Piwi基因參與兩性鹵蟲(Artemia franciscana)的生殖調(diào)控研究*

任翊卓 韓學(xué)凱 左佳俊 歐陽(yáng)雪梅 段 虎 隋麗英

Piwi基因參與兩性鹵蟲(Artemia franciscana)的生殖調(diào)控研究*

任翊卓 韓學(xué)凱①左佳俊 歐陽(yáng)雪梅 段 虎 隋麗英①

(亞洲區(qū)域鹵蟲參考中心 天津科技大學(xué)海洋與環(huán)境學(xué)院 天津 300457)

(P-element induced wimpy testis)基因編碼Piwi蛋白, 在生殖干細(xì)胞的自我更新、減數(shù)分裂過(guò)程、RNA沉默和轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起重要作用。為探究基因參與兩性鹵蟲生殖發(fā)育的作用, 從兩性鹵蟲轉(zhuǎn)錄組中篩選獲得基因開(kāi)放閱讀框, 進(jìn)行序列分析和結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)等生物信息學(xué)分析, 采用qPCR技術(shù)研究該基因在生殖腺發(fā)育不同時(shí)期表達(dá)特征, 并利用RNAi顯微注射技術(shù)探究其功能。生物信息學(xué)分析表明,基因的開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)2 619 bp, 編碼872個(gè)氨基酸;基因編碼的蛋白分子量為98.11 kDa, 等電點(diǎn)為9.50, 為堿性親水性蛋白, 無(wú)信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu); 存在Piwi和PAZ結(jié)構(gòu)域及ArgoL1結(jié)構(gòu)域, 二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主, 三級(jí)結(jié)構(gòu)與之對(duì)應(yīng); 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示與蚤狀溞和大型溞的序列相似性最高。qPCR結(jié)果表明,基因在卵巢的卵黃發(fā)生晚期和晚期胚胎表達(dá)量最高, 顯著高于卵黃發(fā)生早期和早期胚胎(<0.01);基因在精巢的未成熟期表達(dá)量最高, 顯著高于成熟早期、成熟中期和成熟晚期(<0.01)。RNAi結(jié)果顯示, 該方法能顯著降低基因的表達(dá)水平(<0.01), 并導(dǎo)致所產(chǎn)后代均為休眠卵, 說(shuō)明基因不但在生殖發(fā)育調(diào)控起重要作用, 而且可能在其繁殖方式?jīng)Q定過(guò)程中起關(guān)鍵作用。研究結(jié)果為兩性鹵蟲Piwi/piRNA功能和分子機(jī)制調(diào)控的研究提供了基礎(chǔ)信息, 將有助于揭示基因參與調(diào)控兩性鹵蟲生殖發(fā)育機(jī)制。

;基因; 生殖腺; 基因表達(dá)特征; RNAi

Piwi (P-element induced wimpy testis)蛋白屬于Argonaute蛋白家族, 是RNA沉默通路中的主要蛋白。Argonaute蛋白具有PAZ和Piwi兩個(gè)主要結(jié)構(gòu)域(H?ck, 2008), 通過(guò)小RNAs介導(dǎo)基因調(diào)控從而在不同生理過(guò)程中促進(jìn)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)(Sheu-Gruttadauria, 2017)?；蛟诠?)生殖腺中被首次發(fā)現(xiàn), 在生殖干細(xì)胞的自我更新中發(fā)揮著重要作用(Cox, 1998), 主要由Piwi蛋白與小RNA (piRNAs)相互關(guān)聯(lián)形成復(fù)合體來(lái)實(shí)現(xiàn)其功能(Ozata, 2019)。研究發(fā)現(xiàn)Piwi蛋白在果蠅(Marie, 2017)、斑馬魚() (Houwing, 2007)和小鼠() (Xu, 2008)生殖系轉(zhuǎn)座子沉默中起關(guān)鍵作用, 是多種生物生殖系發(fā)育和干細(xì)胞自我更新過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)控因子(Ramat, 2021)。 Piwi蛋白與piRNAs形成piRNA通路, 在生殖細(xì)胞發(fā)育、性別決定、劑量補(bǔ)償?shù)扰c有性生殖相關(guān)的發(fā)育過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用(Ramat, 2021)?；蛲次锘虻娜笔?huì)導(dǎo)致線蟲() (Wang, 2008)、蠅類(Li, 2009)及哺乳動(dòng)物(Kim, 2012)的生育能力嚴(yán)重受損。在甲殼動(dòng)物中研究發(fā)現(xiàn)Piwi蛋白可在斑節(jié)對(duì)蝦()生殖細(xì)胞發(fā)育中發(fā)揮作用,可能參與了精子成熟的后期階段(Sukthaworn, 2020)。此外, Piwi蛋白對(duì)piRNAs的生物合成(Czech, 2016)、表觀遺傳調(diào)控(Huang, 2013)以及癌細(xì)胞生存和轉(zhuǎn)移(Halajzadeh, 2020)都是至關(guān)重要的。

鹵蟲()屬小型甲殼動(dòng)物, 廣泛分布于世界各地沿海鹽場(chǎng)和內(nèi)陸鹽湖高鹽水體中, 是鹵水生態(tài)系統(tǒng)食物鏈的重要組成部分和生物調(diào)節(jié)者(Dattilo, 2005), 無(wú)節(jié)幼體是水產(chǎn)養(yǎng)殖育苗中重要的生物餌料(Lopes-dos-Santos, 2019)。鹵蟲具有世代周期短、子代產(chǎn)量高和易于培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn), 是基礎(chǔ)和應(yīng)用生物學(xué)研究的良好實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(Manfra, 2015)。按照生殖方式, 鹵蟲可以分為兩性(Bisexual)鹵蟲和孤雌(Parthenogenetic)鹵蟲兩種類型, 并且均具有卵生(Oviparity)和卵胎生(Ovoviviparity)兩種繁育方式, 而鹵蟲生殖和繁育方式的特殊性也逐漸成為研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。在鹵蟲生殖及性別決定方面, 鱗翅類性別決定基因的同源基因已被證實(shí)是調(diào)控鹵蟲性別分化的途徑之一(Li, 2017); p90 RSK被證實(shí)參與鹵蟲卵母細(xì)胞成熟及休眠胚胎細(xì)胞周期等過(guò)程(段如冰, 2014); 而小熱休克蛋白p26影響鹵蟲的胚胎發(fā)育并在休眠生殖途徑中發(fā)揮重要作用(King, 2012)?；蛟谏撤矫嫫鹬匾淖饔? Dung等(2019)在鹵蟲中發(fā)現(xiàn)了Piwi蛋白家族成員Ago, 但未對(duì)其功能進(jìn)行研究, 而關(guān)于基因在鹵蟲中的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以兩性鹵蟲為研究對(duì)象, 獲得該基因的ORF序列并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析, 運(yùn)用qPCR檢測(cè)生殖腺不同發(fā)育時(shí)期基因的表達(dá)特征, 利用RNAi技術(shù)探究其功能, 為揭示兩性鹵蟲的生殖發(fā)育調(diào)控機(jī)制提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)選取兩性鹵蟲(VinhChau strain), 在28 °C光照條件下(24L : 0D)孵化培養(yǎng)。選取6個(gè)1L錐形瓶, 每個(gè)錐形瓶飼養(yǎng)200只兩性鹵蟲并投喂新鮮鹽生杜氏藻。根據(jù)孫瑜霞(2014)關(guān)于兩性鹵蟲胚胎發(fā)育的描述, 收集雌性鹵蟲卵黃發(fā)生早期(孵化后約16 d)、卵黃發(fā)生晚期(孵化后約19 d)、早期胚胎(孵化后約20 d)、晚期胚胎(孵化后約25 d)各個(gè)時(shí)期的卵巢。通過(guò)觀察雄性鹵蟲精巢的形態(tài)特征及成熟程度, 將雄蟲分為未成熟期(孵化后約8 d)、成熟早期(孵化后約13 d)、成熟中期(孵化后約19 d)、成熟晚期(孵化后約25 d)并收集各個(gè)時(shí)期的精巢, 將解剖后的組織迅速置于液氮中, 于–80 °C冰箱中保存。

1.2 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

取兩性鹵蟲卵巢和精巢組織, 采用Trizol法提取組織總RNA, 用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA純度, 并用核酸蛋白測(cè)定儀(Eppendorf BioPhotometer plus)測(cè)定RNA濃度, 后置于–80 °C冰箱保存。選用260/280范圍在1.8—2.0的RNA作為模板, 通過(guò)TaKaRa試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄, 將得到的cDNA分別作為常規(guī)PCR和qPCR模板, 并存于–20 °C冰箱備用。

1.3 兩性鹵蟲Piwi基因的獲得及分析

從前期構(gòu)建的兩性鹵蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選獲得基因片段, 該基因序列包括完整的開(kāi)放閱讀框(Open reading frame, ORF)。為保證基因序列的準(zhǔn)確性, 利用Primer Premier5軟件設(shè)計(jì)3對(duì)基因特異性引物(表1), 拼接得到其完整ORF用于比對(duì)。本實(shí)驗(yàn)涉及的引物均由北京華大基因科技有限公司合成。以兩性鹵蟲cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增, PCR體系(25 μL): ddH2O 10.5 μL、Premix Ex Taq 12.5 μL、上下游引物各0.5 μL、cDNA模板1 μL。PCR反應(yīng)條件: 94 °C預(yù)變性5 min; 94 °C變性1 min, 54 °C退火1 min, 72 °C延伸1 min 30 s, 35個(gè)循環(huán); 72 °C延伸10 min, PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶擴(kuò)增結(jié)果, 將含有目的片段的PCR產(chǎn)物送到北京華大基因科技有限公司測(cè)序。

1.4 兩性鹵蟲Piwi基因的生物信息學(xué)分析

通過(guò)在線軟件(表2)對(duì)兩性鹵蟲基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析, 包括對(duì)測(cè)序拼接得到的序列進(jìn)行ORF、理化性質(zhì)、親/疏水性、信號(hào)肽以及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析, 并進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè); 采用NCBI (http://www.ncbi. nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)兩性鹵蟲基因的氨基酸序列進(jìn)行BLAST比對(duì), 分析與其他物種的相似性; 利用MEGA5.0軟件將不同物種的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì), 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.5 Piwi基因在兩性鹵蟲生殖腺不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析

根據(jù)測(cè)序得到的兩性鹵蟲基因序列設(shè)計(jì)qPCR特異性引物-F和R (表1), 以作為內(nèi)參基因?qū)尚喳u蟲卵巢和精巢不同發(fā)育時(shí)期的mRNA表達(dá)量進(jìn)行qPCR檢測(cè)(美國(guó)伯樂(lè)Bio-rad)。反應(yīng)條件(20 μL): TB Green Premix Ex Taq II 10 μL、上下游引物各0.8 μL、ddH2O 6.4 μL、cDNA模板2 μL。反應(yīng)程序?yàn)? 95 °C預(yù)變性3 min, 95 °C變性10 s, 退火60 °C 30 s, 40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù), 采用2–△△Ct法計(jì)算目的基因在生殖腺不同發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量, 通過(guò)SPSS 25.0軟件對(duì)其進(jìn)行單因素方差分析,<0.05為差異顯著,<0.01為差異極顯著。

表1 引物信息

Tab.1 The primer information

表2 生物信息學(xué)在線分析軟件

Tab.2 Online analysis software in bioinformatics

1.6 dsRNA的合成及顯微注射RNAi

利用Primer Premier5軟件設(shè)計(jì)并合成基因dsRNA引物ds-F和ds-R及陰性對(duì)照增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因dsRNA引物ds-F和ds-R (表1), 引物的5′端包含T7啟動(dòng)子序列(TAATACGACTCACTATAGGG)。通過(guò)PCR擴(kuò)增基因的ORF片段并進(jìn)行純化回收, 獲得的基因片段連接到pGM-T載體上并提取質(zhì)粒, 使用TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit體外轉(zhuǎn)錄試劑盒從質(zhì)粒中體外轉(zhuǎn)錄dsRNA, 純化dsRNA并進(jìn)行消化反應(yīng)檢測(cè)其質(zhì)量(王志偉, 2017)。陰性對(duì)照基因dsRNA的合成同上。

分別設(shè)置對(duì)照組(ds)和干擾組(ds), 每組60只雌性鹵蟲, 采用顯微注射(日本Nikon NARISHIGE)對(duì)活力較好并處于卵黃發(fā)生早期的雌性鹵蟲進(jìn)行注射, 注射部位為雌性鹵蟲外骨骼和腸道之間的開(kāi)放循環(huán)體腔。將dsRNA溶于磷酸緩沖液中并與0.1%酚紅混合(1︰1, 體積分?jǐn)?shù))得到dsRNA顯微注射溶液, 每只雌性鹵蟲注射1 μL含1 000 ng dsRNA的溶液, 注射成功的雌性鹵蟲放入50 mL試管中單獨(dú)培養(yǎng)并進(jìn)行雌雄配對(duì)。待雌性鹵蟲發(fā)育到卵黃發(fā)生晚期、早期胚胎和晚期胚胎時(shí)分別收集卵囊, 每個(gè)時(shí)期設(shè)置3個(gè)平行, 每個(gè)平行收集5個(gè)卵囊, 利用qPCR測(cè)定干擾效果。剩余的對(duì)照組和干擾組雌性鹵蟲各15只繼續(xù)培養(yǎng)并觀察產(chǎn)后代情況, 通過(guò)SPSS 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行卡方檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1 兩性鹵蟲Piwi基因ORF序列的擴(kuò)增及測(cè)序

經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)基因的PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè), 得到清晰單一的條帶(圖1), 對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接比對(duì)后, 發(fā)現(xiàn)得到的基因序列與預(yù)期目的基因片段大小一致, 驗(yàn)證后得到兩性鹵蟲基因ORF大小為2 619 bp, 編碼872個(gè)氨基酸。

圖1 兩性鹵蟲Piwi基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

注: M. Marker DL 2000; 1—3. 引物-F2/R2的擴(kuò)增條帶; 4—6. 引物-F3/R3的擴(kuò)增條帶; 7—9. 引物-F1/R1的擴(kuò)增條帶

2.2 兩性鹵蟲Piwi基因的相似性分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

兩性鹵蟲基因氨基酸序列與昆蟲綱、甲殼綱(節(jié)肢動(dòng)物門)和雙殼綱、瓣鰓綱(軟體動(dòng)物門)相關(guān)物種的基因氨基酸序列相對(duì)較近, 相似性范圍為41.05%—43.02% (表3)。使用MEGA5.0軟件構(gòu)建基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖2), 表明兩性鹵蟲基因與蚤狀溞和大型溞的序列相似性最高。

2.3 兩性鹵蟲Piwi基因編碼蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析

兩性鹵蟲基因編碼蛋白的分子式為C4362H6911N1237O1255S42, 分子質(zhì)量為98.11 kDa, 氨基酸總數(shù)為872, 含量最多的是甘氨酸Gly (8.1%)和纈氨酸Val(8.0%), 其次是精氨酸Arg (7.2%)和亮氨酸Leu (7.0%), 帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)(Asp+Glu)為89, 帶正電荷的殘基總數(shù)(Arg+Lys)為122, 總平均親水性(GRAVY)為–0.386, 理論等電點(diǎn)為9.50, 不穩(wěn)定指數(shù)為33.97。

2.4 兩性鹵蟲Piwi基因編碼蛋白的信號(hào)肽、親/疏水性及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析

信號(hào)肽分析發(fā)現(xiàn)基因編碼蛋白無(wú)信號(hào)肽(圖3a)。親/疏水性分析得到748位點(diǎn)處的半胱氨酸(Cys)有最大值為2.222, 115位點(diǎn)處的天冬氨酸(Asp)有最小值為–2.844 (圖3b), 該蛋白為親水性蛋白。亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)該蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)分布最多(47.8%), 其次為細(xì)胞核(30.4%), 線粒體(13%)、細(xì)胞骨架(4.3%)和質(zhì)膜(4.3%)分布最少。

表3基因氨基酸序列的相似性比較

Tab.3 Comparison in amino acid sequence similarity of Piwi gene

圖2 兩性鹵蟲Piwi基因氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

圖3 兩性鹵蟲Piwi基因編碼蛋白信號(hào)肽、親水性、保守結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

注: a. Piwi蛋白信號(hào)肽分析; b. Piwi蛋白親水性分析; c. Piwi蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè); d. Piwi蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.5 兩性鹵蟲Piwi基因編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域與跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

對(duì)Piwi蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該蛋白共包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域, 其中第241—291位氨基酸為ArgoL1結(jié)構(gòu)域, 第292—430位氨基酸為PAZ結(jié)構(gòu)域, 第418—855位氨基酸為Piwi結(jié)構(gòu)域(圖3c)。對(duì)跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)Piwi蛋白無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域(圖3d)。

2.6 兩性鹵蟲Piwi基因編碼蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

對(duì)Piwi蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該蛋白主要由4種折疊方式構(gòu)成, 282個(gè)α-螺旋占比32.34%, 177個(gè)延伸鏈占比20.30%, 39個(gè)β-轉(zhuǎn)角占比4.47%, 374個(gè)無(wú)規(guī)則卷占比42.87%(圖4a)。蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)相符, 無(wú)規(guī)則卷、α-螺旋和延伸鏈?zhǔn)窃摰鞍捉Y(jié)構(gòu)的主體(圖4b)。

圖4 兩性鹵蟲Piwi基因編碼蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

注: a. 兩性鹵蟲Piwi蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè); b. 兩性鹵蟲Piwi蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.7 Piwi基因在兩性鹵蟲生殖腺不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析

通過(guò)qPCR檢測(cè)基因在兩性鹵蟲卵巢和精巢不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量, 結(jié)果表明基因的表達(dá)普遍存在于卵巢和精巢中。在卵巢發(fā)育過(guò)程中,基因在卵黃發(fā)生晚期和晚期胚胎表達(dá)量最高, 顯著高于卵黃發(fā)生早期和早期胚胎(<0.01); 在精巢發(fā)育過(guò)程中,基因在精巢未成熟期表達(dá)量最高, 顯著高于精巢成熟早期、成熟中期和成熟晚期(<0.01) (圖5)。

圖5 Piwi基因在兩性鹵蟲不同發(fā)育時(shí)期卵巢和精巢中的表達(dá)

注: 相同字母表示差異不顯著(>0.05); 不同字母表示差異極顯著(<0.01)

2.8 RNAi干擾后Piwi基因的表達(dá)及對(duì)后代的影響

與對(duì)照組ds相比, 雌性鹵蟲在注射ds后的卵黃發(fā)生晚期、早期胚胎、晚期胚胎均檢測(cè)到基因的表達(dá)量極顯著降低(<0.01), 干擾效率分別為91%、82%、92%, 說(shuō)明顯微注射實(shí)驗(yàn)是成功的(圖6)。觀察RNAi干擾后雌性鹵蟲產(chǎn)后代的情況, 發(fā)現(xiàn)顯微注射后大約10 d對(duì)照組(ds)和干擾組(ds)均有后代產(chǎn)出。15只注射ds的雌性鹵蟲中有10只雌性鹵蟲存活并全部產(chǎn)休眠卵; 15只注射ds的雌性鹵蟲中有11只雌性鹵蟲存活, 其中9只產(chǎn)無(wú)節(jié)幼體, 2只產(chǎn)休眠卵, 卡方檢驗(yàn)顯示對(duì)照組與干擾組產(chǎn)卵和產(chǎn)幼上存在極顯著差異(<0.01), 因此基因的敲降誘導(dǎo)兩性鹵蟲產(chǎn)休眠卵。

3 討論

本研究選取兩性鹵蟲為研究對(duì)象, 得到了基因完整的ORF為2 619 bp, 編碼872個(gè)氨基酸, 與甲殼動(dòng)物中的中華絨螯蟹() (王敏, 2015)以及昆蟲中的家蠶() (廖珍, 2009)、小菜蛾() (Hameed, 2018)等物種的基因序列長(zhǎng)度相似。生物信息學(xué)分析顯示, 兩性鹵蟲Piwi蛋白分子質(zhì)量為98.11 kDa, 總平均親水性(GRAVY)為–0.386, 推測(cè)該蛋白為親水性蛋白, 與親/疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果一致; 正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)大于負(fù)電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu), 故該蛋白帶正電荷; 理論等電點(diǎn)為9.50, 為偏堿性蛋白; 不穩(wěn)定指數(shù)為33.97, 屬于穩(wěn)定蛋白, 故該蛋白屬于穩(wěn)定的堿性親水性蛋白。兩性鹵蟲Piwi蛋白含有保守的PAZ和Piwi結(jié)構(gòu)域, 屬于Argonaute蛋白家族, 這與Dung等(2019)關(guān)于兩性鹵蟲ArAgo蛋白結(jié)構(gòu)域的研究結(jié)果一致。在動(dòng)物中, Argonaute蛋白家族有AGO亞家族和PIWI亞家族兩個(gè)分支, 其中PIWI亞家族由N端結(jié)構(gòu)域、PAZ結(jié)構(gòu)域、MID結(jié)構(gòu)域和Piwi結(jié)構(gòu)域組成, 而PAZ結(jié)構(gòu)域和Piwi結(jié)構(gòu)域是最保守的(Sheu-Gruttadauria, 2017)。PAZ結(jié)構(gòu)域能夠與piRNA的3′結(jié)合, Piwi結(jié)構(gòu)域中心有引導(dǎo)單鏈裂解的RNaseH, 具有核酸內(nèi)切酶活性(Kwon, 2014)。

圖6 顯微注射后Piwi基因在兩性鹵蟲不同時(shí)期卵巢中的表達(dá)

注: **表示與對(duì)照有極顯著性差異(<0.01)

piRNAs是一類主要在動(dòng)物生殖系中表達(dá)的非編碼小RNA, 與Piwi蛋白形成piRNA通路, 參與轉(zhuǎn)座子沉默和基因表達(dá)調(diào)控, 在生物發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用(Ramat, 2021)。該通路依賴piRNAs序列的特異性來(lái)識(shí)別轉(zhuǎn)座子靶點(diǎn), 參與轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄后抑制和表觀遺傳來(lái)保護(hù)基因組的完整性; 通過(guò)Piwi蛋白提供效應(yīng)功能, 在動(dòng)物生殖細(xì)胞防御系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用(Zhou, 2015)。Piwi蛋白是生殖腺發(fā)育過(guò)程中piRNA合成以及轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控所必需的, 該蛋白成員定位于不同的細(xì)胞區(qū)域(Tamtaji, 2020)。本研究通過(guò)生物信息學(xué)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè), 發(fā)現(xiàn)Piwi蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)(47.8%)和細(xì)胞核(30.4%)中, 推測(cè)Piwi蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮著重要作用。果蠅(Klattenhoff, 2008)和小鼠(Ishizu, 2012)的研究結(jié)論也證實(shí)了這一觀點(diǎn), 果蠅的Argonaute蛋白家族成員Aubergine (Aub)蛋白和Argonaute 3 (Ago3)蛋白位于細(xì)胞質(zhì)和生殖細(xì)胞顆粒中, 它們?cè)趐iRNA的產(chǎn)生中發(fā)揮著重要作用, 而Piwi蛋白主要在生殖細(xì)胞核的轉(zhuǎn)錄沉默中起作用。此外, 小鼠中含有三種Piwi蛋白, Mili和Miwi在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)參與piRNA合成, 調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄后沉默, 而Miwi2位于細(xì)胞核, 在調(diào)控細(xì)胞核沉默中發(fā)揮作用。本研究通過(guò)相似性比對(duì)可知,基因在昆蟲中的保守性較高, 且兩性鹵蟲與昆蟲的基因氨基酸序列相對(duì)較近。Li等(2017)的研究證實(shí)了鱗翅類性別決定基因Masc的同源基因是調(diào)控兩性鹵蟲性別分化的途徑之一, 也有報(bào)道稱家蠶卵巢培養(yǎng)細(xì)胞系BmN4特異性表達(dá)兩種PIWI亞家族蛋白Siwi和BmAgo3以及大量的piRNAs (Kawaoka, 2009), 此后又有研究發(fā)現(xiàn)家蠶中、基因可與Piwi蛋白組成“乒乓”性別級(jí)聯(lián)通路, 從而進(jìn)一步完善了piRNA通路(Shoji, 2017), 這些結(jié)果表明兩性鹵蟲中基因可能與家蠶中基因行使著相似的功能。

為了進(jìn)一步研究基因?qū)尚喳u蟲的調(diào)控功能, 本研究通過(guò)qPCR檢測(cè)基因在兩性鹵蟲生殖腺中不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量, 結(jié)果顯示基因在兩性鹵蟲卵巢和精巢各個(gè)階段均有表達(dá), 但表達(dá)量有顯著差異。在兩性鹵蟲受精前,基因在卵巢中的表達(dá)量逐漸上升, 到卵黃發(fā)生晚期基因表達(dá)量最高; 卵巢受精后,基因表達(dá)量驟降, 在之后4—5 d的胚胎發(fā)育過(guò)程中,基因表達(dá)量再次呈現(xiàn)上升的趨勢(shì), 這種表達(dá)趨勢(shì)與家蠶和西方蜜蜂()卵巢發(fā)育中基因表達(dá)相似(廖珍, 2009)。在卵巢整個(gè)發(fā)育過(guò)程中,基因在卵黃發(fā)生晚期與晚期胚胎表達(dá)量最高, 推測(cè)基因在兩性鹵蟲準(zhǔn)備受精的過(guò)程和胚胎發(fā)育即將進(jìn)入不同生殖途徑過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

目前沒(méi)有雄性鹵蟲精巢相關(guān)的報(bào)道, 本研究首次完成了對(duì)雄性鹵蟲的生殖發(fā)育周期的探究。與蝦蟹等甲殼動(dòng)物不同, 鹵蟲發(fā)育周期短, 本研究根據(jù)精巢發(fā)育程度將精巢發(fā)育分為四個(gè)時(shí)期。雄性鹵蟲精巢從未成熟期到成熟期的發(fā)育過(guò)程中,基因表達(dá)水平呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì), 且四個(gè)時(shí)期均存在極顯著差異, 推測(cè)基因在雄性鹵蟲精巢發(fā)育前期起著重要作用。相比于其他甲殼動(dòng)物,基因在中華絨螯蟹精巢中的表達(dá)與本研究結(jié)果相似, 即隨著精巢的逐漸發(fā)育,表達(dá)量降低(王敏, 2015)。而在三疣梭子蟹()中基因雖在精子細(xì)胞的不同發(fā)育階段均有表達(dá), 但其在精子細(xì)胞早期、中期和晚期的表達(dá)沒(méi)有顯著差異, 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Piwi蛋白主要分布在頂體小管和膜復(fù)合物上, 表明其可能在精子發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮功能(Xiang, 2014)。

piRNAs和Piwi蛋白對(duì)于生殖系的形成和維持是必不可少的, piRNA通路受損會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)座子的過(guò)表達(dá), 顯著破壞基因組結(jié)構(gòu), 并導(dǎo)致生殖細(xì)胞死亡和不育(Tóth, 2016)。斑馬魚的Ziwi(Houwing, 2007)和Zili (Houwing, 2008)兩種Piwi蛋白對(duì)維持生殖系至關(guān)重要, Ziwi在生殖細(xì)胞發(fā)育的有絲分裂和早期減數(shù)分裂階段大量表達(dá), Ziwi缺失使幼魚生殖細(xì)胞衰竭, 并導(dǎo)致成魚生殖細(xì)胞異常凋亡。鹵蟲作為一種良好的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物, 其多種生物學(xué)機(jī)制如抗逆性和滯育(Liu, 2009)、細(xì)胞分裂(Chen, 2016)、發(fā)育分化(Copf, 2004)和繁殖(Dai, 2011)等方面研究已開(kāi)展較多。本研究利用RNAi技術(shù)探究?jī)尚喳u蟲基因的功能, 對(duì)處于卵黃發(fā)生早期的雌性鹵蟲進(jìn)行顯微注射, 利用qPCR檢測(cè)注射后雌性鹵蟲的干擾效率, 結(jié)果顯示基因的干擾效率均在90%左右, 顯微注射很成功。觀察RNAi干擾后雌性鹵蟲產(chǎn)后代的情況, 發(fā)現(xiàn)對(duì)照組(ds)和干擾組(ds)胚胎發(fā)育周期都很正常, 然而干擾組由于基因的敲降導(dǎo)致兩性鹵蟲胚胎滯育產(chǎn)生休眠卵。這說(shuō)明基因的表達(dá)量減少可促使雌性鹵蟲胚胎發(fā)育進(jìn)入卵生生殖途徑,基因在兩性鹵蟲的生殖發(fā)育過(guò)程中起到了重要作用, 這可能與兩性鹵蟲的生殖方式?jīng)Q定機(jī)制相關(guān)。而在斑節(jié)對(duì)蝦中,同源物(Sukthaworn, 2019)和(Sukthaworn, 2020)在斑節(jié)對(duì)蝦雌雄生殖腺不同發(fā)育階段均有表達(dá), 且或的敲降都會(huì)導(dǎo)致精子數(shù)量的顯著減少, 同樣表明基因可能在斑節(jié)對(duì)蝦生殖系發(fā)育中發(fā)揮重要作用。本研究為兩性鹵蟲Piwi/piRNA分子機(jī)制和功能的后續(xù)研究以及兩性鹵蟲生殖方式方面的研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù), 同時(shí)為甲殼動(dòng)物生殖發(fā)育調(diào)控研究奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究成功獲得兩性鹵蟲基因完整的開(kāi)放閱讀框, 其總長(zhǎng)2 619 bp, 編碼872個(gè)氨基酸; 生物信息學(xué)分析顯示, Piwi蛋白包含PAZ結(jié)構(gòu)域、Piwi結(jié)構(gòu)域和ArgoL1結(jié)構(gòu)域, 二級(jí)結(jié)構(gòu)的主體為無(wú)規(guī)則卷、α-螺旋和延伸鏈, 且該蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中; 進(jìn)化樹(shù)分析表明兩性鹵蟲與大型溞和蚤狀溞的序列相似性最高; qPCR結(jié)果顯示兩性鹵蟲在生殖腺中均有表達(dá)且在發(fā)育不同階段存在差異表達(dá)。注射ds后能夠有效抑制兩性鹵蟲基因的表達(dá), 且與對(duì)照組相比干擾組后代均產(chǎn)休眠卵。說(shuō)明基因在兩性鹵蟲的生殖發(fā)育及生殖方式?jīng)Q定過(guò)程中起到重要作用。

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THE REPRODUCTIVE REGULATION OFIN BISEXUAL

REN Yi-Zhuo, HAN Xue-Kai, ZUO Jia-Jun, OUYANG Xue-Mei, DUAN Hu, SUI Li-Ying

(Asia Regional Artemia Reference Center,College of Marine and Environmental Sciences, Tianjin University of Science and Technology,Tianjin300457, China)

(P-element induced wimpy testis) encoded Piwi protein, and it plays an important role in self-renewal, meiosis, RNA silencing and transcriptional regulation of germ stem cells. To study the role ofin the reproductive development of bisexual, the open reading frame (ORF) ofwas obtained fromtranscriptome, and bioinformatics including sequencing and domain prediction were analyzed. The expression ofin different stages of gonad development ofwere characterized by qPCR, and its function was verified by microinjection RNAi technology. Results showed that the ORF length ofwas 2619 bp, encoding 872 amino acid with a predicted molecular weight of 98.11 kDa, and a theoretical isoelectric point of 9.50. Piwi protein was an alkaline hydrophilic protein containing no signal peptide and transmembrane structure, and included the Piwi and PAZ domains as well as the ArgoL1 domain. The secondary structure was mainly composed of α-helix, which is consistent with the tertiary structure. The phylogenetic tree demonstrated that thesequences ofwere the most similar to those ofandAs shown in the qPCR analysis, theexpression in the later oocytes and later embryos was significantly higher than those of early oocytes and early embryos in ovary (<0.01). The expression level ofin testis was the highest in the immature stage, which was significantly higher than those in early, middle and late maturation stages (<0.01). In addition, applying RNAi (nterference) technology could significantly reduce the expression level of(<0.01) and all offsprings were cysts, suggesting thatgene not only plays an important role in the regulation of reproductive development of, but also may play a key role in determining the reproductive modes of. This study provided basic information for analyses on Piwi/piRNA pathway functions and molecular mechanisms in bisexual, and will help to reveal the role ofin regulating the reproductive mechanism in bisexual.

;gene; gonad; gene expression character; RNAi

* 天津市自然科學(xué)基金項(xiàng)目, 18JCQNJC78500號(hào); 天津市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目, 17ZXZYNC00060號(hào); 教育部長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目, IRT-17R81號(hào)。任翊卓, 碩士研究生, E-mail: 15732620442@163.com

隋麗英, 博士, 教授, E-mail: suily@tust.edu.cn; 韓學(xué)凱, 博士, 助理研究員, E-mail: hanxk@tust.edu.cn

2021-03-16,

2021-04-29

Q789; Q956; S966

10.11693/hyhz20210300069