婦科千金膠囊對LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞炎癥及氧化應(yīng)激的影響

胡櫻凡， 符 佳， 張 艷， 張 鵬， 張樂樂， 李 維， 鄒 亮， 龔 云*

(1.成都大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610106；2.株洲千金藥業(yè)股份有限公司，湖南 株洲 412007；3.成都大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106)

婦科千金膠囊源于婦科千金方，由8味藥組成，千斤拔、功勞木共為君藥，穿心蓮、單面針為臣藥，雞血藤、當(dāng)歸、黨參、金櫻根為佐藥，有清熱祛濕，益氣化瘀之效，主治濕熱瘀阻所致的帶下病、腹痛，臨床上廣泛用于治療慢性盆腔炎、子宮內(nèi)膜炎、慢性宮頸炎[1-4]。婦科千金膠囊由株洲千金藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，收載于2020年版《中國藥典》[5]。

婦科千金膠囊作為成方制劑，具有多成分、多靶點、多途徑的治療特點。已有研究報道，婦科千金方中千斤拔、功勞木、穿心蓮、雞血藤有明確的抗炎活性，且對其抗炎機(jī)制亦有一定的研究[6-11]。婦科千金制劑可通過調(diào)控NF-κB、PI3K/Akt等信號通路減少下游炎癥因子的分泌從而發(fā)揮抗炎作用[12-13]。環(huán)氧合酶-2(COX-2)是炎癥反應(yīng)中的重要酶，為前列腺素家族介導(dǎo)物質(zhì)[14-15]，COX-2抑制劑是理想的抗炎鎮(zhèn)痛藥物，有著巨大的臨床價值。此外，炎癥反應(yīng)的同時發(fā)生的氧化應(yīng)激不容忽視。炎癥反應(yīng)中的巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等活化以后，細(xì)胞耗氧量迅速增加，還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶大量激活，促使活性氧過量產(chǎn)生[16]；炎癥因子一氧化氮(NO)作為線粒體電子傳輸鏈的抑制劑可引起大量電子泄漏[17]，腫瘤壞死因子(TNF-α)可刺激白細(xì)胞產(chǎn)生大量活性氧，從而導(dǎo)致自由基大量產(chǎn)生以致氧化應(yīng)激。另一方面，氧化應(yīng)激可引起炎癥進(jìn)一步加重?；钚匝?ROS)促進(jìn)花生四烯酸代謝，增加炎癥介質(zhì)的形成；自由基可促進(jìn)血漿趨化因子形成，吸引中性粒細(xì)胞向炎癥灶聚積。炎癥與氧化應(yīng)激相互影響形成惡性循環(huán)，甚至引起器官衰竭、休克[18]。目前婦科千金膠囊是否通過COX-2發(fā)揮抗炎作用以及調(diào)控“炎癥-氧化應(yīng)激”的藥效學(xué)機(jī)制尚不明確。因此，本研究擬基于體外炎癥模型，考察婦科千金膠囊對COX-2的調(diào)控作用，并探討其抗炎、抗氧化應(yīng)激效應(yīng)，為進(jìn)一步研究和開發(fā)婦科千金膠囊提供實驗依據(jù)與參考。

1 材料與方法

1.1 藥物 婦科千金膠囊，購自株洲千金藥業(yè)股份有限公司，批號20181121。

1.2 細(xì)胞株 小鼠單核巨噬細(xì)胞株RAW 264.7，購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.3 試劑 地塞米松磷酸鈉注射液(5 mg/mL，西南藥業(yè)股份有限公司，批號04132)；內(nèi)毒素(LPS，美國Sigma公司，批號039M4004V)；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國賽默飛公司，批號81119181)；四季青胎牛血清(浙江天航生物科技股份有限公司，批號19030604)；青霉素-鏈霉素、PBS緩沖液(美國HyClone公司，批號分別為J190005、AE25720265)；噻唑藍(lán)(MTT)試劑、格里斯(Griess)NO檢測試劑盒、ROS檢測試劑盒、過氧化氫酶(CAT)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號分別為042319190619、032519190612、052019191018、070319191022、071919191011)；小鼠TNF-α、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒及GAPDH單克隆抗體(杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，批號分別為A28290343、A20690543、A201B90324、A95370123)；iNOS rabbit mAb、COX-2 rabbit mAb(賽信通上海生物試劑有限公司，批號分別為13120S-4、12282S-4)；HRP-羊抗兔IgG+HRP-羊抗小鼠IgG、DMSO(武漢博士德生物工程有限公司，批號分別為BST13J17B26、PYG0040)；ECL超敏化學(xué)發(fā)光液(北京四正柏生物科技有限公司，批號4AH151911F)；丙二醛(MDA)、總谷胱甘肽/氧化行谷胱甘肽(GSH/GSSG)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)(南京建成生物工程研究所，批號分別為20191203、20191125、20191203)。

1.4 儀器 BPN-80CH(UV)CO2培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；LWD200-37T倒置生物顯微鏡(上海測維光電技術(shù)有限公司)；SW-CJ-2D雙人單面垂直凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；MX-S漩渦混勻儀、SLK-03000-SLED數(shù)顯圓周搖床(美國Scilogex公司)；SynergyHTX多功能酶標(biāo)儀(美國Bio Tek公司)；TCS sp8 sted超高分辨激光共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)；CPA225D電子天平(德國Sartorius公司)；TD3低速自動平衡離心機(jī)、TGL-16臺式高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)。

1.5 方法

1.5.1 藥液制備 婦科千金膠囊去囊體、囊帽，稱取藥粉0.5 g，加入DMEM高糖培養(yǎng)基5 mL，旋渦，超聲，過除菌濾膜，即得(質(zhì)量濃度為100 mg/mL)。

1.5.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將RAW 264.7細(xì)胞在DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中培養(yǎng)后，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育。

1.5.3 MTT比色法檢測細(xì)胞活力 取對數(shù)生長期細(xì)胞，制成1×106/mL細(xì)胞懸液，接種于96孔板上，每孔100 μL，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。設(shè)不含受試藥物的對照組及婦科千金膠囊1、5、10、20、40、60、80、100 mg/mL組，每組3個復(fù)孔，另設(shè)不含細(xì)胞，僅有培養(yǎng)基的空白組。培養(yǎng)過夜后，空白組、對照組加入100 μL新鮮培養(yǎng)液，婦科千金膠囊組加入100 μL不同質(zhì)量濃度藥物的新鮮培養(yǎng)液，24 h后吸取培養(yǎng)液，PBS洗2次，各孔加入新鮮培養(yǎng)液90 μL、MTT(5 mg/mL)10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去上層液體，加入DMSO 100 μL，振蕩至晶體全部溶解，讀取490 nm處吸光度，計算細(xì)胞存活率。

1.5.4 RAW 264.7細(xì)胞NO、TNF-α、IL-6、IL-1β水平檢測 細(xì)胞以每孔500 μL(1.0×106/mL)接種至24孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)過夜后，PBS潤洗，空白對照孔加入500 μL DMEM高糖培養(yǎng)基，地塞米松組加入等量高糖培養(yǎng)基(0.05 mg/mL)，實驗組加入含高、中、低劑量婦科千金膠囊藥液的DMEM高糖培養(yǎng)基各500 μL，0.5 h后加入LPS(1 μg/mL)，24 h后收集細(xì)胞上清液。采用Griess試劑盒檢測細(xì)胞上清液NO水平，采用ELISA試劑盒分別檢測其中TNF-α、IL-6、IL-1β水平。

1.5.5 Western blot法檢測 RAW 264.7細(xì)胞iNOS、COX-2表達(dá) 1.0×106/mL細(xì)胞懸液以每孔2 mL接種至6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)過夜后，PBS潤洗，空白對照孔加入2 mL DMEM高糖培養(yǎng)基，地塞米松組加入等量培養(yǎng)基(0.05 mg/mL)，實驗組加入等量含高、中、低劑量婦科千金膠囊藥液的培養(yǎng)基，0.5 h后加入LPS(1 μg/mL)，24 h后棄細(xì)胞上清液，潤洗后加入含有PMSF的RIPA細(xì)胞裂解液，冰上充分裂解，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清，按比例加入5×loading buffer，100 ℃水浴5 min，迅速置于冰浴中冷卻，在-80 ℃下保存。采用Western blot法，檢測細(xì)胞中iNOS、COX-2蛋白表達(dá)，根據(jù)BCA試劑盒檢測樣品蛋白濃度，按每孔蛋白量100 μg上樣，100 V電泳，200 mA轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗按比例稀釋后4 ℃孵育過夜，次日TBST洗膜，二抗按比例稀釋后室溫孵育，TBST洗膜后取出，加入ECL超敏發(fā)光液，于暗室曝光采集信號，掃描后，采用Quantity One軟件分析。

1.5.6 RAW 264.7細(xì)胞ROS水平檢測 細(xì)胞以1.0×106/mL接種于24孔板，隨機(jī)分為空白對照組、活性氧對照組、模型對照組、地塞米松組及婦科千金膠囊高、中、低劑量組，培養(yǎng)過夜細(xì)胞貼壁后，空白對照組、模型對照組更換新鮮DMEM高糖培養(yǎng)基500 μL，活性氧對照組加入等體積含陽性對照試劑Rosup的DMEM高糖培養(yǎng)基(1∶1 000)，地塞米松組、婦科千金膠囊組加入對應(yīng)質(zhì)量濃度的等體積含藥培養(yǎng)基，30 min后除空白對照組、活性氧對照組外，其余各組加入LPS溶液(1 μg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，裝載探針2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA，1∶2 000)，繼續(xù)孵育20 min，洗滌除去未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的熒光探針，在激光共聚焦鏡下觀察拍照，并采用Image J圖像軟件進(jìn)行分析。

1.5.7 RAW 264.7細(xì)胞MDA水平及GSH、CAT、SOD、GSH-Px活性檢測 將細(xì)胞制成懸液(1.0×106/mL)，接種于6孔板，隨機(jī)分為空白對照組、模型對照組、地塞米松組及婦科千金膠囊高、中、低劑量組，過夜后各組加入對應(yīng)培養(yǎng)基，30 min后加入LPS溶液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，去除上清液，PBS潤洗2次后，加入RIPA裂解液(含PMSF)在冰上裂解，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清，嚴(yán)格按照陳試劑盒說明書步驟檢測細(xì)胞裂解液中GSH、MDA水平及CAT、SOD、GSH-Px活性。

2 結(jié)果

2.1 婦科千金膠囊對RAW 264.7細(xì)胞活力的影響 如表1所示，與空白對照組比較，婦科千金膠囊10、20、40、60、80、100 mg/mL劑量組細(xì)胞存活率均低于40%，即對RAW 264.7細(xì)胞具有抑制作用。根據(jù)回歸分析可知，婦科千金膠囊對RAW 264.7細(xì)胞的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(IC50)為7.178 mg/mL，故以IC25(2.104 mg/mL)為中劑量，分別確定4、2、1 mg/mL作為高、中、低劑量。

表1 婦科千金膠囊對RAW 264.7細(xì)胞活力的影響

2.2 婦科千金膠囊對RAW 264.7細(xì)胞NO、TNF-α、IL-6、IL-1β的影響 如圖1所示，與空白對照組比較，模型對照組RAW 264.7細(xì)胞NO、TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高(P<0.01)；與模型對照組比較，地塞米松組、婦科千金膠囊各劑量組均抑制NO、TNF-α、IL-6(除婦科千金膠囊低劑量組外)、IL-1β(除婦科千金膠囊低劑量組外)水平(P<0.05，P<0.01)。

注：與空白對照組比較，**P<0.01；與模型對照組比較，#P<0.05，##P<0.01。

2.3 婦科千金膠囊對RAW 264.7細(xì)胞iNOS、COX-2蛋白表達(dá)的影響 由圖2所示，與空白對照組比較，模型對照組RAW 264.7細(xì)胞iNOS、COX-2蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；與模型對照組比較，地塞米松組及婦科千金膠囊高、中劑量組均可抑制iNOS蛋白表達(dá)(P<0.05)，但僅地塞米松組對COX-2蛋白表達(dá)有下調(diào)作用(P<0.05)。

注：A為空白對照組,B為模型對照組，C為地塞米松組,D為婦科千金膠囊4 mg/mL組,E為婦科千金膠囊2 mg/mL組,F為婦科千金膠囊1 mg/mL組。與空白對照組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，#P<0.05。

2.4 婦科千金膠囊對RAW 264.7細(xì)胞ROS水平的影響 如圖3、表2所示，與空白對照組比較，模型對照組RAW 264.7細(xì)胞ROS水平升高(P<0.01)；與模型組比較，地塞米松組、婦科千金膠囊高劑量組對ROS水平具有抑制作用(P<0.05，P<0.01)。

表2 婦科千金膠囊對RAW 264.7細(xì)胞ROS水平的影響

圖3 各組RAW 264.7細(xì)胞ROS水平(×200)

2.5 婦科千金膠囊對RAW 264.7細(xì)胞GSH、MDA水平及CAT、SOD、GSH-Px活性的影響 如圖4所示，與空白對照組比較，模型對照組MDA水平升高(P<0.01)，GSH水平及CAT、SOD、GSH-Px活性降低(P<0.01)；與模型對照組比較，地塞米松組、婦科千金膠囊各劑量組MDA水平降低(P<0.01)，GSH(僅婦科千金膠囊高劑量組)水平及CAT(除婦科千金膠囊低劑量組外)、SOD(除婦科千金膠囊低劑量組外)、GSH-Px(除婦科千金膠囊低劑量組外)活性升高(P<0.05，P<0.01)。

注：與空白對照組比較，**P<0.01；與模型對照組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3 討論

婦科千金膠囊是一種中藥復(fù)方制劑，其療效顯著，安全性好[19-21]，經(jīng)濟(jì)成本低，在臨床上被廣泛用于盆腔炎、宮頸炎、陰道炎等多種婦科疾病的治療[4]。LPS為革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁成分[22]，可激活細(xì)胞炎癥信號通路，發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)，分泌大量炎性因子，引起炎癥反應(yīng)[23]。此外，LPS可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量的ROS和自由基，打破氧化還原平衡，氧化應(yīng)激進(jìn)一步引起生物分子氧化損傷，導(dǎo)致釋放大量細(xì)胞因子、趨化因子，進(jìn)而加重炎癥反應(yīng)[16]。因此，氧化應(yīng)激在研究炎癥反應(yīng)時不容忽視。LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)的模型被廣泛應(yīng)用于藥物抗炎、抗氧化應(yīng)激的藥效評價與機(jī)制研究[24-26]，本研究利用該模型觀察婦科千金膠囊體外抗“炎癥-氧化應(yīng)激”作用并初步探討抗炎機(jī)制。

TNF-α在模型對照組中迅速釋放，是炎癥組織中高表達(dá)的早期炎性因子之一[27]。在進(jìn)一步誘發(fā)促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生的過程中充當(dāng)主要“信使”身份，是炎性細(xì)胞激活和募集的“核心”[28]。IL-6在炎癥初期可介導(dǎo)急性炎癥反應(yīng)，當(dāng)其作為促炎細(xì)胞因子傳遞炎癥信號時，IL-6為急性炎癥反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)槁匝装Y反應(yīng)提供基礎(chǔ)，因此，IL-6不僅是炎癥反應(yīng)的標(biāo)志指標(biāo)更是治療炎性反應(yīng)的潛在靶標(biāo)[29-30]。IL-1β主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在炎性損傷中表達(dá)[31]，為原型促炎細(xì)胞因子，在疼痛、炎癥和自身免疫性疾病中有著重要作用。一氧化氮(NO)具有高膜滲透性，可快速透過細(xì)胞膜并擴(kuò)散在各個組織中傳遞信號，不僅是炎癥特征指標(biāo)，更是一種促炎因子[32-33]。一氧化氮合酶(NOS)有三種不同的異構(gòu)體，其中iNOS在宿主細(xì)胞中生成大量的NO自由基，從而引起炎性疾病，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡[34]。環(huán)氧合酶(COX)有3種同工酶，其中COX-2為誘導(dǎo)環(huán)氧合酶，在炎癥反應(yīng)過程中，COX-2高度表達(dá)通過催化花生四烯酸氧化成前列腺素H(PGH2)，進(jìn)而合成前列腺素E2(PGE2)誘發(fā)炎癥。因此，COX-2是一種炎癥反應(yīng)的重要標(biāo)志酶[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)，婦科千金方中的藥物在體內(nèi)體外均有顯著的抗炎活性。大葉千斤拔可抑制IκBα降解，下調(diào)iNOS蛋白的表達(dá)，降低LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞引起的TNF-α、IL-6、NO的釋放，并降低慢性盆腔炎大鼠血清中TNF-α、IL-6的濃度，改善子宮和輸卵管的炎癥[7]。穿心蓮成分穿心蓮內(nèi)酯，可通過調(diào)節(jié)TLR4 mRNA的表達(dá)，抑制IκBα的降解與NFκB的活化，降低炎性因子TNF-α、IL-6的分泌，從而改善炎癥反應(yīng)[11]。婦科千金制劑可通過下調(diào)NF-κB、PI3K/Akt信號通路，減少炎癥因子分泌[12-13]。

本研究基于LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞建立體外炎癥模型，采用ELISA、Western blot等方法實驗發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞后，炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β、NO濃度升高，細(xì)胞中iNOS、COX-2蛋白的表達(dá)上調(diào)，與文獻(xiàn)報道一致[35-36]。不同質(zhì)量濃度的婦科千金膠囊預(yù)處理LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞后，可抑制其分泌的TNF-α、IL-6、IL-1β、NO水平，下調(diào)iNOS蛋白表達(dá)，且有劑量依賴性，表明婦科千金膠囊具有良好的體外抗炎活性，且可通過抑制iNOS蛋白的表達(dá)從而抑制NO的分泌，但婦科千金膠囊對LPS誘導(dǎo)引起的COX-2蛋白表達(dá)升高無抑制作用，表明婦科千金膠囊對下調(diào)COX-2蛋白表達(dá)的作用不明顯。

炎癥必然伴隨著氧化應(yīng)激，活化的中性粒細(xì)胞耗氧量增加，活性氧自由基的大量生成，氧化程度超過氧化物清除能力，導(dǎo)致氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)失去平衡，產(chǎn)生大量脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)物，引起組織損傷[16]。機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)，包括GSH、SOD、CAT、GSH-Px等。研究表明，婦科千金方中的藥物在體內(nèi)體外均有顯著的抗氧化活性。Chiang等[37]研究發(fā)現(xiàn)大葉千斤拔提取物可有效清除紫外線誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS，具有抗氧化活性和抗光老化性能。Hsieh等[38]發(fā)現(xiàn)大葉千斤拔水提物可通過抑制增加大鼠肝組織的CAT、SOD、GSH-Px的活性從而減輕由四氯化碳引起的肝組織氧化應(yīng)激，減輕肝損傷。何思蓉等[39]研究發(fā)現(xiàn)穿心蓮中的穿心蓮內(nèi)酯通過調(diào)控HaCaT細(xì)胞中Nrf2/ARE通路發(fā)揮抗氧化作用。本研究發(fā)現(xiàn)RAW 264.7細(xì)胞經(jīng)造模后發(fā)生明顯的氧化應(yīng)激，ROS、MDA升高，GSH水平以及CAT、SOD、GSH-Px活性降低；而不同質(zhì)量濃度的婦科千金膠囊可抑制其升高的ROS、MDA水平，并上調(diào)CAT、SOD、GSH-Px活性，且具有劑量依賴性，表明婦科千金膠囊具有抗氧化應(yīng)激作用，從而保護(hù)LPS刺激巨噬細(xì)胞引起的細(xì)胞損傷。

綜上所述，婦科千金膠囊有良好的體外抗“炎癥-氧化應(yīng)激”作用，可抑制LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6、IL-1β、NO，并可通過抑制iNOS蛋白的表達(dá)抑制NO的釋放，但其無法下調(diào)COX-2蛋白表達(dá)以發(fā)揮抗炎作用；亦可抑制ROS、MDA的生成，上調(diào)GSH水平以及CAT、SOD、GSH-Px活性，增強(qiáng)抗氧化系統(tǒng)，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用。本研究為進(jìn)一步闡釋婦科千金膠囊抗炎機(jī)制、抗氧化應(yīng)激保護(hù)細(xì)胞損傷機(jī)制以及制劑開發(fā)、臨床應(yīng)用提供了一定的實驗依據(jù)。