腫瘤教育血小板聯(lián)合二代測序技術(shù)在腫瘤診斷中的應用

茍葆城，李 萍，馬 兵

（川北醫(yī)學院 四川 南充 637000）

惡性腫瘤是威脅人類生命重要疾病[1]，實現(xiàn)腫瘤的早期、高準確率、微創(chuàng)診斷非常重要。現(xiàn)階段臨床常用肺癌診斷方法可有螺旋CT、PET-CT、血清腫瘤標記物、病理活檢。其中螺旋CT對早期肺癌診斷的特異性不高，PET-CT對于直徑小于1cm的肺結(jié)節(jié)缺乏診斷價值，有輻射且價格昂貴，血清腫瘤標記物對腫瘤診斷的靈敏度及特異度均不高，有創(chuàng)的病理活檢風險高，且難以重復取檢，在精準醫(yī)療趨勢下的今天已經(jīng)難以滿足更高的診斷需求。在二代測序技術(shù)支持下的腫瘤教育血小板（tumor educated platelets, TEPs），被認為是一種有前景的新型液體活檢材料，其已經(jīng)在部分腫瘤的診斷、鑒別診斷甚至早期診斷相關(guān)研究中顯示出了較好的成果，本文就TEPs聯(lián)合二代測序在腫瘤診斷中的研究現(xiàn)狀進行綜述。

1.腫瘤教育血小板與腫瘤

1.1 TEPs的研究背景及來歷

從20世紀開始，人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)腫瘤與血小板之間似乎存在著某種聯(lián)系，如研究者發(fā)現(xiàn)深靜脈血栓形成或肺栓塞與隨后的癌癥發(fā)生率增高有關(guān)[2]，在肺癌、胃癌、食道癌、宮頸癌、大腸中，血小板增多被認為是腫瘤的不良預后因素[3]。動物實驗表明，腫瘤能在體外聚集血小板，并能夠增加動物模型體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移，而通過使用血小板GⅡb/GⅢa復合物抑制劑或者減少血小板數(shù)量能明顯抑制動物模型腫瘤轉(zhuǎn)移[4]，進一步的研究顯示，血小板賦予的腫瘤轉(zhuǎn)移性增強可能與血小板抑制了自然殺傷細胞（NK細胞）活性[5]，刺激腫瘤組織血管生成增加[6]，促進腫瘤的上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化[7]，甚至抑制腫瘤細胞凋亡等有關(guān)[8]。基因組學及蛋白組學的研究顯示，腫瘤患者體內(nèi)的血小板內(nèi)的RNA可能因為腫瘤組織或腫瘤微環(huán)境的改變而發(fā)生了腫瘤相關(guān)性改變。其機制可能包括腫瘤組織刺激了血小板內(nèi)premRNA的特異性剪切[9]，或血小板吞噬了含有腫瘤基因的腫瘤微囊泡[10]。

1.2 腫瘤教育血小板概念的提出及用于腫瘤診斷能力的早期嘗試

進入21世紀后，分子診斷檢查成為一種新的腫瘤診斷方法并逐漸被用于臨床，但依靠病理組織為單一材料來源的分子診斷受到制約，為了克服組織獲取的局限性，人們開始探索基于血液為檢查材料的方法，從而產(chǎn)生了液體活檢技術(shù)[11]。血小板作為人體內(nèi)含量最豐富的無核細胞器，其遺傳物質(zhì)主要為來源于巨核細胞的premRNA，具有數(shù)量大、易獲取、遺傳物質(zhì)相對單一優(yōu)勢。Calverley等[12]人在2010年的研究中運用基因芯片技術(shù)對晚期轉(zhuǎn)移肺癌病人及健康人血小板mRNA進行無陣列分層聚類分析，得出的mRNA表達譜在基因表達水平實現(xiàn)了將轉(zhuǎn)移性肺癌與陰性對照區(qū)分開。2015年，Best等[13]人運用高通量測序?qū)δ[瘤教育血小板mRNA譜的研究實現(xiàn)了區(qū)分癌癥患者與健康人的準確率為96%，對6種腫瘤類型分型，準確率為71%，在此研究中首次將這些受腫瘤或腫瘤微環(huán)境影響而發(fā)生遺傳物質(zhì)腫瘤化改變的血小板稱為“腫瘤教育的血小板”，由此拉開了TEPS對腫瘤診斷研究的熱幕。

2.二代測序技術(shù)與腫瘤診斷的聯(lián)合

二代測序（the next generation sequencing, NGS）又稱大規(guī)模并行測序或高通量測序，其原理是將DNA分子打斷成長約幾十至幾百bp的片段，將這些片段放入帶有熒光標記的反應孔中或固定于芯片上，使用PCR或等溫擴增技術(shù)進行DNA擴增，通過檢測帶有不同熒光標記的核苷酸，并將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘栠M行讀取[14]，相較于既往PCR和基因芯片技術(shù)這種“釣魚式的”單基因模式，二代測序能實現(xiàn)“撒網(wǎng)式的”對某個組織器官的全基因覆蓋，具有高通量、效率高、價格相對低廉優(yōu)點，是繼PCR和基因芯片技術(shù)后的基因測序領(lǐng)域里程碑進步?，F(xiàn)已被廣泛用于實體腫瘤驅(qū)動基因的檢測[15]，其與傳統(tǒng)免疫組織化學檢測、熒光原位雜交、聚合酶鏈反應方法相比，能更高效、快速地檢測出上述方法不能檢測出得少見的突變基因或者發(fā)現(xiàn)新的基因突變，從而指導精準用藥。該技術(shù)應用逐漸成熟，歐盟與美國相繼于2015年和2017年發(fā)行了二代測序技術(shù)應用指南。我國近年來發(fā)表了NGS在精準醫(yī)學、血液腫瘤、肺癌診斷中的專家共識。其他腫瘤如胃腸腫瘤、肝癌、骨瘤等的二代測序?qū)＜夜沧R也在形成中。當然，二代測序也有缺點，如單次測量的讀長較短，引入PCR會在一定程度上增加測序的錯誤率，并具有系統(tǒng)偏向性，這一缺陷未來有望在三代測序中得到彌補，其次，二代測序在技術(shù)操作、數(shù)據(jù)管理以及結(jié)果解釋上有較高的要求，這些都是該技術(shù)能否很好應用的關(guān)鍵[16]。

3.二代測序在腫瘤教育血小板中的應用

RNA-seq也稱為轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，利用高通量測序技術(shù)研究轉(zhuǎn)錄組在全面快速得到基因表達譜變化的同時，還可以通過測定的序列信息精確地分析轉(zhuǎn)錄本的cSNP（編碼序列單核苷酸多態(tài)性）、可變剪接序列，對檢測低豐度轉(zhuǎn)錄本和發(fā)現(xiàn)新轉(zhuǎn)錄本具有優(yōu)勢。運用該技術(shù)研究血小板RNA的表達水平差異及表達譜的差異成為TEPs研究的熱門方向，目前國內(nèi)外已利用此技術(shù)發(fā)表多篇利用此技術(shù)實現(xiàn)了血小板內(nèi)RNA成分對腫瘤的診斷、鑒別診斷有價值的文獻。得出部分腫瘤的基于二代測序的TEPS腫瘤標記物，最著名的是Best等[13]人研究中用TEPS RNA譜實現(xiàn)了對腫瘤與非腫瘤區(qū)分，準確率為96%，對包括非小細胞肺癌、結(jié)直腸癌、膠質(zhì)母細胞瘤、胰腺癌、肝膽癌和乳腺癌的六種不同腫瘤類型分型，準確率為71%。另有單獨的研究用于區(qū)分神經(jīng)膠質(zhì)瘤與健康人的達到95%的檢測準確度[17]，區(qū)分肉瘤和非肉瘤樣本診斷準確率達到87%[18]的報道。如我國學者薛琳琳等[19]人在2018年發(fā)表的一篇文章中通過對5例肺癌患者及5例健康人血小板中差異表達的RNA譜進行研究，發(fā)現(xiàn)了204個差異表達顯著的RNA，其中185個在肺癌患者樣本中表達上調(diào)，19個下調(diào)，而且提出這些基因功能注釋可能與轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)和剪接體剪接代謝有關(guān)，另有中國學者在2019年報道了TEPs RNA對早期非小細胞肺癌診斷與鑒別肺良性結(jié)節(jié)的鑒別中表現(xiàn)出了價值[20]。

4.結(jié)論

綜上所述，血小板是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的中心參與者，已知血小板存在促進腫瘤進展、轉(zhuǎn)移的能力，但具體機制尚不完全清楚，通過基因?qū)用嬲页鲋虏』蛉缓蠓赐破渲虏C制不失為一個好的方法，能以高效、快速、低成本實現(xiàn)對血小板全部RNA的檢測，二代測序技術(shù)正好滿足了TEPs肺癌診斷的發(fā)展需求。目前，二代測序技術(shù)越來越多的用于轉(zhuǎn)錄組測序，如上所述，其用于腫瘤的前期研究已經(jīng)取得了很好的效果，接下來需要更大規(guī)模的臨床研究及數(shù)據(jù)支持這種新的液體活檢方法，二代測序技術(shù)仍將大大的發(fā)揮它的用處，當然，我們也期待第3、4代測序技術(shù)的普及應用的到來。