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    去甲斑蝥素對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞凋亡和炎癥因子釋放的影響和機制

    2021-11-26 01:32:44劉佳佳薛建華虞俊波
    中成藥 2021年11期
    關(guān)鍵詞:激活劑去甲滑膜

    楊 洋, 劉佳佳, 薛建華, 虞俊波

    (南通大學(xué)附屬醫(yī)院急診外科,江蘇 南通 226001)

    類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)屬于慢性自身免疫疾病,其以骨侵蝕和慢性滑膜炎為主要病理特征,臨床上表現(xiàn)為小關(guān)節(jié)畸形、腫脹、疼痛,嚴(yán)重者可導(dǎo)致殘疾[1]?;こ衫w維細(xì)胞是RA發(fā)生的核心細(xì)胞,其與正常的滑膜成纖維細(xì)胞比較,具有過度增殖、凋亡減少以及分泌大量的炎癥因子等特點[2]。去甲斑蝥素屬于斑蝥素的衍生物,其是由呋喃和馬來酸酐按照Diel-Alder加成反應(yīng)而合成的,去甲斑蝥素具有明顯的抗腫瘤活性,能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[3]。研究報道顯示,去甲斑蝥素治療后的RA大鼠關(guān)節(jié)炎評分得到明顯改善,去甲斑蝥素具有保護RA的功效[4]。在腫瘤細(xì)胞的研究報道顯示,去甲斑蝥素作用機制與NF-κB有關(guān),其可以通過下調(diào)NF-κB信號的激活水平發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[5]。NF-κB激活后可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng),NF-κB信號在RA滑膜成纖維細(xì)胞過度激活[6]。目前對于去甲斑蝥素對RA滑膜成纖維細(xì)胞凋亡和炎癥因子釋放的作用還不清楚。本次實驗探討去甲斑蝥素處理對人RA滑膜成纖維細(xì)胞凋亡和炎癥因子分泌的影響和機制,為RA的治療提供理論資料。

    1 材料與方法

    1.1 材料 收集2018年10月于南通大學(xué)附屬醫(yī)院行關(guān)節(jié)置換術(shù)、滑膜切除術(shù)RA患者的滑膜組織,患者及其家屬知情同意。去甲斑蝥素(純度≥98%,上海伊奧生物科技有限公司),RPMI1640溶解,現(xiàn)配現(xiàn)用。NF-κB p65抗體(上海時代生物科技有限公司);白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)測定試劑盒(上海康朗生物科技有限公司);κB抑制蛋白激酶α(IκB kinaseα,IKK-α)抗體(上海研晶生物技術(shù)有限公司);B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)抗體(青島捷世康生物科技有限公司);Ⅱ型膠原酶(美國Sigma公司);Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein, Bax)抗體(上海澤葉生物科技有限公司);白細(xì)胞介素-8(interleukin-8,IL-8)測定試劑盒(泉州市睿信生物科技有限公司)。

    1.2 RA滑膜成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)和分組 取滑膜組織,放在PBS中反復(fù)洗滌3次,小心將滑膜組織中的脂肪、軟骨組織、骨片清除干凈,用眼科剪將滑膜組織剪碎后放在培養(yǎng)瓶中,添加4 mg/mL Ⅱ型膠原酶,置于37 ℃搖床中孵育振蕩反應(yīng)4 h,100目濾網(wǎng)過濾消化液,離心10 min,置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),觀察細(xì)胞融合以后用胰蛋白酶消化傳代[7],取第4代細(xì)胞用于后續(xù)實驗。RA滑膜成纖維細(xì)胞分為對照組、去甲斑蝥素組,在細(xì)胞增殖檢測過程中去甲斑蝥素組又分為4個質(zhì)量濃度,分別為5、10、20、40 μg/mL,其余實驗選用20 μg/mL。

    1.3 MTT法 將RA滑膜成纖維細(xì)胞密度調(diào)整到4×105/mL,取100 μL種植到96孔板上,按“1.2”項下方法分離培養(yǎng)和分組,置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,取出培養(yǎng)板,添加MTT溶液10 μL,繼續(xù)放在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h,將孔內(nèi)上清棄掉,添加150 μL DMSO溶液,孵育10 min,酶標(biāo)儀檢測光密度(OD)值。

    1.4 流式細(xì)胞術(shù) 收集已經(jīng)培養(yǎng)24 h后的對照組、去甲斑蝥素組細(xì)胞,胰蛋白酶消化,添加PBS緩沖液至細(xì)胞,離心10 min。加入400 μL Binding Buffer充分混合,移液器吸棄5 μL Annexin V-FITC、PI溶液至細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀檢測前添加100 μL Binding Buffer混勻。

    1.5 Western blot法 收集培養(yǎng)24 h的對照組、去甲斑蝥素組細(xì)胞,PBS洗滌2次,添加RIPA蛋白抽提試劑,細(xì)胞培養(yǎng)板放在冰上孵育30 min,將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移到離心管中,在4 ℃下離心10 min,吸取蛋白上清分裝至EP管中保存,蛋白樣品在上樣前與Loading Buffer混合煮沸5 min,SDS-PAGE凝膠電泳每孔蛋白上樣量為30 μg,以12%分離膠、5%濃縮膠進行電泳,SDS-PAGE電泳電壓設(shè)置為恒壓100 V,取出分離膠,在90 V、4 ℃下轉(zhuǎn)膜40 min,取出轉(zhuǎn)膜后的NC膜,放在含有封閉液的平皿內(nèi),在室溫環(huán)境中結(jié)合反應(yīng)1 h,然后將NC膜取出,以TBST溶液洗3次,放在含有一抗稀釋液的平皿內(nèi),在4 ℃環(huán)境中結(jié)合反應(yīng)過夜,TBST洗滌,NC膜放在含有二抗稀釋液的平皿內(nèi),在室溫下反應(yīng)1 h,ECL法顯色,內(nèi)參為β-actin。根據(jù)條帶的灰度值,分析目的蛋白Bax、Bcl-2、IKK-α、NF-κB p65表達(dá)量。

    1.6 ELISA法 收集培養(yǎng)24 h的對照組、去甲斑蝥素組細(xì)胞培養(yǎng)液上清,ELISA法檢測IL-6、IL-8水平,按照相關(guān)檢測試劑盒說明書進行。

    1.7 NF-κB信號激活劑對去甲斑蝥素的影響檢測 RA滑膜成纖維細(xì)胞接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,同時添加含有20 μg/mL去甲斑蝥素、1 μmol/L NF-κB信號激活劑佛波醇脂的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng),作為去甲斑蝥素+佛波醇脂組,以去甲斑蝥素組(按“1.2”項下方法處理)為對照,檢測細(xì)胞凋亡,Bax、Bcl-2、IKK-α、NF-κB p65蛋白表達(dá)及IL-6、IL-8水平。

    2 結(jié)果

    2.1 去甲斑蝥素對RA滑膜成纖維細(xì)胞增殖影響 經(jīng)5、10、20、40 μg/mL去甲斑蝥素處理后,RA滑膜成纖維細(xì)胞增殖能力降低(P<0.01),在20 μg/mL下抑制率接近50%,故后續(xù)選用該質(zhì)量濃度進行實驗,見表1。

    表1 各組RA滑膜成纖維細(xì)胞OD值

    2.2 去甲斑蝥素對RA滑膜成纖維細(xì)胞凋亡影響 去甲斑蝥素處理后,RA滑膜成纖維細(xì)胞凋亡率升高(P<0.01),細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)增加(P<0.01),Bcl-2蛋白表達(dá)減少(P<0.01),見圖1、表2。

    注:A為細(xì)胞凋亡,B為Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)。

    表2 各組RA滑膜成纖維細(xì)胞凋亡率及Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)

    2.3 去甲斑蝥素對RA滑膜成纖維細(xì)胞IL-6、IL-8水平的影響 去甲斑蝥素處理后,RA滑膜成纖維細(xì)胞IL-6、IL-8水平減少(P<0.01),見表3。

    表3 各組RA滑膜成纖維細(xì)胞IL-6、IL-8水平

    2.4 去甲斑蝥素對RA滑膜成纖維細(xì)胞NF-κB信號通路激活的影響 去甲斑蝥素處理后,RA滑膜成纖維細(xì)胞IKK-α、NF-κB p65蛋白表達(dá)下降(P<0.01),見圖2、表4。

    表4 各組RA滑膜成纖維細(xì)胞IKK-α、NF-κB p65蛋白

    圖2 各組RA滑膜成纖維細(xì)胞IKK-α、NF-κB p65蛋白表達(dá)

    2.5 NF-κB信號激活劑對去甲斑蝥素影響RA滑膜成纖維細(xì)胞IKK-α、NF-κB p65蛋白表達(dá)的干預(yù)作用 與未經(jīng)NF-κB信號激活劑處理比較,NF-κB信號激活劑與去甲斑蝥素共同處理后RA滑膜成纖維細(xì)胞IKK-α、NF-κB p65蛋白表達(dá)升高(P<0.01),見圖3、表5。

    表5 共同處理后各組RA滑膜成纖維細(xì)胞IKK-α、NF-κB p65蛋白

    圖3 共同處理后各組RA滑膜成纖維細(xì)胞IKK-α、NF-κB p65蛋白表達(dá)

    2.6 NF-κB信號激活劑對去甲斑蝥素影響RA滑膜成纖維細(xì)胞凋亡及IL-6、IL-8水平的干預(yù)作用 與未經(jīng)NF-κB信號激活劑處理比較,NF-κB信號激活劑與去甲斑蝥素共同處理后RA滑膜成纖維細(xì)胞凋亡率降低(P<0.01),Bax蛋白表達(dá)減少(P<0.01),Bcl-2蛋白表達(dá)升高(P<0.01),IL-6、IL-8水平增加(P<0.01),見圖4、表6。

    注:A為細(xì)胞凋亡,B為Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)。

    表6 共同處理后各組RA滑膜成纖維細(xì)胞凋亡率,Bcl-2、Bax蛋白及IL-6、IL-8水平

    3 討論

    RA是由多種因素誘發(fā)而形成的,RA發(fā)生時,滑膜組織中巨噬細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞以及B細(xì)胞浸潤導(dǎo)致滑膜內(nèi)層增生,而滑膜成纖維細(xì)胞是滑膜內(nèi)層的主要組成部分[8]。RA滑膜成纖維細(xì)胞過度增殖、凋亡減少,同時能夠分泌大量的炎癥因子,促進關(guān)節(jié)功能喪失和破壞[9]。IL-6、IL-8是常見的RA滑膜成纖維細(xì)胞分泌的炎癥因子,二者可以誘導(dǎo)組織炎癥發(fā)生[10]。Bax和Bcl-2分別為促細(xì)胞凋亡和抗細(xì)胞凋亡蛋白,其表達(dá)的高低與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[11]。本實驗發(fā)現(xiàn),去甲斑蝥素處理后的RA滑膜成纖維細(xì)胞增殖能力下降,細(xì)胞凋亡水平增加,細(xì)胞分泌的IL-6、IL-8減少,說明去甲斑蝥素具有誘導(dǎo)RA滑膜成纖維細(xì)胞凋亡和抑制炎癥因子分泌的作用。

    去甲斑蝥素是我國研發(fā)的抗腫瘤藥物,其可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[12]。另外,去甲斑蝥素還具有改善缺血性心臟病、狼瘡性腎炎、腎炎等功效[13-15]。研究顯示去甲斑蝥素具有保護RA的作用[4]。本實驗證實去甲斑蝥素抗RA機制與誘導(dǎo)滑膜成纖維細(xì)胞凋亡和抑制炎癥因子分泌有關(guān),提示去甲斑蝥素具有明確的抗RA功效。

    目前對于去甲斑蝥素在疾病治療中的作用機制還不明確,已知其可以通過調(diào)控下游復(fù)雜的信號通路或蛋白表達(dá)而發(fā)揮作用[16]。去甲斑蝥素通過抑制多發(fā)性骨髓瘤、白血病等細(xì)胞NF-κB信號通路發(fā)揮抗腫瘤作用[17-18]。在超負(fù)荷腎病大鼠模型中發(fā)現(xiàn)去甲斑蝥素能夠抑制NF-κBp65蛋白表達(dá)[19]。NF-κB是一個廣泛參與細(xì)胞正常生理和疾病發(fā)生過程的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,NF-κB參與人類自身免疫疾病發(fā)生,與細(xì)胞凋亡、增殖和炎癥反應(yīng)有關(guān)[20]。NF-κB在靜息狀態(tài)下以復(fù)合物的形式存在,而外界信號刺激后可以誘導(dǎo)IKK激活而促進NF-κB同靶基因的結(jié)合,從而促進靶基因的表達(dá)[21]。IKK-α是IKK催化亞基,其表達(dá)增多是NF-κB信號通路激活的啟動步驟[22]。NF-κB p65是NF-κB的亞單位,也是NF-κB發(fā)揮生物學(xué)作用的必需分子[23]。本實驗顯示,去甲斑蝥素處理后的RA滑膜成纖維細(xì)胞IKK-α、NF-κB p65表達(dá)下降,并且NF-κB信號激活劑可以逆轉(zhuǎn)去甲斑蝥素對RA滑膜成纖維細(xì)胞凋亡促進和炎癥因子分泌的抑制作用,證實去甲斑蝥素作用機制與下調(diào)NF-κB信號有關(guān)。

    去甲斑蝥素具有促進RA滑膜成纖維細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞分泌炎癥因子的作用,其機制與下調(diào)NF-κB信號通路激活水平有關(guān)。這為研究去甲斑蝥素在RA中的作用提供了參考。

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