響鈴草顆粒劑提取、制備工藝的優(yōu)化

王 慶， 孟祥松,2*， 薛天樂， 孫守國

(1.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院，亳州中醫(yī)藥研究所，安徽 亳州 236800；2.亳州學(xué)院中藥學(xué)院，安徽 亳州 236800；3.安徽九洲方圓制藥有限公司，安徽 亳州 236800)

豆科豬屎豆屬植物響鈴草CrotalariaferrugineaGrah主產(chǎn)于貴州、云南、四川等地，民間常用于治療扁桃體炎、久咳痰血、淋巴腺炎、疔毒惡瘡等癥[1]，其提取物具有抗菌、抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、預(yù)防聽力下降等作用，應(yīng)用前景廣闊[2-5]，但尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)制劑方面的報道，也鮮有關(guān)于其提取工藝的研究，大多以總黃酮得率為指標(biāo)進行試驗設(shè)計[6-8]。由于目前響鈴草活性物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確，單一指標(biāo)難以全面反應(yīng)該藥材提取工藝的優(yōu)劣，故本實驗采用正交試驗優(yōu)化其顆粒劑提取、制備工藝，以期為其標(biāo)準(zhǔn)提取物及相關(guān)制劑的開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 試劑與藥物 響鈴草購自亳州市佳旭藥業(yè)有限公司，經(jīng)亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院劉耀武教授鑒定為豆科豬屎豆屬植物響鈴草CrotalariaferrugineaGrah 的干燥全草。蕓香苷對照品(批號100080-201811，純度≥98.0%)購自中國食品藥品檢定研究院。金黃色葡萄球菌購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。營養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基(蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、氯化鈉5 g、瓊脂15 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH調(diào)至7.0，121 ℃、0.1 MPa下滅菌15 min)。其余試劑均為分析純。

1.2 儀器 GIPP-2000型噴霧干燥機(上海繼譜電子科技有限公司)；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市晶玻實驗儀器廠)；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；UV-752型紫外可見分光光度計(上海佑科儀器儀表有限公司)；SW-CJ-1FD型超凈工作臺(上海市純昱科學(xué)儀器有限公司)；HZQ-F160A(C)型高低溫恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)；FA2004N型電子天平(上海箐海儀器有限公司)；HN101-2A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海蘇進儀器設(shè)備廠)。

2 方法

2.1 提取工藝優(yōu)化

2.1.1 浸膏得率測定 取干燥的全草粗粉20 g，石油醚脫脂脫色3次，濾過，棄去濾液，濾渣按照不同設(shè)計工藝進行提取，濾過，濾液減壓濃縮，置于60 ℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干，稱定質(zhì)量，計算浸膏得率，公式為浸膏得率=(浸膏質(zhì)量/藥材質(zhì)量)×100%。

2.1.2 線性關(guān)系考察 準(zhǔn)確稱取蕓香苷對照品17.5 mg，70%乙醇溶解并定容于50 mL量瓶中，即得質(zhì)量濃度為0.35 mg/mL的對照品溶液。硝酸鋁顯色法測定510 nm波長處吸光度(70%乙醇調(diào)零)[9]。以吸光度為縱坐標(biāo)(A)，蕓香苷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進行回歸，得方程為A=0.011 7X-0.002 5(R2=0.999 3)，在0～70 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 總黃酮得率測定 按“2.1.1”項下方法提取浸膏，70%乙醇定容至100 mL量瓶中，即得供試品溶液，取適量稀釋25倍，按“2.1.2”項下方法測定吸光度，計算總黃酮得率，公式為總黃酮得率=(25×C×V×10-6/M)×100%，其中C為總黃酮質(zhì)量濃度，V為供試品溶液總體積，M為干燥粗粉質(zhì)量。

2.1.4 抑菌活性測定 采用打孔擴散法，選擇50%DMF作為提取物溶劑制備陰性對照溶液，以抑菌圈直徑為指標(biāo)評價抗菌活性[10]。在超凈工作臺中將10 μL 金黃色葡萄球菌的菌懸液(2.0×106cfu/mL)注到營養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基平板上，涂布均勻，每個平板上打2個直徑8 mm的小孔，加入100 mg/mL供試品溶液、陰性對照溶液各100 μL，在4 ℃下保存6 h后置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，每種樣品設(shè)2組平行試驗，取平均值，計算抑菌圈直徑，公式為抑菌圈直徑=樣品抑菌圈直徑-對照抑菌圈直徑。

2.1.5 綜合評分計算 參考文獻[1-2,8]，公式為綜合評分=(浸膏得率/最大值)×30+(總黃酮得率/最大值)×40+(抑菌圈直徑/最大值)×30。

2.1.6 正交試驗 根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，以乙醇體積分數(shù)(A)、料液比(B)、提取時間(C)為影響因素，浸膏得率、總黃酮得率、抑菌圈直徑的綜合評分為評價指標(biāo)，優(yōu)化提取工藝，因素水平見表1。

表1 提取工藝因素水平

2.2 制備工藝優(yōu)化

2.2.1 工藝流程 采用濕法制粒[11]。將優(yōu)化提取工藝制成的浸膏粉與輔料按不同比例混合均勻，以不同體積分數(shù)乙醇為潤濕劑制軟材，過16目篩制粒，在不同溫度下烘干，過1、5號篩，即得。

2.2.2 綜合評分計算 參考文獻[12]，公式為綜合評分=(成型率/最大值)×40+(最小值/吸濕率)×50+(最小值/休止角)×10[13-14]。

2.2.3 正交試驗 根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，以浸膏粉、甘露醇、乳糖比例(A)，潤濕劑(乙醇)體積分數(shù)(B)，干燥溫度(C)為影響因素，成型率、吸濕率、流動性的綜合評分為評價指標(biāo)，優(yōu)化制備工藝，因素水平見表2。

表2 制備工藝因素水平

3 結(jié)果

3.1 提取工藝優(yōu)化 表3～4顯示，各因素影響程度由高到低，依次為乙醇體積分數(shù)、料液比、提取時間，以乙醇體積分數(shù)最顯著(P<0.05)，最優(yōu)工藝為乙醇體積分數(shù)70%，料液比1∶40，提取時間1.5 h。

按上述優(yōu)化工藝進行3批驗證試驗，結(jié)果見表5，可知平均綜合評分為96.16，高于表3中的綜合評分，表明該工藝穩(wěn)定可靠，可用于顆粒劑的提取。

表3 提取工藝試驗設(shè)計與結(jié)果

表4 提取工藝方差分析

表5 提取工藝驗證試驗結(jié)果(n=3)

3.2 制備工藝優(yōu)化 表6～7顯示，各因素影響程度，由高到低，依次為浸膏粉、甘露醇、乳糖比例，乙醇體積分數(shù)，干燥溫度，以浸膏粉、甘露醇、乳糖比例最顯著(P<0.05)，最優(yōu)制備工藝為浸膏粉、甘露醇、乳糖比例2∶1∶2，乙醇體積分數(shù)95%，干燥溫度70 ℃。

表6 制備工藝試驗設(shè)計與結(jié)果

表7 制備工藝方差分析

按上述優(yōu)化工藝進行3批驗證試驗，結(jié)果見表8，可知平均綜合評分為98.11，高于表6中的綜合評分，表明該工藝穩(wěn)定可靠，可用于顆粒劑的制備。

表8 制備工藝驗證試驗結(jié)果(n=3)

4 討論

在提取響鈴草的過程中發(fā)現(xiàn)，乙醇體積分數(shù)對最終藥效可能會產(chǎn)生較大影響，乙醇體積分數(shù)不合適時，會造成有效成分難以溶出或雜質(zhì)溶出過多，從而影響藥效；回流提取加熱時間過長時，可能會使中藥中一些有效成分的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致其失活，均應(yīng)予以重視。

甘露醇、乳糖具有良好的吸濕性、矯味功能，尤其適合需要控制血糖的人群使用，但與蔗糖相比價格較貴，所制得顆粒劑的成本較高。今后，可嘗試將響鈴草提取物分別制成含蔗糖、不含蔗糖2種類型的顆粒，以滿足不同人群的需要。

文獻[15]報道，對于同一種中藥而言，不同提取方法造成提取物成分的差異可最終影響其療效。因此，在對中藥(尤其是有效物質(zhì)基礎(chǔ)不明確者)提取工藝進行優(yōu)化時，為保證藥效，并全面反映提取工藝優(yōu)劣，應(yīng)盡可能涉及藥效學(xué)評價指標(biāo)。