基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的水蛭-蜈蚣藥對治療糖尿病性勃起功能障礙的作用機制研究

王旭昀 胡志偉 蔣子康 胡金濤

1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院男科，北京 100010；2.遼寧省大連市中醫(yī)醫(yī)院康復(fù)科，遼寧大連 116013；3.廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)系，福建廈門 361102；4.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院兒科，北京 100070

勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED）是指因多種原因造成的陰莖海綿體血液充盈不足，不能完成性交，是糖尿病（diabetes mellitus，DM）常見的并發(fā)癥之一，發(fā)病率較高[1]。男性DM 患者發(fā)生ED 的病因復(fù)雜，包括血管、平滑肌及神經(jīng)功能受損等。中醫(yī)學(xué)則認(rèn)為血瘀是糖尿病性勃起功能障礙（diabetic erectile dysfunction，DED）的重要病因病機之一，在臨床上采用活血法治療該病獲得了一定的臨床效果[2]。水蛭-蜈蚣藥對是治療DED 的主要活血藥物組合，效果確切，然其作用機制并不明確[3]。因此，本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對水蛭-蜈蚣藥對治療DED 的靶標(biāo)進(jìn)行篩選，以期揭示活血法治療DED 的機制。

1 資料與方法

1.1 水蛭-蜈蚣藥對有效成分與潛在靶點篩選

通過中國知網(wǎng)查閱2017 年1 月1 日至2020 年2 月10 日的相關(guān)文獻(xiàn)[4-22]獲得水蛭-蜈蚣藥對的成分，查詢并閱覽PubChem 數(shù)據(jù)庫得到這些成分的分子結(jié)構(gòu)式，輸進(jìn)Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫得到成分所對應(yīng)的靶點，過濾無效成分及靶點。

1.2 水蛭-蜈蚣藥對藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用UIbot Creator 軟件對成分重新編碼后，匯總2 種藥物的成分與靶點，構(gòu)建藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，使用Cytoscape 3.8 軟件繪圖并分析，可得各個要素的degree 值。

1.3 DM-ED 靶點的收集及藥物-疾病共同靶點的篩選

以“erectile dysfunction”“diaBetes”為關(guān)鍵詞，錄入Genecards、OMIM、DrugBank 等數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站查詢靶點，獲取與DM-ED 相關(guān)靶點后去重，使用Python 3.7 的Matplotlib-venn 庫繪制維恩圖，并獲得該藥對與DMED的交集靶點。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將水蛭-蜈蚣藥對、ED 的相同靶點使用STRING數(shù)據(jù)庫的應(yīng)用程序接口構(gòu)建上述交集靶點的網(wǎng)絡(luò)（置信度＞0.4），使用Cytoscape 3.8 軟件分析并繪圖，依據(jù)度中心度（degree centrality，DC）、中介中心度（betweeness centrality，BC）、接近中心度（closeness centrality，CC）及鄰里連通性（neighborhood connectivity，NC）四值大于等于中位數(shù)，進(jìn)一步篩選核心靶點。

1.5 獲得核心成分并構(gòu)建、繪制核心成分-核心靶點網(wǎng)絡(luò)

核心靶點所對應(yīng)的成分即為核心成分，使用UIbot Creator 查出核心成分，構(gòu)建核心成分-核心靶點網(wǎng)絡(luò)并使用Cytoscape 3.8 軟件進(jìn)行繪圖分析。

1.6 基因本體（gene ontology，GO）富集分析和京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析

Metascape 數(shù)據(jù)平臺對核心靶點進(jìn)行分析，如GO富集分析可獲得水蛭-蜈蚣藥對治療DED 潛在的分子功能、細(xì)胞組分、生物學(xué)過程的GO 條目；KEGG 富集分析可獲得水蛭-蜈蚣藥對治療DED 最有可能調(diào)控的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

2 結(jié)果

2.1 水蛭-蜈蚣藥對的有效成分與潛在靶點篩選

根據(jù)設(shè)定的條件篩選出2 味藥物有效成分47 個、靶點534 個。每味中藥的成分?jǐn)?shù)量如下：水蛭15 個、蜈蚣39 個、共有成分7 個。將degree 值＞30 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，水蛭-蜈蚣藥對主要有效成分見表1。以拼音首字母為編碼標(biāo)準(zhǔn)，水蛭成分編號為SZ1～SZ15，蜈蚣成分編號為WG1～WG39，共有成分編號為GY1～GY7。

表1 水蛭-蜈蚣藥對主要有效成分基本信息

2.2 水蛭-蜈蚣藥對的藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

用Cytoscape 3.8 繪制水蛭-蜈蚣藥對“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)包含584 個節(jié)點、1552 條邊（圖1）。

圖1 水蛭-蜈蚣藥對成分靶點-網(wǎng)絡(luò)

2.3 DM-ED 靶點的收集及藥物-疾病共同靶點的篩選

在DrugBank 數(shù)據(jù)庫獲得ED 靶點650 個和DM靶點650 個，在OMIM 數(shù)據(jù)庫獲得ED 靶點109 個和DM 靶點123 個，去重后獲得ED 靶點743 個和DM 靶點736 個。水蛭-蜈蚣藥對與ED 和DM 的相交靶點為32 個。繪制維恩圖見圖2。

圖2 水蛭-蜈蚣藥對與糖尿病、勃起功能障礙靶點

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)如圖3 所示，以DC≥3、BC≥0.039、CC≥0.4、NC≥4.5 為條件，篩選得出水蛭-蜈蚣藥對與ED 和DM 的3 個核心靶點。

圖3 水蛭-蜈蚣藥對與糖尿病、勃起功能障礙核心靶點蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.5 “核心成分-核心靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

“核心成分-核心靶點”網(wǎng)絡(luò)如圖4 所示，網(wǎng)絡(luò)分析可見表2。

表2 藥物活性成分-核心靶點網(wǎng)絡(luò)分析（degree 值>2）

圖4 核心成分-核心靶點網(wǎng)絡(luò)

2.6 GO 與KEGG 富集分析

通過GO 富集分析共獲得18 個GO 條目，其中有生物學(xué)過程14 個，包括細(xì)胞內(nèi)雌激素受體、細(xì)胞內(nèi)類固醇激素受體、類固醇激素介導(dǎo)等；分子功能4 個，包括核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、直接的配體調(diào)節(jié)序列特異性DNA 結(jié)合等；未獲得細(xì)胞組分相關(guān)條目。KEGG 分析結(jié)果獲得僅1 條通路，即癌癥通路。

3 討論

《本草綱目》認(rèn)為水蛭能夠破血逐瘀、通經(jīng)，為破血逐瘀之猛劑[23]。現(xiàn)代藥理學(xué)認(rèn)為水蛭能阻止凝血酶對纖維蛋白原的作用，阻礙血液凝固；蜈蚣具有走竄之性，尤善于化瘀通絡(luò)，能夠深入邪氣結(jié)聚之處，使得瘀血去，新血生，現(xiàn)代藥理研究表明蜈蚣具有擴張血管的作用。血瘀是導(dǎo)致DED 的主要病機，水蛭-蜈蚣二者合用共奏活血通絡(luò)起痿之效，故可用來治療DED[24-25]。在臨床上二藥配伍應(yīng)用取得了一定的效果，然其作用機制并不明確，限制了其進(jìn)一步的開發(fā)應(yīng)用，探討其臨床作用機制已成為目前臨床的熱點之一。

基于以上現(xiàn)狀，本研究查閱相關(guān)文獻(xiàn)共篩選出47 個水蛭-蜈蚣藥對的主要有效成分，包括膽固醇、亞麻酸、菜油甾醇、亞油酸等。根據(jù)PPI 網(wǎng)絡(luò)得到3 個核心靶點，主要包括AR（androgen receptor）、ESR1（Estrogen receptor alpha）、ESR2（Estrogen receptor beta），因此該藥對可能作用于這3 個靶點恢復(fù)DED 患者的勃起功能，從而達(dá)到治療DED 的目的。今后關(guān)于水蛭-蜈蚣藥對治療DED 的基礎(chǔ)研究可圍繞上述關(guān)鍵點開展，以進(jìn)一步探討其作用機制所在。這對臨床改善DED 的治療效果提供用藥指導(dǎo)、開發(fā)治療DED 的新型藥物提供藥理學(xué)基礎(chǔ)具有一定的意義。