香魚(Plecoglossus altivelis)CC型趨化因子受體3(CCR3)基因的分子鑒定及其對(duì)鰻弧菌感染響應(yīng)的研究*

張玲玲 余 莉 李長(zhǎng)紅 苗 亮 陳 炯

香魚()CC型趨化因子受體3(CCR3)基因的分子鑒定及其對(duì)鰻弧菌感染響應(yīng)的研究*

張玲玲1, 2余 莉2李長(zhǎng)紅1, 2①苗 亮1, 2陳 炯1, 2①

(1. 寧波大學(xué) 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 寧波 315211; 2. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室 寧波 315832)

CC趨化因子受體3 (CCR3)是CC型趨化因子的受體, 屬于G蛋白耦聯(lián)受體(GPCRs)家族成員, 與過(guò)敏等多種炎性疾病密切相關(guān)。為探討香魚CCR3 (PaCCR3)在響應(yīng)鰻弧菌感染時(shí)的表達(dá)變化, 從轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中獲得了PaCCR3基因全長(zhǎng)cDNA序列。序列分析表明, PaCCR3具有7次跨膜結(jié)構(gòu), 與胡瓜魚CCR3氨基酸序列同源性最高(84.6%)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明, 哺乳類、兩棲類和魚類CCR3單獨(dú)成簇, 魚類CCR3形成一個(gè)大簇; PaCCR3與胡瓜魚CCR3進(jìn)化相關(guān)性最高。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示, PaCCR3基因mRNA在單核/巨噬細(xì)胞(MO/MФ)中表達(dá)量最高; 鰻弧菌感染后肝、脾和頭腎中PaCCR3基因mRNA表達(dá)量顯著上調(diào); 且香魚MO/MФ經(jīng)鰻弧菌體外刺激后, PaCCR3基因mRNA的表達(dá)量顯著上調(diào)。Western blot分析表明經(jīng)鰻弧菌體外刺激后, 香魚MO/MФ中PaCCR3蛋白的表達(dá)量也顯著增加。綜上, PaCCR3基因mRNA及其編碼蛋白響應(yīng)于病原體感染而被誘導(dǎo)表達(dá)。研究結(jié)果首次揭示了香魚CCR3基因mRNA及蛋白的表達(dá)響應(yīng)于鰻弧菌侵染, 它可能通過(guò)介導(dǎo)MO/MФ的功能活性參與免疫應(yīng)答, 可為深入探究魚類CCR3的功能及作用機(jī)制提供新的切入點(diǎn)。

香魚(); CCR3; 單核/巨噬細(xì)胞; 鰻弧菌; 表達(dá)分析

CC型趨化因子受體3 (CC chemokine receptor 3, CCR3)是CC型趨化因子的受體, 屬于G蛋白耦聯(lián)受體(G protein-coupled receptor, GPCR)家族成員。最早研究發(fā)現(xiàn), CCR3選擇性地在人嗜酸性粒細(xì)胞上表達(dá), 并且嗜酸細(xì)胞活化趨化因子(eotaxin)是CCR3高特異性的拮抗劑(Kitaura, 1996)。隨著研究的深入, CCR3被發(fā)現(xiàn)在嗜堿性粒細(xì)胞上也高表達(dá)(Uguccioni, 1997), 而且樹突狀細(xì)胞(dentric cells, DC) (Rubbert, 1998)、小角質(zhì)細(xì)胞(microglia) (He, 1997; Ghorpade, 1998)、單核細(xì)胞(monocytes, MO) (Ghorpade, 1998; Rubbert, 1998)、巨噬細(xì)胞(macrophages, MФ) (Rubbert, 1998)和CD4+T細(xì)胞(Rubbert, 1998)上也有表達(dá)。CCR3有許多CC型趨化因子配體, 包括CCL5 (C-C motif chemokine 5)、CCL7 (C-C motif chemokine 7)、CCL8 (C-C motif chemokine 8)、CCL11/eotaxin-1 (C-C motif chemokine 11)、CCL13 (C-C motif chemokine 13)、CCL15 (C-C motif chemokine 15)、CCL24/eotaxin-2 (C-C motif chemokine 24)和CCL26/eotaxin-3 (C-C motif chemokine 26) (Forssmann, 1997; Kitaura, 1999; Wang, 2013; Palomino, 2015)。其中, CCR3是CCL11的唯一受體。CCR3通過(guò)與這些配體結(jié)合, 在過(guò)敏性疾病中發(fā)揮重要作用(Wang, 2013; Zhu, 2017)。在過(guò)敏性炎癥反應(yīng)中, 特征效應(yīng)細(xì)胞嗜酸性和嗜堿性粒細(xì)胞主要依賴于其上的CCR3向不同的趨化因子遷移進(jìn)入到炎癥組織中(Uguccioni, 1997)。因此, 研究者認(rèn)為采用抑制劑或者CCR3抗體直接抑制CCR3可能作為一種新的途徑來(lái)抑制過(guò)敏性炎癥中效應(yīng)細(xì)胞嗜酸性和嗜堿性粒細(xì)胞聚集(Uguccioni, 1997; Zhu, 2017; Grozdanovic, 2019)。在獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)研究中, 研究者發(fā)現(xiàn), 腦部小角質(zhì)細(xì)胞上的CCR3能與CCR5協(xié)同作用作為促進(jìn)HIV-1感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)(He, 1997), 并且單核細(xì)胞來(lái)源的樹突狀細(xì)胞(monocyte-derived DC, MDDC)上的CCR3也可能作為協(xié)同受體與CCR5和CCR2b等促進(jìn)HIV-1進(jìn)入MDDC (Rubbert, 1998)。

香魚(,ayu), 又名鲇魚、油香魚、仙胎魚、年魚, 是包括中國(guó)和日本等國(guó)在內(nèi)的東亞地區(qū)特有的小型經(jīng)濟(jì)名貴魚類。由于它體形優(yōu)美、肉質(zhì)鮮美, 有清香味, 經(jīng)濟(jì)價(jià)值頗高, 在我國(guó)的規(guī)模化人工養(yǎng)殖日益擴(kuò)大。然而, 隨著池塘養(yǎng)殖密度及飼料投飼頻率增加等原因?qū)е鲁靥了w污染嚴(yán)重, 使得香魚養(yǎng)殖病害頻發(fā), 給養(yǎng)殖戶帶來(lái)極大的經(jīng)濟(jì)損失(李長(zhǎng)紅等, 2009)。香魚以生態(tài)健康養(yǎng)殖出名, 養(yǎng)殖中抗生素等傳統(tǒng)治療方法易產(chǎn)生藥殘和耐藥而受到諸多限制。近年來(lái), 對(duì)硬骨魚類免疫機(jī)制進(jìn)行研究, 已成為水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物研究的熱點(diǎn)之一, 可為有效防治各類病害及選育抗病品種奠定理論基礎(chǔ)。鑒于CCR3在動(dòng)物免疫應(yīng)答中的重要作用, 本研究從單核/巨噬細(xì)胞(monocytes/macrophages, MO/MФ)轉(zhuǎn)錄組中獲得香魚CCR3 (PaCCR3)基因cDNA序列, 擬分析其分子特征、進(jìn)化關(guān)系及組織分布, 解析其在鰻弧菌感染后的香魚重要免疫組織及在鰻弧菌體外刺激的MO/MФ中mRNA的表達(dá)變化; 化學(xué)合成PaCCR3胞外多肽并免疫新西蘭大白兔制備抗血清, 分析香魚MO/MФ經(jīng)鰻弧菌感染后PaCCR3蛋白的表達(dá)變化。研究結(jié)果不僅豐富了魚類免疫學(xué)知識(shí), 也為深入探討魚類趨化因子受體在防御病原感染時(shí)發(fā)揮的功能提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

體重約20—30 g的健康香魚, 購(gòu)自浙江省寧海縣鳧溪陳家香魚養(yǎng)殖場(chǎng)。新西蘭大白兔購(gòu)自寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。鰻弧菌ayu-H080701 (李長(zhǎng)紅等, 2009)和大腸桿菌() TOP10菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存。RNAiso試劑、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、Ex Taq DNA聚合酶、Mighty TA-cloning Kit和TB GreenTMTM(Tli RNaseH Plus)等購(gòu)自大連TaKaRa公司。RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、顯影定影試劑盒、兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶單克隆抗體(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase rabbit monoclonal antibody, anti-GAPDH)和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L) [(HRP-labeled goat anti-rabbit IgG (H+L), HRP-IgG)等購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。Ficoll-PaqueTMPREMIUM購(gòu)瑞典GE Healthcare公司, RPMI 1640購(gòu)自美國(guó)Life Technology公司, 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購(gòu)自阿根廷Natocor-Industria Biológica公司。預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司。引物合成及序列測(cè)序工作由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。多肽由合肥國(guó)肽生物科技有限公司合成。

1.2 PaCCR3基因cDNA序列獲得及序列分析

從香魚MO/MФ轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中(Lu, 2013)獲得PaCCR3基因cDNA序列, 進(jìn)行PCR擴(kuò)增、TA克隆后送公司測(cè)序驗(yàn)證。PaCCR3基因ORF預(yù)測(cè)采用DNAstar 5.0軟件進(jìn)行, 氨基酸序列跨膜區(qū)預(yù)測(cè)運(yùn)用TMHMM Server v. 2.0和SMART在線軟件, 多重序列比對(duì)運(yùn)用ClustalW在線軟件, 二硫鍵預(yù)測(cè)運(yùn)用ScanProsite軟件預(yù)測(cè), 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建采用MEGA 6.0軟件(Tamura, 2013)。本研究用到的CCR3序列信息列于表1中。

1.3 健康香魚及鰻弧菌感染香魚的組織樣品采集

從健康香魚尾靜脈抽取血液后, 取肝、脾、體腎、腦、心、鰓、肌肉、腸、皮膚和頭腎10個(gè)組織, 立即液氮速凍后轉(zhuǎn)至–70 °C超低溫冰箱保存。鰻弧菌腹腔注射香魚的操作步驟參考楊智景等(2015)的方法, 將健康香魚分為感染組和對(duì)照組, 感染組每尾香魚腹腔注射100 μL (1.0×105CFU)的鰻弧菌懸液, 對(duì)照組每尾香魚按照同樣方式注射100 μL的無(wú)菌PBS。注射后兩組香魚分別于4、8、12和24 h時(shí)取肝、脾和頭腎等組織, 取樣及保存方法同健康香魚。

表1 本研究用到的CCR3序列信息

Tab.1 The CCR3 sequences used in this study

注: CCR3l代表CCR3 like

1.4 香魚頭腎來(lái)源的MO/MФ分離及體外培養(yǎng)

用75%乙醇消毒香魚體表, 在無(wú)菌條件下迅速取頭腎, 放于裝有RPMI1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中, 然后轉(zhuǎn)到篩網(wǎng)中, 邊研磨邊加入RPMI1640培養(yǎng)基以獲得單細(xì)胞懸液, 將細(xì)胞懸液輕加于Ficoll-Paque液上方后離心(2 000 r/min, 25 min), 吸取含MO/MФ的白膜層, 用含2% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基離心洗滌2次, 最后將細(xì)胞沉淀重懸于含2% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中。取適量細(xì)胞懸液用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后, 制備成107cells/mL細(xì)胞懸液, 均勻鋪在直徑為35 mm的培養(yǎng)皿中, 過(guò)夜培養(yǎng)(24 °C, 5% CO2)后, 吸走非貼壁細(xì)胞后加入新鮮培養(yǎng)基(含10% FBS)后繼續(xù)培養(yǎng)。取適量細(xì)胞用瑞氏-吉姆薩染色液染色后光鏡下觀察, 確定95%以上的細(xì)胞是MO/MФ后再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 鰻弧菌感染的香魚MO/MФ樣品制備

鰻弧菌過(guò)夜培養(yǎng)后用無(wú)菌PBS洗滌數(shù)次后制備成細(xì)菌懸液, 按照感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)=10的比例感染香魚MO/MФ, 于4、8、12和24 h時(shí), 用PBS洗滌3次, 吸凈PBS, 加入適量RIPA裂解液(PMSF 1 mmol/L), 用槍吹打數(shù)下, 待細(xì)胞充分裂解后, 13 000離心3 min, 取上清保存于–70 °C超低溫冰箱備用。

1.6 qRT-PCR檢測(cè)

組織及MO/MФ總RNA的抽提、第一鏈cDNA的合成及qRT-PCR檢測(cè)參考以往的方法進(jìn)行(Ren, 2019)。根據(jù)PaCCR3基因cDNA序列設(shè)計(jì)檢測(cè)引物, PaCCR3test (-): 5′-ACGATTGT TCCGAAGCTTT GG-3′和PaCCR3 test (+): 5′-GCGTTTGGACATCAGC TTGA -3′, 預(yù)期擴(kuò)增大小140 bp; 選擇香魚18S rRNA (Pa18S rRNA)基因作為內(nèi)參, 根據(jù)其cDNA序列(FN646593)設(shè)計(jì)引物Pa18S rRNA (+): 5′-GAATGTCTGCCCTATCAACT-3′和Pa18S rRNA (-): 5′-GATGTGGTAGCCGTTTCT-3′, 預(yù)期擴(kuò)增大小為103 bp。qRT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)在ABI StepOne熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)上進(jìn)行, 每個(gè)樣品重復(fù)3次。采用儀器自帶程序讀取每個(gè)樣品目的基因和內(nèi)參基因的循環(huán)閾值(cycle threshold, Ct)。根據(jù)2–ΔΔCt法計(jì)算PaCCR3基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量(Livak, 2001)。

1.7 PaCCR3 N端胞外段多克隆抗體制備及檢測(cè)

將PaCCR3 N端胞外段43個(gè)氨基酸(MDTDEDYDLFLELFNESSNDSTYVTNELVTLCVKADVNKFGAT)合成多肽, 并偶聯(lián)鑰孔血藍(lán)蛋白(keyhole limpet hemocyanin, KLH), 用于免疫新西蘭大白兔。經(jīng)過(guò)3次加強(qiáng)免疫后收集兔抗血清, Western blot檢測(cè)特異性。

1.8 Western blot檢測(cè)

采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒對(duì)香魚MO/MФ裂解液進(jìn)行蛋白定量, 采用Western blot檢測(cè)鰻弧菌感染下香魚MO/MФ中PaCCR3的表達(dá)變化。香魚MO/MФ總蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后, 濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上。5%脫脂奶粉在37 °C封閉2 h, 加入兔源PaCCR3抗血清(1:500), 37 °C孵育2 h, PBS-T洗滌數(shù)次后加入HRP-IgG (1:5000)在37 °C孵育1 h, PBS-T洗滌數(shù)次。香魚MO/MФ中PaGAPDH的表達(dá)檢測(cè)用兔源anti-GAPDH為一抗, 稀釋倍數(shù)為1:2000。采用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色, 暗室內(nèi)進(jìn)行壓片、顯影和定影。膠片掃描后采用Gel-Pro analyzer 4凝膠定量分析軟件進(jìn)行灰度值分析。

2 結(jié)果

2.1 PaCCR3基因cDNA序列分析

PaCCR3基因cDNA全長(zhǎng)1 624 bp (GenBank登錄號(hào): MZ028605), 包括一個(gè)長(zhǎng)度為1 071 bp的完整開放閱讀框, 編碼356個(gè)氨基酸, 預(yù)測(cè)蛋白分子量大小為41.28 kDa, 等電點(diǎn)為8.37。

SMART和TMHMM軟件分析結(jié)果表明, PaCCR3為7次跨膜受體(TM1-TM7), 由位于細(xì)胞膜外的N末端(N-terminus)和3個(gè)膜外環(huán)以及位于胞內(nèi)的C末端(C-terminus)和3個(gè)膜內(nèi)環(huán)組成(圖1)。ScanProsite軟件預(yù)測(cè)結(jié)果表明, PaCCR3具有G蛋白耦聯(lián)受體(G-protein coupled receptors, GPCRs)家族1的特征基序——SSILFLTLMTFDRYLAV, 并且膜外環(huán)上包含有2個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基, 可通過(guò)形成一個(gè)二硫鍵(Cys113-Cys191)穩(wěn)定受體的空間結(jié)構(gòu)(圖1)。因此, PaCCR3屬于GPCRs家族成員。

2.2 PaCCR3基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

多序列分析顯示, PaCCR3與其他魚類CCR3氨基酸序列同源性為34.5%—84.6%, 與胡瓜魚() CCR3有最高的同源性。根據(jù)哺乳類、兩棲類和魚類CCR3的氨基酸全序列構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹, 結(jié)果顯示, 哺乳類、兩棲類和魚類CCR3各自成簇, 魚類CCR3形成一個(gè)大簇, 香魚與胡瓜魚的CCR3獨(dú)立成簇, 且與胡瓜魚CCR3的進(jìn)化相關(guān)性最高(圖2)。

2.3 PaCCR3基因mRNA在鰻弧菌感染前后的表達(dá)變化

采用qRT-PCR檢測(cè)健康香魚的肝、體腎、頭腎、脾、腦、心、鰓、腸、肌肉、皮膚及MO/MФ中PaCCR3基因mRNA的表達(dá)分布, 結(jié)果表明, 其在MO/MФ中的表達(dá)豐度最高, 其次是體腎(圖3a)。香魚進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理后, 對(duì)照組香魚無(wú)明顯異常, 處理組香魚出現(xiàn)典型的弧菌病發(fā)病特征, 并能從腹腔液及主要臟器中分離培養(yǎng)出鰻弧菌。鰻弧菌感染后, 與對(duì)照組相比, 肝、脾和頭腎中PaCCR3基因mRNA的表達(dá)量顯著增加, 分別為對(duì)照組的6.74、30.81和14.30倍(<0.05); 此后, 3個(gè)組織中PaCCR3基因mRNA的表達(dá)量均開始下降, 頭腎中PaCCR3基因mRNA表達(dá)量直到24 h時(shí)仍顯著高于對(duì)照組(<0.05), 脾中PaCCR3基因mRNA表達(dá)量在12 h時(shí)與對(duì)照組無(wú)明顯差異, 肝中PaCCR3基因mRNA表達(dá)量在8 h時(shí)已與對(duì)照組無(wú)明顯差異(圖3b, 3c, 3d)。

圖1 香魚與部分魚類CCR3氨基酸序列的多重比對(duì)

注: TM1—TM7: 7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域, “▼”: 胞外環(huán)上2個(gè)保守的半胱氨酸殘基。相似度>60%, 灰色陰影: 部分相同的氨基酸, 黑色陰影: 完全相同的氨基酸。Pa: 香魚(); Om: 胡瓜魚(); Oy: 虹鱒(); Ss: 大西洋鮭(); Lc: 大黃魚(); Mm: 鮸魚()

2.4 PaCCR3抗血清制備及檢測(cè)

Western blot分析顯示, 所制備的PaCCR3抗血清能與香魚MO/MФ上的PaCCR3雜交, 目的條帶大小約為42 kDa與預(yù)測(cè)的PaCCR3蛋白分子量大小(41.28 kDa)基本一致, 且特異性較好(圖4)。因此, 該抗體可用于后續(xù)檢測(cè)在鰻弧菌感染下香魚MO/MФ上PaCCR3的表達(dá)變化。

圖2 基于香魚和其他動(dòng)物CCR3全長(zhǎng)氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(鄰接法)

注: 分枝上的數(shù)值表示用bootstrap (1000次)做置信檢測(cè)得到的置信度百分比, 低于60%的數(shù)值不顯示; 標(biāo)尺長(zhǎng)度表示每個(gè)位點(diǎn)發(fā)生0.1次置換

圖3 鰻弧菌感染后香魚免疫組織中PaCCR3基因mRNA的表達(dá)變化

注: a. PaCCR3基因mRNA在健康香魚不同組織中的表達(dá); b—d. PaCCR3基因mRNA在鰻弧菌感染香魚免疫組織中的表達(dá)。以Pa18S rRNA基因作為內(nèi)參, *: 處理組PaCCR3基因的表達(dá)與對(duì)照組相比差異顯著(<0.05) (=4)

圖4 Western blot檢測(cè)PaCCR3抗血清的特異性

注: 1. 空白對(duì)照; 2. 香魚MO/MФ總蛋白

2.5 鰻弧菌處理前后香魚MO/MФ PaCCR3基因mRNA表達(dá)的變化

qRT-PCR結(jié)果表明, 香魚MO/MФ經(jīng)鰻弧菌體外處理后, PaCCR3基因mRNA的表達(dá)量在4 h時(shí)開始增加, 在12 h和24 h時(shí)增加顯著, 分別為對(duì)照組的2.01倍和2.42倍(<0.05) (圖5)。

圖5 鰻弧菌處理前后香魚MO/MФ中PaCCR3基因mRNA的表達(dá)變化

注: 以Pa18S rRNA基因作為內(nèi)參, *: 處理組PaCCR3基因的表達(dá)與對(duì)照組比較差異顯著(<0.05) (=4)

2.6 鰻弧菌感染前后香魚MO/MФ上PaCCR3蛋白的表達(dá)變化

在確認(rèn)制備的兔源PaCCR3抗血清特異性后, 采用Western blot檢測(cè)了香魚MO/MФ中PaCCR3蛋白在鰻弧菌刺激下的表達(dá)變化。結(jié)果顯示, 香魚MO/MФ中PaCCR3的表達(dá)在鰻弧菌刺激下被誘導(dǎo), 與其mRNA表達(dá)的變化趨勢(shì)相似, 在4 h時(shí)略微增加, 在12 h和24 h時(shí)增加顯著, 分別為對(duì)照組的2.15和2.09倍(<0.05) (圖6)。

圖6 鰻弧菌刺激前后香魚MO/MФ上PaCCR3蛋白的表達(dá)變化

注: a. 不同感染時(shí)間香魚MO/MФ上PaCCR3和PaGAPDH的蛋白條帶; b. PaCCR3蛋白的相對(duì)表達(dá)表達(dá)量。*: 與對(duì)照組相比差異顯著(<0.05) (=3)

3 討論

CCR3是CC型趨化因子的受體, 屬于GPCRs家族成員, 與過(guò)敏等多種炎性疾病密切相關(guān)。本文從香魚MO/MФ轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中獲得PaCCR3基因cDNA序列。序列分析揭示, PaCCR3氨基酸序列與其他魚類CCR3具有GPCR的典型特征, 均具有7次跨膜結(jié)構(gòu)。PaCCR3與胡瓜魚CCR3氨基酸序列同源性最高, 為84.6%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明, 魚類CCR3獨(dú)立成簇, 香魚與胡瓜魚CCR3進(jìn)化相關(guān)性最高。

表達(dá)特征分析表明, PaCCR3基因在健康香魚被檢組織中廣泛表達(dá), 且在體腎、脾和頭腎的表達(dá)量較為豐富, 這與已報(bào)道的斑馬魚CCR3-1和CCR3-2基因及大菱鲆CCR3基因mRNA表達(dá)較為一致(Liu, 2009; 孟艷青等, 2013), 但與斑馬魚CCR3-3及鮸魚CCR3基因的表達(dá)分布有較大差異。鮸魚CCR3基因在鰓和心中表達(dá)量較為豐富(Zhu, 2013), 斑馬魚CCR3-3基因在脾、腦、體腎、肝、鰓和腸組織中均未檢測(cè)到(Liu, 2009)。由于Liu等在測(cè)定斑馬魚CCR3-1、CCR3-2和CCR3-3基因在脾、腦、腎、肝、鰓和腸6個(gè)組織中的表達(dá)時(shí)采用了半定量RT-PCR技術(shù), 我們推測(cè)可能由于該技術(shù)檢測(cè)靈敏度有限, 導(dǎo)致未能在斑馬魚上述6個(gè)組織中檢測(cè)到CCR3-3基因的表達(dá)。CCR3基因在硬骨魚類中呈現(xiàn)不同的表達(dá)譜, 揭示其可能在不同組織中參與不同的生物學(xué)過(guò)程。

盡管CCR3選擇性地在人嗜酸性粒細(xì)胞上表達(dá), 但它在包括MO和MФ在內(nèi)的其他免疫細(xì)胞上也有分布(Kitaura, 1996; Ghorpade, 1998; Rubbert, 1998)。頭腎是硬骨魚類特有的、重要的造血組織和免疫器官, 其中含有豐富的MO和MФ, 在魚類的天然免疫中發(fā)揮著重要作用(Geven, 2017)。因此, 我們從香魚頭腎中分離了MO/MФ, 首先測(cè)定了PaCCR3基因mRNA在未刺激的MO/MФ上的分布情況, 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 該基因在MO/MФ上表達(dá)量非常豐富, 高于它在體腎、脾和頭腎3個(gè)組織中的表達(dá)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn), 鰻弧菌刺激不僅誘導(dǎo)了PaCCR3基因mRNA的表達(dá), 也誘導(dǎo)了其蛋白的表達(dá), 二者變化趨勢(shì)相似。我們的研究揭示, CCR3在魚類MO/MФ上表達(dá)豐富, 可能參與調(diào)控MO/MФ的趨化及其他功能活性。

4 結(jié)論

本研究鑒定了香魚CCR3基因cDNA序列, 序列分析揭示其氨基酸序列與胡瓜魚CCR3最相似。健康香魚中, PaCCR3基因mRNA在MO/MФ中表達(dá)量最高, 高于體腎、脾和頭腎等組織; 鰻弧菌感染香魚后, 其在肝、脾和頭腎中的表達(dá)被誘導(dǎo)。頭腎來(lái)源的MO/MФ經(jīng)鰻弧菌體外刺激后PaCCR3基因mRNA及蛋白表達(dá)量均顯著增加。研究結(jié)果首次揭示了香魚CCR3基因mRNA及蛋白的表達(dá)響應(yīng)于鰻弧菌侵染, 它可能通過(guò)介導(dǎo)MO/MФ的功能活性參與免疫應(yīng)答, 為深入探究魚類CCR3的功能及作用機(jī)制提供了新的切入點(diǎn)。

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MOLECULAR IDENTIFICATION OF CC MOTIF CHEMOKINE RECEPTOR 3 (CCR3) GENE AND ITS RESPONSE TOINFECTION IN AYU

ZHANG Ling-Ling1, 2, YU Li2, LI Chang-Hong1, 2, MIAO Liang1, 2, CHEN Jiong1, 2

(1. State Key Laboratory for Managing Biotic and Chemical Threats to the Quality and Safety of Agroproducts, Ningbo University, Ningbo 315211, China; 2. Laboratory of Biochemistry and Molecular Biology, School of Marine Science, Ningbo University, Ningbo 315832, China)

The CC chemokine receptor 3 (CCR3), a kind of CC motif chemokine receptor, belongs to the family of G protein-coupled receptors (GPCRs). CCR3 is closely associated with various inflammatory diseases such as allergies. In order to explore the expression changes of ayu () CCR3 (PaCCR3) in response toinfection, the full-length cDNA sequence of PaCCR3 gene was obtained from ayu monocytes/macrophages (MO/MФ) transcriptome sequencing data. Sequence analysis showed that PaCCR3 had a seven-pass transmembrane domain, and had the highest amino acid sequence homology with the CCR3 of rainbow smelt () (84.6%). Phylogenetic tree analysis showed that mammals, amphibians and fish CCR3 clustered separately, and fish CCR3 formed a large cluster. PaCCR3 had the highest evolutionary correlation with that of rainbow smelt. Real-time quantitative PCR (qRT-PCR) analysis showed that the highest mRNA expression of PaCCR3 gene was observed in the MO/MФ from healthy ayu. The expression in liver, spleen and head kidney significantly up-regulated afterinfection. Moreover, the mRNA expression of PaCCR3 was significantly up-regulated in ayu MO/MФ stimulated by. The N-terminal extracellular peptide fragment of PaCCR3 was chemically synthesized, and its antiserum was obtained by immunizing New Zealand white rabbits. The Western blot analysis showed that the protein expression of PaCCR3 in ayu MO/MФ also increased significantly afterinfection. Therefore, the mRNA and protein expression of PaCCR3 gene could be induced in response to pathogen infection. This study revealed for the first time that the mRNA and protein expression of PaCCR3 in response toinfection, and PaCCR3 may participate in the immune response by mediating the functional activity of MO/MФ, which can provide a new entry point for in-depth exploration of the function and mechanism of fish CCR3.Key words; CCR3; monocyte/macrophage (MO/MФ);; expression analysis

* 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目, 31972821號(hào); 浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目, LY21C190003號(hào); 寧波大學(xué)研究生科研創(chuàng)新基金項(xiàng)目, IF2020138號(hào); 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自主設(shè)計(jì)課題, 2010DS700124-ZZ2008號(hào)。張玲玲, 碩士研究生, E-mail: linglingzhangwork@163.com

李長(zhǎng)紅, 碩士生導(dǎo)師, 副教授, E-mail: lichanghong0716@163.com; 陳 炯, 博士生導(dǎo)師, 研究員, E-mail: jchen1975@163.com

2021-05-17,

2021-06-20

Q786; S917

10.11693/hyhz20210500118