參苓白術(shù)丸對原發(fā)性高膽固醇血癥豚鼠模型的影響

張雨田 王 紅 屈子怡 楊朝帥 馮彬彬 王悅豪

1.天津中醫(yī)藥大學研究生院，天津 300000；2.天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院普通外科，天津 300000

2018 年我國心血管疾病死亡率居首位，占居民疾病死亡構(gòu)成的40%以上[1]。而高膽固醇血癥是引起動脈粥樣硬化最重要的危險因素[2]。雖然目前他汀類、PCSK9、依折麥布等已被廣泛應用于臨床，但仍存在一些不足[3]。因此需要不斷探索來發(fā)現(xiàn)新的、實用且有效的藥物來治療高膽固醇血癥。近年來有學者認為痰濕體質(zhì)與高膽固醇血癥等代謝性慢性病的發(fā)生具有密切的關(guān)系[4-5]，脾氣健運才能將津液吸收、傳輸?shù)饺砀髋K腑。脾不健運則津液失于輸布，釀濕為痰，痰濕造成氣血運行受阻，進而化生血濁，阻滯于脈道。本研究選取治療健脾祛濕的代表藥物參苓白術(shù)丸作為實驗藥物，以高脂飲食建立原發(fā)性高膽固醇血癥豚鼠模型，旨在觀察參苓白術(shù)丸對高膽固醇血癥豚鼠模型的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

普通級Hartley 豚鼠，雄性，80～90 d，體重250～300 g，由北京隆安實驗動物養(yǎng)殖中心提供[動物生產(chǎn)許可證編碼：SCXK（京）2014-0003]。實驗動物自由飲水、進食。高脂飼料（10.0%豬油，0.5%膽固醇，89.5%基礎飼料）及普通飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供[許可證號：SCXK（京）2014-0010]。實驗過程遵循天津醫(yī)藥研究院和國家有關(guān)實驗動物保護與使用的準則，并經(jīng)天津醫(yī)藥研究院實驗動物倫理委員會批準。

1.2 藥物

參苓白術(shù)丸（天津中新藥業(yè)集團股份有限公司樂仁堂制藥廠，批號：B094067，規(guī)格：6 g/100 粒）；依折麥布片[MSD Pharma（Singapore）Pte Ltd，批號：ZEZPA16001，規(guī)格：10 mg/片]。

1.3 試劑與儀器

血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）測定試劑盒[積水醫(yī)療科技（中國）有限公司，批號：822RBO、826RCO、824RLN、823RAO]；總膽汁酸測定試劑盒及蛋白定量測試盒[南京建成生物工程研究所，批號：E003-2]；尼曼-匹克C1 型類蛋白1（Niemann-Pick C1 like 1，NPC1L1）、三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體G5（ATP binding cassette transport G5，ABCG5）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；肝臟X 受體α（liver X receptor α，LXRα）、膽固醇?；D(zhuǎn)移酶2（acyl-CoA cholesterol acyltransferase 2，ACAT2）測定試劑盒（上海藍基生物科技有限公司，批號：E02A0863、E02A0677）。

KHB ST-360 型酶標儀（上?？迫A生物工程股份有限公司）；日本OLYMPUS 公司BX53 型偏光顯微鏡、DP73 型顯微鏡攝像頭、SZ2-STS 型體視顯微鏡。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗動物分組、造模及給藥 豚鼠適應性喂養(yǎng)1 周，將其分為對照組，模型組，依折麥布組，參苓白術(shù)丸高、中、低劑量組，每組10 只。對照組給予普通飼料，其余組均給予高脂飼料，在室內(nèi)溫度為20～25℃，相對濕度為40%～70%，明暗周期12 h/12 h 的條件下喂養(yǎng)8 周建立原發(fā)性高膽固醇血癥豚鼠模型。

造模4 周后開始藥物灌胃干預，給藥體積為10 ml/kg。依折麥布組予依折麥布混懸液（1 mg/kg），參苓白術(shù)丸高、中、低劑量組分別予17.00、8.50、0.85 g/kg，模型組和對照組給予等體積生理鹽水，1 次/d，連續(xù)4 周。實驗期間各組動物均自由飲水攝食。

1.4.2 實驗動物取材 末次給藥后各組禁食不禁水12 h，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，靜置30 min 后，3000 r/min 離心10 min，-80℃凍存?zhèn)溆茫蝗「?、末端回腸、遠端空腸組織置-80℃保存，另取肝組織于10%中性甲醛溶液固定，行組織病理學HE 染色觀察；結(jié)扎膽囊管并完整取下膽囊，收集膽囊膽汁并觀察成石情況同時行膽囊膽汁測定。

1.5 觀察指標及檢測方法

1.5.1 血液生化指標檢測 采用全自動生化分析儀檢測各組豚鼠血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C 的含量。

1.5.2 膽汁TC、總膽汁酸測定 測定采用酶比色法及酶顯色法，按試劑盒說明進行。膽汁-20℃保存。

1.5.3 HE 染色法觀察肝臟組織形態(tài)學變化 肝臟組織置于10%中性甲醛溶液固定24 h，逐級乙醇脫水、透明，浸蠟，包埋，切片，HE 染色，光鏡下觀察肝組織病理形態(tài)學變化。

1.5.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗法測定小腸組織NPC1L1、ABCG5、ACAT2、LXRα 的表達 取各組動物小腸組織，提取組織裂解液（離心半徑10 cm，8000 r/min，離心15 min），配置試劑，繼續(xù)按照檢驗步驟進行，在反應終止后5 min 內(nèi)用酶標儀在450 nm 波長依序測量各孔的光密度（optical density，OD）值，將樣本的OD值代入方程式，計算出樣本濃度。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗；兩組間比較采用t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清TG、TC、HDL-C 及LDL-C 水平比較

與對照組比較，模型組血清TG、TC、LDL-C 水平均升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。與模型組比較，參苓白術(shù)丸低劑量組TG 水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）；參苓白術(shù)丸中劑量組血清TG、LDL-C 水平均降低，HDL-C 水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）；參苓白術(shù)丸高劑量組血清TG、TC、LDL-C 水平均降低，HDL-C 水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 各組血清TG、TC、HDL-C 及LDL-C 水平比較（mmol/L，）

表1 各組血清TG、TC、HDL-C 及LDL-C 水平比較（mmol/L，）

注：與對照組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05。TG：甘油三酯；TC：總膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇

2.2 各組膽汁TC、總膽汁酸水平比較

與對照組比較，模型組膽汁TC、總膽汁酸水平均升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。與模型組比較，參苓白術(shù)丸中、高劑量組膽汁TC、總膽汁酸水平均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。見表2。

表2 各組膽汁TC、總膽汁酸水平比較（）

表2 各組膽汁TC、總膽汁酸水平比較（）

注：與對照組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05。TC：總膽固醇

2.3 各組肝臟病理組織學觀察

對照組肝臟組織基本正常；模型組可見彌漫性大泡性脂肪變，肝組織內(nèi)廣泛的肝細胞氣球樣變、少量炎癥細胞浸潤和點狀細胞壞死；依折麥布組脂肪變性顯著減輕；參苓白術(shù)丸中、高劑量組脂肪變性及肝細胞氣球樣變顯著減輕；參苓白術(shù)丸低劑量組肝細胞脂肪樣變性改善較模型組不明顯。見圖1。

圖1 肝臟病理組織學圖片（HE 染色，200×）

2.4 各組NPC1L1、ACAT2、ABCG5 及LXRα 水平比較

與對照組比較，模型組NPC1L1、ACAT2、ABCG5、LXRα 水平均升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。與模型組比較，參苓白術(shù)丸中、高劑量組NPC1L1、ACAT2、LXRα 水平均降低，ABCG5 水平均升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。見表3。

表3 各組NPC1L1、ACAT2、ABCG5 及LXRα 水平比較（ng/g，）

表3 各組NPC1L1、ACAT2、ABCG5 及LXRα 水平比較（ng/g，）

注：與對照組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05。NPC1L1：尼曼-匹克C1 樣蛋白1；ACAT2：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶2；ABCG5：三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體G5；LXRα：肝臟X 受體α

3 討論

中醫(yī)無“高膽固醇血癥”病名，但一般認為其在“痰濁”“痰濕”等范疇中[6]。中醫(yī)理論認為該病病機本質(zhì)乃“本虛標實”，本以“脾虛”為要，標以“濕濁”為主[7]。故治療應從健脾祛濕入手，作為健脾祛濕經(jīng)典方劑，參苓白術(shù)丸由蓮子肉、薏苡仁、陳皮、砂仁、桔梗、白扁豆、茯苓、人參、白術(shù)、山藥、甘草組成。現(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，參苓白術(shù)丸的多個有效成分對脂質(zhì)代謝失調(diào)均有明顯的改善和調(diào)節(jié)作用[8-11]。因此，本研究選取不同劑量的參苓白術(shù)丸探究其對原發(fā)性高膽固醇血癥豚鼠的影響，為臨床使用參苓白術(shù)丸調(diào)節(jié)膽固醇代謝提供實驗依據(jù)。

小腸從食物中吸收的膽固醇占人體攝取膽固醇總量的50%[12]。在此過程中NPC1L1、ACAT2、ABCG5、LXRα 起到重要作用[13-19]。有研究[20]顯示，阻斷NPC1L1的內(nèi)吞可以抑制膽固醇進入吸收細胞；ACAT 作為細胞內(nèi)唯一可以催化膽固醇酯合成的酶，當抑制小腸中ACAT2 時，可阻斷小腸對飲食來源膽固醇的攝取[21]；ABCG5 除了可促進膽固醇從小腸上皮細胞運至腸腔隨糞便排出，還能促進膽固醇逆轉(zhuǎn)運，促進肝臟將膽固醇分泌入膽汁排出體外[22-24]；LXRα 可以抑制小腸NCP1L1、上調(diào)ABCG5 的表達，減少腸道對膽固醇的吸收。上調(diào)毛細膽管的肝細胞中ABCG5 的表達，增加肝膽固醇向膽汁中的直接排放；促進限速酶CYP7A1，將肝膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸；調(diào)節(jié)SREBP-1c 將膽固醇轉(zhuǎn)換成脂肪酸等方式[25-28]。因此調(diào)控這些蛋白的表達，對治療原發(fā)性高膽固醇血癥具有重要意義。

本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組血清TG、TC、LDL-C 水平均升高（P ＜0.05），提示原發(fā)性高膽固醇血癥動物造模成功[29-30]。與模型組比較，參苓白術(shù)丸中、高劑量組NCP1L1、ACAT2、LXRα 水平均下降，ABCG5 水平均升高（P ＜0.05），提示參苓白術(shù)丸中、高劑量組可以下調(diào)高膽固醇血癥豚鼠模型小腸NCP1L1、ACAT2、LXRα 水平，上調(diào)ABCG5 水平。

本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，參苓白術(shù)丸中、高劑量組TG、LDL-C 水平及膽汁TC、總膽汁酸含量均降低（P ＜0.05），且肝臟的脂肪變性、肝細胞氣球樣變也較模型組改善。提示參苓白術(shù)丸中、高劑量組可以改善高膽固醇飲食所導致的原發(fā)性高膽固醇血癥，減輕肝臟細胞脂肪樣變。其可能的機制是參苓白術(shù)丸通過下調(diào)NCP1L1、ACAT2，上調(diào)ABCG5 來降低膽固醇水平；若要明確該結(jié)論，還需要阻斷該信號通路，檢測參苓白術(shù)丸是否具有降脂作用來進一步確定。

本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，參苓白術(shù)丸中、高劑量組LXRα 水平降低（P ＜0.05）。在高膽固醇條件下，LXRα 上調(diào)SREBP-1c 的表達，而SREBP-1c 過表達將使大量固醇轉(zhuǎn)換成脂肪酸，超出人體代謝能力后會引起肝臟脂肪變性，最終形成非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）[31-33]。參苓白術(shù)丸中、高劑量組可以通過下調(diào)LXRα 水平改善原發(fā)性高膽固醇血癥豚鼠模型的NAFLD。

綜上所述，參苓白術(shù)丸中、高劑量可以降低NPC1L1、ACAT2 及LXRα 表達，上調(diào)ABCG5 水平；能夠降低高膽固醇血癥豚鼠模型的血脂水平，改善膽汁TC 和總膽汁酸濃度，減輕肝臟脂質(zhì)沉積。今后本課題組將進一步明確參苓白術(shù)丸影響原發(fā)性高膽固醇血癥豚鼠膽固醇水平的機制，為參苓白術(shù)丸治療高脂血癥提供更有力的實驗數(shù)據(jù)支持。