豬星狀病毒實驗室檢測技術研究進展

莊金秋，梅建國，張 穎，莫 玲，李 峰

(山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600)

豬星狀病毒(Porcine astrovirus, PAstV)為星狀病毒科哺乳動物星狀病毒屬成員。星狀病毒(Astrovirus, AstV)是一種無囊膜包被的單股正鏈RNA病毒，是一類廣泛存在于人和多種哺乳動物及禽類的人獸共患病病原[1-4]，廣泛分布于世界各地。PAstV對哺乳期仔豬侵害較大，常引起腹瀉、脫水和嘔吐等臨床癥狀，導致乳豬生長遲緩，嚴重者可引起死亡，給養(yǎng)豬業(yè)帶來一定的經濟損失。PAstV首次由Bridger(1980)[5]通過電鏡在3周齡的乳豬腹瀉糞樣中觀察到。Shimizu等(1990)[6]報道PAstV在豬群中普遍存在，而且常同冠狀病毒、嵌杯狀病毒、輪狀病毒及其它腸道病毒混合感染造成豬急性胃腸炎。隨后許多國家對PAstV流行病學的調查表明，PAstV在豬群具有高感染率和高血清陽性率[7]。PAstV目前發(fā)現5個差異顯著的基因型(PAstVl～PAstV5)，不同地區(qū)存在不同的流行毒株[8]。PAstV在我國豬群內的流行率較高，且5個基因型均有發(fā)現。目前，本病尚無治療藥物和預防疫苗。本文就PAstV的最新實驗室檢測技術研究進展作一簡要概述，以期為疾病的有效防控提供參考。

1 病毒分離與鑒定

1.1 病毒的分離培養(yǎng)

由于星狀病毒在細胞培養(yǎng)物中的培養(yǎng)比較困難，而且多數星狀病毒在細胞培養(yǎng)物中不產生細胞病變效應(CPE)，給病毒分離工作帶來了難度。因此，國內外有關PAstV體外分離成功的報道較少。Lee等(1981)[9]研究發(fā)現在添加胰酶的條件下，人星狀病毒可在人胚胎腎細胞(HEK)、恒河猴腎細胞(LLC-MK2)及原代狒狒腎細胞中增殖，然而即使是在胰酶存在的條件下，星狀病毒也不能適應非洲綠猴腎細胞(Vero)、人胚胎肺細胞(MRC5)和倉鼠腎細胞(BHK21)等細胞系。Shimizu等(1990)[6]用豬胚腎建立的細胞系首次從患急性胃腸炎的豬中分離到一株能引起CPE的PAstV，該病毒引起的CPE特征表現在能使細胞增大和在胞漿中有細小顆粒出現。但是由于原代培養(yǎng)這一方法不能穩(wěn)定增殖的局限性，體外分離的細胞毒株數量仍舊有限。Willcocks等(1990)[10]采用傳代細胞系人類結腸癌細胞直接從糞便標本中分離星狀病毒并獲得成功，而無需先在HEK細胞中進行傳代。近年來，國內外也有關于利用PK15細胞系成功分離PAstV的報道。商曉桂(2010)[11]通過對上海郊區(qū)某豬場疑似PAstV感染豬的糞樣進行病毒分離和純化，獲得一株能在PK15細胞上增長繁殖，并使該細胞產生破碎、脫落等細胞病變的病毒，電鏡觀察該病毒呈典型的星狀結構，直徑為28～30 nm。蘭家暖等(2012)[12]用PK15細胞從PAstV廣西流行株中分離到2株具有CPE和致病性的PAstV，為進一步研究PAstV的分子生物學、致病機制及構建發(fā)病動物模型等奠定了基礎。劉歡(2014)[8]首次使用甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮(TPCK)處理過的胰酶，成功實現了PAstV在豬腎細胞系(PK15)中的穩(wěn)定增殖，CPE主要為細胞增大變圓，逐漸破碎并脫離瓶壁，有的完全破碎溶解。對細胞培養(yǎng)物中分離到的病毒，可用電鏡及免疫熒光試驗等方法進行鑒定。病毒分離的整個過程耗時費力，不適于病毒感染的快速診斷，因此很少用于臨床實踐。但病毒分離的成功使星狀病毒可在培養(yǎng)細胞內大量增殖，并可用來制備針對不同血清型的單克隆和多克隆抗體，從而使檢測星狀病毒的免疫學方法如免疫熒光法、酶聯(lián)免疫法等隨之發(fā)展起來。

1.2 電鏡檢查

直接電鏡檢查在星狀病毒感染的早期研究中發(fā)揮了重要的作用。Appleton等(1975)[13]首次用電鏡發(fā)現了星狀病毒。此方法簡單，直觀，此后十多年時間里，電鏡是檢測該病毒的主要方法。將糞便樣本用蒸餾水稀釋成20%懸液，離心后取上清液，用1%磷鎢酸鉀液(pH 7.0)染色后，電鏡檢查。如果糞便中有星狀病毒存在，根據其特有的星狀結構、28～30 nm直徑等特征較易檢出，必要時可將糞便濃縮處理后再做電鏡檢查。但是，僅有10%星狀病毒具有典型的星形外觀，故敏感性較低。若在標本中加入熒光標記的抗體，可提高檢出率，稱為免疫電鏡法。但當病毒滴度低時，仍有較高的假陰性結果出現，且該方法價格昂貴，技術條件要求高，不適合大規(guī)模的流行病學調查。

2 血清學檢測技術

星狀病毒在培養(yǎng)細胞內的大量增殖，可用于制備不同血清型的單克隆和多克隆抗體，從而促進了星狀病毒免疫學檢測方法(如ELISA、免疫熒光等)的發(fā)展。ELISA的優(yōu)點是抗原抗體均可檢測，便利、快速、特異性強，并可用于分型研究，缺點是敏感性略低于電鏡，且無法分辨是野毒感染還是疫苗免疫結果。免疫熒光試驗和間接免疫熒光試驗(IFA)主要用于對細胞培養(yǎng)物或組織切片中星狀病毒的檢測，還可檢測病毒在細胞中的增殖特性和規(guī)律，對腸道內星狀病毒檢查，可取活體或尸體的小腸制作冰凍切片，再用免疫熒光試驗檢查腸上皮細胞中的星狀病毒。此法簡便、快速、檢出率較高，但被檢病料來源有一定的局限性，用于死亡動物的檢測。在免疫熒光試驗中，即使在48 h或72 h時出現特異性綠色熒光的細胞也只有30%～40%，說明星狀病毒在體外培養(yǎng)條件下很難感染宿主細胞，即使感染，但對細胞的侵蝕作用不強。目前國內外尚沒有商品化的PAstV血清學檢測試劑盒或者疫苗。宋雅婷(2019)[14]在成功獲得PAstV2-Spike、PAstV3-Spike、PAstV5-Spike重組衣殼蛋白后，以之為包被抗原蛋白建立了檢測PAstV2、PAstV3、PAstV5抗體的間接ELISA方法。陳少杰(2020)[15]對PAstV4部分ORF1b基因進行擴增、原核表達及純化，并基于重組蛋白構建了檢測PAstV4抗體的間接ELISA方法，對河北地區(qū)的臨床血清樣品中抗體情況進行了檢測，結果顯示陽性率為14%(42/300)。

3 分子生物學檢測技術

3.1 RT-PCR技術

RT-PCR已成為臨床上檢測PAstV最主要的手段。商曉桂(2010)[11]應用PK15細胞從上海某疑似PAstV感染豬場分離到的PAstV，經動物回歸試驗發(fā)現被攻毒豬出現了星狀病毒感染的臨床癥狀；取感染豬腸內容物，經RT-PCR檢測到PAstV目的條帶，表明該豬場患病豬為星狀病毒感染。蘭家暖等(2012)[16]采用套式RT-PCR(RT-nPCR)技術，對2008—2010年從廣西7個市縣29個不同規(guī)模化豬場采集的315份不同階段豬腹瀉糞樣進行PAstV分子流行病學調查及基因型分析，表明PAstV在廣西地區(qū)豬群中已存在。黃瑫(2015)[17]根據PAstV的RDRP基因(RNA依賴性RNA多聚酶基因)設計引物，建立RT-PCR檢測方法，并將此方法用于江西地區(qū)PAstV的檢測，結果顯示江西地區(qū)商業(yè)豬場的PAstV在糞便中的檢出率為29.2%，在腸組織中的檢出率為51.7%。PAstV在健康豬和腹瀉豬中都有感染，在豬群中常年存在，在冬季的感染率較高。羅璋等(2016)[18]根據PAstV2序列設計引物建立RT-PCR方法，首次在湖南地區(qū)檢測到PAstV2。楊文宇等(2014)[19]根據豬A群輪狀病毒(GARV)、豬C群輪狀病毒(GCRV)的VP6基因和PAstV的ORF2基因分別設計引物，建立了同時檢測GARV、GCRV和PAstV的三重RT-PCR方法。應用該方法檢測30份四川省仔豬腹瀉糞樣。結果顯示，GARV、GCRV、PAstV的陽性檢出率分別為26.7%、13.3%、16.7%，與這3種病毒的單項RT-PCR檢測結果的符合率分別為100%、100%、83%，整體符合率達94.3%，特異性為100%。顧凡等(2015)[20]根據豬嵴病毒(PKV)3D基因、PAstV的ORF2基因和豬環(huán)曲病毒(PToV)M基因序列設計3對引物，建立了同時檢測PKV、PAstV和PToV的三重RT-PCR方法，對這3種疾病的鑒別診斷和混合感染檢測具有重要的應用價值。曲雅新等(2020)[21]根據豬輪狀病毒(PRoV)VP6基因、豬札幌病毒(PoSaV)RdRp基因和PAstV的ORF1基因序列分別設計引物，建立了同時檢測PRoV、PoSaV和PAstV的三重RT-PCR方法，用于3種病原感染的臨床鑒別診斷。

3.2 熒光定量RT-PCR技術

熒光定量RT-PCR與傳統(tǒng)RT-PCR相比，特異性更強，靈敏度更高。商曉桂等(2010)[22]建立了檢測PAstV的SYBR Green I熒光定量RT-PCR方法，其方法靈敏度可達10個拷貝，是普通RT-PCR的100倍，特異性和重復性較好，為早期PAstV感染的調查及診斷提供了重要的技術支持。劉心等(2020)[23]根據PAstV3基因序列，在ORF 1b保守區(qū)設計特異性引物和TaqMan探針建立了熒光定量RT-PCR方法。使用該方法對臨床收集的30份疑似PAstV3糞便樣本進行檢測，陽性率為40%，檢出率高于RT-PCR方法。該方法的建立為PAstV3的診斷及流行病學調查提供了快速、準確的檢測手段。陳少杰等[24](2020)根據PAstV4基因序列，在ORF1a保守區(qū)設計特異性引物建立了SYBR Green I熒光定量RT-PCR方法，為PAstV4的臨床檢測建立了一種快速、靈敏、特異性強的方法。

4 小結

PAstV在豬群中普遍存在，而且常與其它腸道病毒混合感染導致仔豬腹瀉。據對斷奶仔豬死因調查顯示，腹瀉引起的死亡占仔豬死亡總數的15%，每年都會對養(yǎng)豬業(yè)造成較大的經濟損失[25]。隨著分子生物學技術的發(fā)展和對PAstV的各項研究的逐步深入，人們逐步認識到PAstV的感染率和發(fā)病率均高出預期。雖然PAstV致病機制還有待于進一步的體內和體外研究，但星狀病毒的多宿主性、基因差異性及其重組現象和跨種間傳播及適應新宿主的能力，使得星狀病毒成為潛在的新興人畜共患病原并具有重要的公共衛(wèi)生意義[25]。PAstV的血清學和分子生物學檢測方法各有優(yōu)點和缺點，需要根據不同的場合、條件等選擇合適的方法。雖然上述檢測方法為PAstV的檢測提供了有效的技術手段，但是隨著人們對PAstV的深入研究，相信現有的檢測方法將不斷的得到改進或者新的檢測方法將很快研制出來，以使其檢測技術更簡便化、快速化和準確化，這將對PAstV病的有效防控產品及技術的研制奠定基礎。