.0 min、20.7 min、21.4 min、21.5 min和24.3 min，根據(jù)峰面積計算出過表達紅豆杉細(xì)胞系中這7種紫杉烷的含量分別為5.54、6.57、4.22、15.19、15.13、9.04、5.62 μg/g，均高于對照組 (圖4)，其中DAB的含量增加最為顯著，含量為對照組的1.5倍。說明基因的過表達促進了紫杉醇的合成。

圖4 TcCYP725A22過表達細(xì)胞系的紫杉烷含量分析

3 討論

紫杉醇 (Taxol) 是一種具有顯著抗腫瘤活性的三環(huán)二萜類化合物，結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，其生物合成路徑中母核的羥基化修飾過程至今尚未完全解析。本研究對新羥化酶基進行了亞細(xì)胞定位和過表達功能分析，發(fā)現(xiàn)該基因極可能與紫杉醇生物合成相關(guān)

隨著功能基因組學(xué)的研究，蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用以及蛋白質(zhì)的動態(tài)變化等成為生物學(xué)家們關(guān)注的熱點。其中，蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位研究對于系統(tǒng)地理解蛋白的動態(tài)變化、蛋白行使功能的原理及蛋白與蛋白間的相互作用是不可或缺的環(huán)節(jié)，也是功能基因組學(xué)的重要內(nèi)容。植物基因的編碼蛋白是由其自身的序列所含有的定位信息制導(dǎo)定位到細(xì)胞的特定部位。本研究中基因編碼蛋白定位在細(xì)胞膜，這與先前報道的植物CYP450普遍為膜結(jié)合蛋白一致[10]。

目前，研究植物CYP450酶基因功能的主要方法之一是通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將目的基因進行本體或異源過表達后，分析性狀或化學(xué)成分的差異來探究其生物學(xué)功能[22-23]。Zheng等[24]在擬南芥中過表達大豆GmCYP707A1可降低對ABA的敏感性，起到ABA 8′-羥化酶的功能。Han等[25]將蘋果類黃酮3′-羥化酶基因 (F3′H) 在煙草中過表達，轉(zhuǎn)基因煙草的花紅色加深。在青蒿中，過量表達黃烷酮3-羥化酶基因(AaF3H)，青蒿素合成相關(guān)紫穗槐-4,11-二烯氧化酶基因()、紫穗槐-4,11-二烯合成酶基因() 等表達量顯著提高，且提高了青蒿素的含量[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，將在中國紅豆杉細(xì)胞中過表達后，紫杉醇合成途徑中的關(guān)鍵酶基因和的表達量在轉(zhuǎn)基因紅豆杉細(xì)胞中均有所提高。此外，在過表達細(xì)胞系中，多種紫杉烷物質(zhì)的含量均增加，可以推測羥化酶基因在紫杉醇的合成中有重要作用。這些結(jié)果為徹底解析紫杉醇生物合成路徑奠定了基礎(chǔ)。

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Sub-cellular localization and overexpressing analysis of hydroxylase geneof

Weifang Liao1, Chunhua Fu2, Zhiguo Liu1, Lihong Miao1, and Longjiang Yu2

1 School of Biology and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, Hubei, China 2 School of Life Science and Technology, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430074, Hubei, China

The discovery of hydroxylases in the anticancer drug taxol biosynthesis pathway is a hotspot and difficulty in current research. In this study, a new hydroxylase gene(GenBank accession number: MF448646.1) was used to construct a sub-cellular localization vector pCAMIBA1303--EGFP to get the transient expression in onion epidermal cells. Laser confocal microscopy revealed that the protein encoded by this gene was localized in the cell membrane. Furthermore, the recombinant plant expression plasmid pBI121-was constructed. After transient transformation to themediated byLBA4404, qRT-PCR and LC-MS were utilized to analyze the effects ofoverexpression on the synthesis of taxol. The results showed that, in theoverexpressed cell line, expression levels of most defined hydroxylase genes for taxol biosynthesis were increased, and the yield of taxanes were also increased. It was concluded that the hydroxylase geneis likely involved in the biosynthetic pathway of taxol.

taxol, biosynthetic pathway,, hydroxylase, sub-cellular localization, overexpression

January 4, 2019;

April 24, 2019

The Doctoral Program of Higher Education (No. 20120142130009).

Weifang Liao. Tel: +86-27-83956793; E-mail: leesalwf89@126.com

Longjiang Yu. Tel: +86-27-87792264; E-mail: yulongjiang@mail.hust.edu.cn

高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金 (No. 20120142130009) 資助。

2019-06-05

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190604.1520.001.html

10.13345/j.cjb.190008

廖衛(wèi)芳, 付春華, 劉志國, 等. 中國紅豆杉羥化酶基因的亞細(xì)胞定位及過表達作用分析. 生物工程學(xué)報, 2019, 35(6): 1109–1116.

Liao WF, Fu CH, Liu ZG, et al. Sub-cellular localization and overexpressing analysis of hydroxylase geneof. Chin J Biotech, 2019, 35(6): 1109–1116.

(本文責(zé)編 郝麗芳)