黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)成體造血器官頭腎和體腎轉(zhuǎn)錄組比較研究*

鐘愛華 代小新

黃顙魚()成體造血器官頭腎和體腎轉(zhuǎn)錄組比較研究*

鐘愛華 代小新

(浙江海洋大學水產(chǎn)學院 舟山 316022)

硬骨魚類具有獨特的免疫系統(tǒng), 其頭腎和體腎是重要的造血和免疫器官。為探索黃顙魚頭腎和體腎造血和免疫功能異同, 采用Illumina HiSeq NovaSeq 6000測序平臺對黃顙魚頭腎和體腎進行了轉(zhuǎn)錄組高通量測序; 測序序列經(jīng)質(zhì)控、組裝后, 共獲得59 979個轉(zhuǎn)錄本(transcript), N50為3 919 bp; 獲得的轉(zhuǎn)錄本在NR、GO、KEGG、Swiss-Prot和Pfam數(shù)據(jù)庫中比對和注釋, 共有24 487個Unigenes獲注釋。差異表達基因分析顯示, 1 112個基因在頭腎中上調(diào), 包括KIT配體、早期B細胞因子1、Toll樣受體1和2等免疫相關(guān)基因; 2 737個基因在體腎中上調(diào), 如C-C趨化因子19和25、補體5和9、白細胞介素17受體C、RIG-I和白細胞介素27等免疫相關(guān)基因, 部分抗體重鏈可變區(qū)編碼基因和抗體輕鏈κ鏈可變區(qū)編碼基因僅在體腎中表達。結(jié)果表明, 黃顙魚頭腎和體腎中免疫相關(guān)基因表達具有差異性, 兩者造血和免疫功能具有組織特異性。研究結(jié)果有助于黃顙魚頭腎和體腎造血和免疫功能研究, 可為黃顙魚病害防治提供基礎資料。

黃顙魚; 頭腎; 體腎; 轉(zhuǎn)錄組測序

硬骨魚類免疫系統(tǒng)與哺乳動物不同, 硬骨魚類骨髓沒有造血功能, 取而代之的是頭腎和體腎, 成體時頭腎一般不具有腎小管, 因而沒有排泄功能; 而體腎既有排泄功能又有造血功能。作為重要的中樞免疫器官, 頭腎和體腎不僅能支持造血細胞分化、發(fā)育、成熟, 維持血細胞相對穩(wěn)態(tài), 還參與機體免疫防御反應, 以阻止和清除入侵病原體及其毒素(Zwollo, 2005)。

黃顙魚()隸屬于輻鰭魚綱、鯰形目、鲿科、黃顙魚屬, 俗名嘎牙子、黃姑子、黃臘丁、黃骨魚等, 廣泛分布于我國廣大江河流域。黃顙魚是一種耐低氧、廣溫性淡水魚類, 溶氧大于2 mg/L、水溫1—38 °C之間均能正常生存, 諸多優(yōu)點使其成為重要的淡水養(yǎng)殖魚類。中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示, 2017年全國黃顙魚產(chǎn)量為480 032 t, 2018年產(chǎn)量為509 610 t, 2019年產(chǎn)量為536 964 t, 連續(xù)兩年產(chǎn)量不斷增加。隨著養(yǎng)殖規(guī)模擴大, 高密度養(yǎng)殖環(huán)境中, 黃顙魚常常感染細菌、寄生蟲以及病毒, 如愛德華氏菌、嗜水氣單胞菌等, 輕則影響黃顙魚生長, 重則導致其大規(guī)模死亡(Li, 2018)。目前有關(guān)黃顙魚研究主要集中在養(yǎng)殖技術(shù)、人工繁殖、病害防控等方面(胡偉華等, 2019; 王國霞等, 2020; 郭勛等, 2020; 藺凌云等, 2020), 筆者在進行黃顙魚血細胞發(fā)生研究時發(fā)現(xiàn)頭腎中有更多的原紅細胞, 為了探索頭腎和體腎造血以及免疫功能異同, 筆者進行了轉(zhuǎn)錄組高通量測序, 以期望探明兩者造血和免疫功能的分子機制, 為黃顙魚病害防治奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣本準備

實驗用黃顙魚() [體質(zhì)量(200±25) g]來自浙江省寧波市養(yǎng)殖農(nóng)場, 選擇健康無傷、體表無寄生蟲、反應敏捷的健康黃顙魚, 帶回實驗室暫養(yǎng), 暫養(yǎng)水體為100 L, 溫度(20±2) °C、溶解氧大于5 mg/L。暫養(yǎng)5 d后, 隨機挑選9尾大小相近的黃顙魚, 丁香酚麻醉后取其頭腎和體腎, 凍存于液氮中用于抽提RNA, 因頭腎較小, 為保證測序質(zhì)量, 每 3個個體組成一個樣本。

1.2 RNA抽提

先采用Trizol (Invitrogen)試劑盒提取頭腎和體腎中總RNA, 然后使用DNase I (TaKaRa)去除基因組DNA, 獲得的RNA樣品用2100 Bioanalyser (Agilent)、ND-2000 (NanoDrop Technologies)檢測質(zhì)量, 以保證合格樣品(OD260/280=1.8—2.2, OD260/230≥2.0, RIN≥9.0, 28S:18S≥1.0, 總量>2 μg)用于轉(zhuǎn)錄組測序。

1.3 文庫建立和測序

文庫建立采用TruSeqTMRNA sample preparation Kit (Illumina, San Diego, CA)試劑盒進行。首先用帶有Oligo(dT)的磁珠從1 μg總RNA中富集含有poly-A尾巴的mRNA, 再加入片段化緩沖液, 將mRNA隨機斷裂成200 bp左右的小片段; 接著采用SuperScript double-stranded cDNA synthesis kit (Invitrogen, CA)試劑盒, 加入六堿基隨機引物(Illumina), 以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成一鏈cDNA, 然后合成第二鏈, 形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。雙鏈的cDNA結(jié)構(gòu)為粘性末端, 加入End Repair Mix將其補成平末端, 隨后在3′末端加上A堿基, 用于連接Y字形的接頭。獲得的cDNA經(jīng)過15個PCR擴增, 擴增試劑盒采用sample preparation Kit (Illumina, San Diego, CA), 采用瓊脂糖電泳篩選200—300 bp的條帶, 經(jīng)TBS380 (Picogreen)定量后, 用于用Illumina HiSeq NovaSeq 6000測序平臺進行高通量測序, 測序讀長為PE150。

1.4 有參考基因轉(zhuǎn)錄組組裝

測序獲得的原始數(shù)據(jù)(Raw Date)使用SeqPrep v1.3.2去除reads中接頭, 過濾掉不合格的序列后所獲得的序列即為有效數(shù)據(jù)。具體為先去除reads中的接頭序列, 去除因接頭自連等原因?qū)е聸]有插入片段的reads; 然后將序列末端(3′端)低質(zhì)量(質(zhì)量值小于20)的堿基修剪掉, 若剩余序列中仍然有質(zhì)量值小于10的堿基, 則將整條序列剔除, 否則保留; 去除含N(模塊堿基)的reads, 舍棄去接頭和質(zhì)量修剪后長度小于30 bp的序列, 余下的序列為有效數(shù)據(jù)。使用HISAT2軟件將過濾后的高質(zhì)量數(shù)據(jù)(Clean reads)比對到黃顙魚基因組上, 基因組來自NCBI (https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/term=txid1234273), 然后采用StringTie2軟件進行組裝, 具體為先將重合的reads對組裝成super-reads, 然后將super-reads比對到參考基因組, 并構(gòu)建剪接(splice)位點的結(jié)構(gòu)圖(graph), 最后將read覆蓋高的路徑進行組裝從而形成轉(zhuǎn)錄本(transcript)序列和Unigenes序列。

1.5 基因注釋和功能分析

采用軟件DIAMOND (Buchfink, 2015), 將組裝獲得的Unigenes序列在NCBI-NR (http://www. ncbi.nlm.nih.gov/)、Pfam (http://pfam.xfam.org/)、GO (http://www.geneontology.org)、KEGG (http://www. genome.jp/kegg/)和Swiss-Prot (https://www.uniprot. org/)數(shù)據(jù)庫中進行比對(期望值E value<1e-5), 從而全面獲得Unigenes注釋信息。

1.6 差異表達基因分析

先采用RSEM v1.3.3將Clean reads比對到組裝的Unigene序列上, 獲得每個轉(zhuǎn)錄本序列read數(shù)目, 然后計算TPM (Transcripts Per Kilobase Million)值, 以獲得Unigene的表達量。采用R軟件包中的Deseq篩選兩組織中表達量顯著差異的基因, 篩選標準為|log2Fold Change| > 1.5且錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05。

獲得的差異表達基因, 以注釋的所有基因作為參考, 采用Goatools和KOBAS3.0分析差異表達基因所在的GO類別和KEGG信號通路, 顯著富集的判斷標準為Bonferroni方法對值進行校正, 校正的值(FDR)<0.05時, 此GO類別和KEGG信號通路存在顯著富集情況。

1.7 qRT-PCR (實時熒光定量PCR)驗證

從頭腎和體腎中隨機挑選出4個差異表達免疫基因, 分別為2個在頭腎中上調(diào)基因以及2個在體腎中上調(diào)基因, 進行qRT-PCR分析。先從3個生物學樣本中提取RNA, 然后采用HiScript Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) (諾唯贊)試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA, 以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板, 采用ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix (2×) (諾唯贊)試劑盒進行PCR擴增。擴增引物由Primer premier 5軟件設計(表1), 內(nèi)參基因為β-肌動蛋白(), 基因相對表達量按2–ΔΔCt法計算(Livak, 2001), 結(jié)果使用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析, 統(tǒng)計學差異水平為<0.05。

表1 qRT-PCR擴增用引物

Tab.1 Primers for qRT-PCR

2 結(jié)果

2.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)控、比對及組裝

測序后黃顙魚體腎和頭腎中獲得超過8 Gb的原始堿基(raw bases), 原始數(shù)據(jù)經(jīng)過修剪、過濾不合格序列后, 體腎中獲得超過56 440 624條有效數(shù)據(jù)(clean reads), 頭腎中獲得超過63 788 540條有效序列, 頭腎和體腎有效序列的質(zhì)量得分Q20均大于98%, Q30均大于94%。獲得的有效reads與參考基因組進行比對, 體腎中93%以上的有效reads能定位到基因組上, 頭腎中92%的有效reads能定位到基因組上(見表2)。

有效序列經(jīng)組裝后, 共獲得59 979個轉(zhuǎn)錄本, 最長轉(zhuǎn)錄本長度為95 343 bp, 轉(zhuǎn)錄本N50值為3 919 bp, 大部分轉(zhuǎn)錄本的長度超過1 800 bp, 有40 134個轉(zhuǎn)錄本, 占比66.91% (圖1)。

2.2 功能注釋

組裝獲得的轉(zhuǎn)錄本在五個數(shù)據(jù)庫(NR、Swiss-Prot、Pfam、GO和KEGG)中進行比對, 以全面獲得轉(zhuǎn)錄本功能信息, 五個數(shù)據(jù)庫中共注釋24 487個Unigenes, 注釋率為40.82%, 12 791個Unigenes在5個數(shù)據(jù)庫中均獲得注釋(圖2)。五個數(shù)據(jù)庫中, NR數(shù)據(jù)庫注釋的Unigenes最多。

表2 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

Tab.2 Statistics of sequencing data

圖1 轉(zhuǎn)錄本長度分布

圖2 基因注釋信息韋恩圖

GO (Gene Ontology)數(shù)據(jù)庫是一個對基因和蛋白功能進行統(tǒng)一限定和描述的數(shù)據(jù)庫, 在GO數(shù)據(jù)庫中, 共注釋到17 838個基因, 這些基因分屬于三個GO類別: 細胞成分(cellular component, CC)、生物過程(biological process, BP)和分子功能(molecular function, MF), 細胞成分類別中以“細胞部分”和“細胞膜部分”為主, 生物過程類別中以“細胞過程”和“生物調(diào)節(jié)”為主, 分子功能中以“結(jié)合”和“催化活性”為主(圖3)。

KEGG數(shù)據(jù)庫是一個整合了基因組、化學和系統(tǒng)功能信息的數(shù)據(jù)庫, 在KEGG數(shù)據(jù)庫中共注釋到15 319個基因, 這些基因涉及KEGG代謝通路的5個分支: 環(huán)境信息處理(environmental information processing)、遺傳信息處理(genetic information processing)、細胞過程(cellular processes)、代謝(metabolism)、機體系統(tǒng)(organismal systems), 5個分支中基因數(shù)量最多的類別為: 信號轉(zhuǎn)導(signal transduction)、免疫系統(tǒng)(immune system)、內(nèi)分泌系統(tǒng)(endocrine system)、信號分子與相互作用(signaling molecules and interaction)以及轉(zhuǎn)運和分解代謝(transport and catabolism) (圖4)。

根據(jù)5個數(shù)據(jù)庫注釋的基因信息, 258個基因在頭腎中特異性表達, 1 974個基因在體腎中特異性表達。根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫注釋信息, 大部分免疫通路組成元件均在頭腎和體腎中表達, 如Toll樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路等組成元件; 但部分免疫相關(guān)基因僅在體腎中表達(圖5), 包括C-X-C趨化因子9、補體C8γ鏈、抗體重鏈可變區(qū)編碼基因(如可變區(qū)V3-6、V5A、V914等)、抗體輕鏈κ鏈可變區(qū)編碼基因(如V-V區(qū)MOPC 149)。

圖3 基因功能GO類別統(tǒng)計

注: BP為生物過程, CC為細胞成分, MF為分子功能

圖4 基因功能KEGG類別統(tǒng)計

注: A為代謝, B為遺傳信息處理, C為環(huán)境信息處理, D為細胞過程, E為機體系統(tǒng)

圖5 頭腎和體腎中免疫相關(guān)信號通路基因注釋分析

2.3 差異表達基因及其GO功能分析

黃顙魚頭腎和體腎Unigenes表達差異分析表明, 1 112個基因在頭腎中上調(diào)(圖6), 根據(jù)GO注釋, 頭腎中上調(diào)差異基因注釋到結(jié)合GO類別的最多, 有566個; 其次是注釋到細胞過程和細胞部分GO類別, 分別有437和384個基因。2 737個基因在體腎中上調(diào)(圖6), 注釋到催化活性GO類別的差異基因數(shù)目最多, 有978個; 其次是注釋到膜部分GO類別, 有890個基因; 再次是注釋到細胞過程GO類別, 有819個基因。

2.4 差異表達基因KEGG代謝通路富集分析

頭腎中上調(diào)的差異基因富集到263條KEGG代謝通路中, 顯著富集的KEGG通路有皮質(zhì)醇的合成和分泌、甲狀旁腺激素的合成與分泌、B細胞受體信號通路、MAPK信號通路和ErbB信號通路等(圖7a)。另外, 與免疫功能相關(guān)的顯著富集通路有B細胞受體信號通路、趨化因子信號通路、Th1和Th2細胞分化、Th17細胞分化、C-型凝集素受體信號通路、Toll受體信號通路以及T細胞受體信號通路。

圖6 差異表達基因分布火山圖

注: 藍色點為頭腎中上調(diào)基因; 紅色點為體腎中上調(diào)基因

體腎中上調(diào)的差異基因富集到324條KEGG代謝通路中, 顯著富集的通路有谷胱甘肽代謝、氧化磷酸化、產(chǎn)生IgA的腸道免疫網(wǎng)絡、造血細胞系以及甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝等(圖7b)。與免疫系統(tǒng)相關(guān)的顯著富集通路有產(chǎn)生IgA的腸道免疫網(wǎng)絡、造血細胞系、FceRI信號通路、FcγR介導的吞噬作用和自然殺傷細胞介導的細胞毒性。

圖7 差異表達基因富集的KEGG通路

注: a. 頭腎中上調(diào)基因富集的前20條通路; b. 體腎中上調(diào)基因富集的前20條通路

2.5 差異表達關(guān)鍵造血和免疫基因分析

根據(jù)差異表達基因KEGG代謝通路富集分析, 頭腎中篩選到差異表達關(guān)鍵免疫基因有: CD97A、CD97B、CD124、C-C趨化因子受體3 (C-C chemokine receptor type 3)、C-C趨化因子受體7 (C-C chemokine receptor type 7)、C-X-C趨化因子受體1 (C-X-C chemokine receptor type 1)、C-X-C趨化因子受體3 (C-X-C chemokine receptor type 3)、Notch蛋白2和3、白細胞介素4受體(interleukin 4 receptor)、TGFβ受體1 (TGF-beta receptor type-1)、Toll樣受體1和2 (Toll-like receptor1、2)、KIT配體(KIT ligand)、血紅蛋白亞基α和β、凝血因子Ⅷ (coagulation factor VIII)、早期B細胞因子1 (EBF transcription factor 1)。

體腎中篩選到差異表達關(guān)鍵免疫基因有: 部分抗體重鏈可變區(qū)編碼基因、部分抗體輕鏈κ鏈可變區(qū)編碼基因、C-C趨化因子19和25 (C-C motif chemokine19、25)、CD9、CD10、CD13、凝血因子II和V (coagulation factor II, V)、羧肽酶B2 (carboxypeptidase B2)、補體因子D (complement factor D)、補體5和9 (complement5、9)、白細胞介素17受體C (interleukin 17 receptor C)、RIG-I、白細胞介素27 (interleukin 27)、C-X-C趨化因子14 (motif chemokine ligand 14)、非典型趨化因子受體4 (atypical chemokine receptor 4)、P2Y嘌呤受體12 (P2Y purinoceptor 12)、腫瘤壞死因子受體超家族成員16 (tumor necrosis factor receptor superfamily member 16)。

2.6 差異表達關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導通路基因分析

信號轉(zhuǎn)導通路組成基因在頭腎和體腎中呈現(xiàn)不同的表達模式, 這些通路包括PI3K-AKT信號通路、MAPK信號通路、Jak-STAT信號通路、鈣離子信號通路、Wnt信號通路、ECM信號通路、cAMP信號通路以及AMPK信號通路等。

體腎中篩選到差異表達關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導通路基因有: 囊性纖維化跨膜傳導調(diào)節(jié)蛋白(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)、整合素β6和8 (integrin beta 6、8)、Wnt9蛋白、鈣調(diào)蛋白4 (calmodulin 4)。

頭腎中篩選到差異表達基因有: TAK1、TAK1結(jié)合蛋白1 (TAK1-binding protein 1)、核因子NF-κB p105亞單位(nuclear factor NF-kappa-B p105 subunit)、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亞單位α/δ (phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha/delta)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(RAC serine/threonine-protein kinase)、肌醇1,4,5-三磷酸受體2型和3型(inositol 1,4,5-triphosphate receptor type 2、3)、絲裂原活化蛋白激酶1 (mitogen-activated protein kinase kinase kinase 1, or MAP3K1)、磷脂酰肌醇磷脂酶Cγ1 (phosphatidylinositol phospholipase C, gamma-1)、轉(zhuǎn)化生長因子β受體1型(TGF-beta receptor type-1)、轉(zhuǎn)錄共激活因子YAP1 (transcriptional coactivator YAP1)、STAT6 (signal transducer and activator of transcription 6)、叉頭框蛋白O4 (forkhead box protein O4)。

2.7 qRT-PCR驗證

為驗證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果可靠性, 采用qRT-PCR分析了4個差異表達免疫基因在頭腎和體腎中的表達(表3)。qRT-PCR獲得的結(jié)果與高通量測序結(jié)果比較表明, Toll樣受體在頭腎中上調(diào), 補體C9和C-C趨化因子19在體腎中上調(diào), 與轉(zhuǎn)錄組測序獲得的結(jié)果基本一致, 轉(zhuǎn)錄組測序獲得的基因表達譜具有可靠性。

表3 差異免疫基因轉(zhuǎn)錄組與qRT-PCR結(jié)果分析

Tab.3 Validation of differential expressed genes by qRT-PCR

3 討論

3.1 轉(zhuǎn)錄組測序分析

mRNA即信使核糖核酸, 是由一條DNA鏈為模板轉(zhuǎn)錄而來、攜帶遺傳信息并能指導蛋白質(zhì)生物合成的RNA分子。對一個物種某一組織或器官中mRNA進行全貌分析, 不僅能明了特定組織或器官中表達的基因及其功能, 還能揭示特定生物學過程中的分子機理。高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(mRNA-Seq)的出現(xiàn), 使得對特定組織、器官以及個體mRNA進行全貌分析成為可能。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序, 體腎中獲得58 197 718條有效序列, 頭腎中獲得78 436 252條有效序列, 與湖棲鰭蝦虎魚()性腺、克氏原螯蝦()肝臟等轉(zhuǎn)錄組研究中獲得的有效序列相當(江紅霞等, 2021; 董忠典等, 2021), 表明本研究獲得的測序數(shù)據(jù)能反映兩組織器官中mRNA表達譜。獲得的測序序列經(jīng)過組裝獲得轉(zhuǎn)錄本或Unigene后, 才能與已有的數(shù)據(jù)庫進行比對, 對基因功能進行注釋, 因此組裝后的轉(zhuǎn)錄本或Unigene長度越長, 注釋結(jié)果越準確。本研究中60%組裝序列長度超過2 000 bp以上, N50大于3 900 bp, 獲得的基因注釋信息能反映兩器官所表達的基因及其功能。

3.2 頭腎和體腎造血功能

魚類血細胞發(fā)生一直是研究熱點, 早在1951年, Catton就對幾種硬骨魚類血細胞發(fā)生過程中形態(tài)變化規(guī)律以及血細胞發(fā)生部位進行了研究, 證實硬骨魚頭腎和體腎具有造血功能(Catton, 1951)。研究進一步發(fā)現(xiàn), 頭腎是魚類胚胎時期的泌尿器官, 隨著個體發(fā)育失去泌尿機能, 成體時成為造血器官, 成體頭腎一般不具有腎單位; 體腎中的造血組織又稱為腎小管間造血組織(renal intertubular hematopoietic tissue), 其造血位置位于腎小管間(Milano, 1997)。黃顙魚頭腎和體腎轉(zhuǎn)錄組結(jié)果顯示造血細胞系通路相關(guān)的重要基因均在頭腎和體腎中表達, 如配體、、受體型酪氨酸蛋白激酶FLT3 ()和DNA核苷酸轉(zhuǎn)移酶()等, 表明頭腎和體腎是重要的造血器官, 與其他研究相一致(曹伏君等, 2014; 鐘愛華等, 2018)。

形態(tài)學研究發(fā)現(xiàn), 多種魚類頭腎和體腎中各種原始細胞和幼稚細胞比例并不完全一致。斑點叉尾鮰頭腎和體腎中粒細胞系(原粒細胞、早幼粒細胞、中幼粒細胞)和紅細胞系(原紅細胞、早幼紅細胞、中幼紅細胞、晚幼紅細胞)細胞比例相近、原淋巴細胞比例也接近, 但頭腎中有更多幼淋巴細胞(Fijan, 2002a, b); 達氏鱘紅細胞系細胞在頭腎中比例更高, 體腎中沒有原粒細胞(Liu, 2017); 軍曹魚體腎中有更多原紅細胞和原粒細胞(陳剛等, 2005)。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序也發(fā)現(xiàn)黃顙魚頭腎和體腎中血細胞譜系比例存在差異。KIT配體又稱干細胞因子, 是造血干細胞和造血祖細胞生存、增殖和分化的一種重要生長因子(Broudy, 1997), KIT配體在黃顙魚頭腎和體腎中均表達, 表明各類原始造血祖細胞均存在于兩器官中。人類和小鼠的KIT配體對紅細胞的正常發(fā)育至關(guān)重要, KIT配體能促使紅系爆式祖細胞BFU-E向紅系祖細胞CFU-E細胞轉(zhuǎn)變(Broudy, 1997; Antonchuk, 2004); 斑馬魚KIT配體功能研究發(fā)現(xiàn)其在紅細胞系分化發(fā)育中發(fā)揮重要作用, 斑馬魚KIT配體a是紅系祖細胞erythroid progenitors體外擴增的必須因子(Oltova, 2020); 這些研究表明KIT配體在脊椎動物中具有功能保守性。黃顙魚頭腎中KIT配體表達量顯著高于其在體腎中的表達量, 且血紅蛋白亞基α和β在頭腎中的表達量顯著高于體腎中的表達量, 表明更多紅系祖細胞在頭腎中分化形成幼稚紅細胞, 與達氏鱘形態(tài)學研究結(jié)構(gòu)相一致(Liu, 2017)。KIT配體也是誘導髓樣干細胞、粒細胞巨噬細胞系集落生成單位CFU-GEMM和淋巴干細胞增殖和分化的重要因子, KIT配體與受體結(jié)合后, 會觸發(fā)各種信號傳導級聯(lián)反應, 包括磷脂酰肌醇3激酶、MAPK、SRC和Jak-STAT信號轉(zhuǎn)導途徑, 絲裂原活化蛋白激酶1、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亞單位α/δ和STAT6基因均在黃顙魚頭腎中上調(diào), 這意味著更多的淋巴干細胞、粒系祖細胞、單核系祖細胞在頭腎中增殖和分化。早期B細胞因子1在B細胞早期分化過程中起重要作用(Lin, 1995), 其功能在動物中高度保守, 斑馬魚、鰩和小鼠中DNA結(jié)合域幾乎100%同源(Zwollo, 2011); 在哺乳動物中, 早期B細胞因子1主要存在淋巴干細胞CLPs、pro-B細胞以及部分pre-B細胞中(Hystad, 2007); 早期B細胞因子1在黃顙魚頭腎中顯著上調(diào), 頭腎中表達量是體腎中表達量的10倍以上(log2FoldChange=3.69), 表明更多的淋巴干細胞和pro-B細胞存在于黃顙魚頭腎中。

3.3 頭腎和體腎免疫功能

魚類頭腎和體腎除具有造血功能外, 還是重要的免疫器官, 魚類腎造血組織存在黑色素巨噬細胞中心, 其中有大量含色素的巨噬細胞, 這些黑色素巨噬細胞能吞噬降解體內(nèi)各種外源性和內(nèi)源性物質(zhì)以及在免疫應答中遞呈抗原(Agius, 2003; Zwollo, 2005; Abdel-Aziz, 2010)。本研究發(fā)現(xiàn), 黃顙魚頭腎和體腎中免疫信號通路相關(guān)基因的表達存在差異。頭腎中多個差異表達基因富集到Toll信號通路, 而Toll信號通路能激活NF-κB核轉(zhuǎn)錄因子, 從而導致促炎癥因子、抗炎癥細胞因子和趨化因子表達(任美玉, 2006)。Toll樣受體如同天然免疫的眼睛, 能識別各種不同的病原相關(guān)分子模式(PAMP), Toll樣受體1和2能識別多種細菌和真菌PAMP, 如脂蛋白、脂壁酸和酵母多糖。Toll樣受體1和2在黃顙魚頭腎中上調(diào), 表明黃顙魚頭腎是識別和抵抗細菌和真菌感染的重要器官。

補體是存在于脊椎動物血清蛋白質(zhì)中的一組蛋白, 攻膜復合體C5b6789n能在細胞膜上形成親水性孔道, 是補體發(fā)揮免疫功能的重要途徑。趨化因子是一類介導免疫細胞遷移的細胞因子。C-C趨化因子19和25、C-X-C 趨化因子14、補體因子D、C5和C9均在體腎中顯著上調(diào), 尤其是補體C9, 其在體腎中的表達量顯著高于頭腎(表3), 表明體腎是重要的免疫分泌器官。

4 結(jié)論

本研究對黃顙魚成體造血組織頭腎和體腎進行了RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組測序, 并對獲得的測序有效序列進行組裝、基因信息注釋和表達量分析, 頭腎中共注釋20 956個基因、體腎共注釋24 487個基因, 1 112個基因在頭腎中上調(diào), 包括、、、等; 2 737個基因在體腎中上調(diào), 包括、、、、等, 部分抗體編碼基因僅在體腎中表達; 結(jié)果表明黃顙魚頭腎和體腎在造血和免疫功能上具有差異性, 頭腎中有更多的原始造血細胞, 體腎在免疫防御中發(fā)揮重要作用。

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COMPARATIVE TRANSCRIPTOME ANALYSIS OF THE HEAD KIDNEY AND TRUNK KIDNEY IN ADULT YELLOW CATFISH ()

ZHONG Ai-Hua, DAI Xiao-Xin

(College of Fishery, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China)

The immune system of teleost is unique because the head kidney and trunk kidney are the sites for hematopoiesis and immune response. To explore the differences of hematopoiesis and immune function between head kidney and trunk kidney, the transcriptomes of head kidney and trunk kidney of yellow catfishwere sequenced through high-throughput sequencing technology. After trimming and filtering, clean reads were assembled into 59 979 transcripts with N50 value of 3 919 bp. A total of 24 487 Unigenes were annotated in five databases (GO, KEGG, NR, Pfam and Swissprot). Gene expression profile in the head kidney and trunk kidney were analyzed, and 3 949 differentially expressed genes (DEGs) were found. Among the DEGs, 1 112 genes were highly expressed in head kidney, including KIT ligand, Early B cell factor 1, Toll-like receptor 1, Toll-like receptor 2 etc. In total, 3 527 genes were highly expressed in trunk kidney, including C-C motif chemokine19, C-C motif chemokine 25, complement C5, C9, interleukin 17 receptor C, RIG-I, interleukin 27, etc. Some immune-related genes were expressed in trunk kidney only, such as encoded gene of immunoglobulin heavy chain and light chain. The results show that hematopoiesis and immune function between head and trunk kidney are different from each other. This study will help explore the immune defense mechanism of yellow catfish and other teleosts.

yellow catfish; head kidney; trunk kidney; RNA sequencing

* 浙江省“水產(chǎn)”一流學科開放課題, 11034060216號; 浙江省教育廳項目, Y202044632號。鐘愛華, E-mail: zhongpe@ zjou.edu.cn

2021-05-01,

2021-06-03

S917.4

10.11693/hyhz20210500110