丁公藤、大果飛蛾藤投料的馮了性風濕跌打藥酒快速鑒別

劉小妹， 楊媛媛， 胡 靜， 任 慧， 崔小敏， 李 寧， 曲 彤， 陶宏迅，陳志永*

(1.陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710003；2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四○醫(yī)院藥劑科，甘肅 蘭州 730050；3.西安市食品藥品檢驗所，陜西 西安 710054；4.澳門大學中華醫(yī)藥研究院，澳門 999078)

馮了性風濕跌打藥酒是具有400余年歷史的傳世名方，2020年版《中國藥典》(一部)收載該藥由丁公藤、麻黃、桂枝等27味中藥組成[1-2]。該方中丁公藤祛風濕為主藥，配以桂枝、麻黃、羌活等發(fā)散風寒；香附、木香、厚樸等行氣燥濕；小茴香、當歸、川芎等溫經(jīng)活血；白術(shù)、山藥、補骨脂等補肝腎、強腰膝。臨床上主要用于治療風寒濕痹、跌撲損傷等癥[2-3]。

大果飛蛾藤PoranasinensisHemsl為旋花科飛蛾藤屬植物，在我國主要分布于廣西、貴州、云南、湖北、廣東等地[4]。2020年版《中國藥典》規(guī)定中藥丁公藤為旋花科丁公藤屬植物丁公藤ErycibeobtusifoliaBenth或光葉丁公藤ErycibeschmidtiiCraib的干燥藤莖，是我國傳統(tǒng)民間用藥，具有祛風除濕、消腫止痛的功效，是馮了性風濕跌打藥酒的君藥。近年來，由于生態(tài)環(huán)境惡化和過度采挖導致丁公藤、光葉丁公藤野生藥用資源急劇減少，大果飛蛾藤已逐漸成為丁公藤的主流替代品種[5]。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)大果飛蛾藤與丁公藤藥材化學成分高度相似，且具有相近的抗炎、鎮(zhèn)痛藥效，具有作為丁公藤替代品使用的潛力[6]。然而，大果飛蛾藤是否能夠作為丁公藤替代品使用尚需開展更加系統(tǒng)深入的研究。開展使用丁公藤和大果飛蛾藤投料制備的馮了性風濕跌打藥酒的快速鑒別，以及不同投料對抗風濕藥效的影響研究，對于該藥酒的臨床有效性、安全性應(yīng)用意義重大。

本研究采用HPLC指紋圖譜結(jié)合化學模式識別的方法，發(fā)掘出以丁公藤、大果飛蛾藤投料的馮了性風濕跌打藥酒的3種差異性成分和1種專屬性成分，并采用限定成分間峰面積比值的方法實現(xiàn)了不同投料藥酒的快速鑒別。同時，對差異性成分進行網(wǎng)絡(luò)藥理學研究，以期闡明丁公藤、大果飛蛾藤投料對藥酒抗風濕藥效的影響。研究結(jié)果顯著提升了馮了性風濕跌打藥酒的質(zhì)量控制水平，為其臨床應(yīng)用提供保障。

1 材料

1.1 儀器 安捷倫1260型高效液相色譜儀，包括G7114A紫外檢測器、G7129A自動進樣器、G7111A四元泵、OpenLAB CDS色譜工作站(美國安捷倫公司)；KQ-100型超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司)；BT25S、Max21g型電子分析天平(十萬分之一，美國賽多利斯科學儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑 鹽酸麻黃堿(批號171241-201809，純度≥98%)、鹽酸偽麻黃堿(批號171237-201510，純度≥98%)均購自中國食品藥品檢定研究院；東莨菪苷(批號16040805)、東莨菪內(nèi)酯(批號161208)、綠原酸(批號1701904)、隱綠原酸(批號17061401)、新綠原酸(批號17062003)、異綠原酸A(批號18090301)、異綠原酸B(批號17121201)、異綠原酸C(批號18070401)均購自上海圻明生物科技有限公司，純度均不低于98%；桂皮醛(批號wkq19031207，純度≥98%)購自四川維克奇生物有限公司。乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。4批丁公藤藥材，5批大果飛蛾藤樣品，經(jīng)陜西省中醫(yī)藥研究院陳志永副研究員鑒定分別為旋花科植物丁公藤ErycibeobtusifoliaBenth.或光葉丁公藤ErycibeschmidtiiCraib的干燥藤莖，旋花科飛蛾藤屬植物大果飛蛾藤PoranasinensisHemsl.的干燥藤莖。信息見表1。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 供試品溶液 參照2020年版《中國藥典》相關(guān)要求，分別以丁公藤、大果飛蛾藤投料制備馮了性風濕跌打藥酒[2]。9批馮了性風濕跌打藥酒編號為S1～S9，丁公藤投料的藥酒編號記為S1～S4，大果飛蛾藤投料的藥酒編號記為S5～S9。精密量取上述各批馮了性風濕跌打藥酒10 mL，置于20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2 混合對照品溶液 精密稱取各對照品適量，置于25 mL量瓶中，加甲醇制成含鹽酸麻黃堿0.247 5 mg/mL、鹽酸偽麻黃堿0.260 0 mg/mL、新綠原酸0.382 0 mg/mL、東莨菪苷0.390 0 mg/mL、綠原酸0.306 0 mg/mL、隱綠原酸0.476 0 mg/mL、東莨菪內(nèi)酯0.454 0 mg/mL、異綠原酸B 0.463 0 mg/mL、異綠原酸A 0.490 0 mg/mL、異綠原酸C 0.450 0 mg/mL、桂皮醛0.759 0 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2 色譜條件 Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動相乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)，梯度洗脫(0～18 min，6% A；18～80 min，10%～25% A；80～110 min，25%～45% A；110～120 min，45%～70% A)；采用多波長切換模式(14～18 min，210 nm；18～80 min，345 nm；80～120 min，300 nm)；體積流量1.0 mL/min；柱溫25 ℃；進樣量10 μL。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取藥酒(編號S1)適量，在“2.2”項色譜條件下連續(xù)進樣6次。，以東莨菪內(nèi)酯(16號色譜峰)為參照峰，各共有色譜峰相對保留時間、相對峰面積RSD均在3.0%以內(nèi)，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復性試驗 取藥酒(編號S1)適量，按“2.1”項下方法制備6份，在“2.2”項色譜條件下進樣測定。結(jié)果顯示，以東莨菪內(nèi)酯(16號色譜峰)為參照峰，各共有色譜峰相對保留時間、相對峰面積RSD均在3.0%以內(nèi)，表明該方法重復性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取藥酒(編號S1)適量，分別于0、2、4、8、12、24 h在“2.2”項色譜條件下測定，以東莨菪內(nèi)酯(16號色譜峰)為參照峰，各共有色譜峰相對保留時間、相對峰面積RSD均在3.0%以內(nèi)，表明該樣品在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 指紋圖譜建立 取“2.1”項下S1～S9樣品溶液，在“2.2”項色譜條件下測定，9批馮了性風濕跌打藥酒的HPLC色譜圖見圖1。將指紋圖譜信息以AIA(.cdf)格式全譜導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012年版)，以色譜峰保留時間在± 0.2 min內(nèi)且紫外吸收光譜一致為判別標準，設(shè)定時間窗寬度為0.5 min，系統(tǒng)經(jīng)多點校正后自動匹配。S1～S9樣品中共檢出29個不同成分色譜峰，按保留時間順序依次編號為1～29，經(jīng)與對照品S0的圖譜比對，指認了11個色譜峰，分別為鹽酸麻黃堿(7號峰)、鹽酸偽麻黃堿(8號峰)、東莨菪苷(12號峰)、東莨菪內(nèi)酯(16號峰)、綠原酸(13號峰)、隱綠原酸(14號峰)、新綠原酸(9號峰)、異綠原酸A(22號峰)、異綠原酸B(20號峰)、異綠原酸C(24號峰)、桂皮醛(26號峰)。

圖1 9批樣品HPLC指紋圖譜

2.5 差異性成分分析

2.5.1 直觀分析 從圖1中可見，不同投料的馮了性風濕跌打藥酒指紋圖譜存在一定差異，其差異分為組分專屬性差異和組分量的差異[7]。組分專屬性差異主要體現(xiàn)在2個位置，74.50 min處，樣品S5～S9檢測到色譜峰，峰面積分別為120.50、67.20、69.58、70.45、54.42，樣品S1～S4則未檢測到色譜峰；93.00 min處，樣品S5～S9檢出色譜峰，峰面積依次為522.97、251.90、395.50、345.88、256.41，樣品S1～S4則未檢出峰。組分量的差異主要體現(xiàn)在3個色譜峰位置，19.80 min(9號峰)、31.40 min(14號峰)、63.80 min(20號峰)，樣品S5～S9峰面積明顯高于樣品S1～S4。綜上所述，組分專屬性差異體現(xiàn)在2個位置，93.00 min處專屬性特征峰峰面積響應(yīng)較大，74.50 min處專屬峰響應(yīng)值較小，受基線影響可以忽略不計；組分量的差異方面，3個位置均表現(xiàn)出較大的組分量的差異。

2.5.2 PCA分析 PCA分析是對各樣品的峰面積原始數(shù)據(jù)進行降維處理，獲得能夠概括原始信息絕大部分的主成分及貢獻率[8-9]。將不同批馮了性風濕跌打藥酒指紋圖譜信息進行峰對齊、溶劑峰去除等處理后，將其峰面積數(shù)據(jù)導入Markerlynx XS(Waters, Manchester, UK)軟件，進行PCA分析，得到一個含有兩個主成分的模型，見圖2。不同投料的馮了性風濕跌打藥酒自動分為兩組，PC1反映整體信息的39.4%，PC2反映整體信息的21.4%，這表明兩種藥酒成分具有一定差異。

圖2 9批樣品主成分分析圖

2.5.3 PLS-DA分析 PLS-DA是一種有監(jiān)督的模式識別方法，具有直觀、清晰的分析效果及較高的預測精度和強大的解釋能力[10-11]，本研究引入PLS-DA來探討不同投料的馮了性風濕跌打藥酒在成分上的差異。將9批樣品29個共有峰峰面積導入Markerlynx XS分析軟件，啟動PLS-DA分析程序，分別生成得分圖、變量重要性投影值圖(variable importance in projection, VIP)以及差異性成分的平均峰面積柱狀圖，見圖3～5。每個點代表一個樣品，并按照樣品分類自動著色。樣本經(jīng)分析得到兩個主成分的模型，模型的解釋度R2(Y)為98.8%，預測度Q2為89.6%，可以解釋變量的56.5%，這證明該模型解釋能力和預測能力良好。利用VIP分析可以發(fā)掘差異性變量，變量9、14、20的VIP值>1.5，表明變量對模型分類的貢獻具有統(tǒng)計學意義，對區(qū)分不同投料馮了性風濕跌打藥酒作用較大。變量9、14、20分別歸屬為新綠原酸、隱綠原酸和異綠原酸B。

圖3 各樣品PLS-DA得分散點圖

圖4 各樣品VIP投影圖

圖5 3種差異性成分平均峰面積柱狀圖

2.6 鑒別方法 東莨菪內(nèi)酯為2020年版《中國藥典》中丁公藤藥材的質(zhì)控成分，且該成分在大果飛蛾藤中同樣含量較高。同時，東莨菪內(nèi)酯在本研究所建立的馮了性風濕跌打藥酒指紋圖譜中分離效果優(yōu)于其他成分。因此，本研究選擇東莨菪內(nèi)酯為參照物，計算3種差異性成分的峰面積與參照物峰面積的相對比值，結(jié)果見表2。根據(jù)統(tǒng)計分析中用樣本均數(shù)作為總體均數(shù)的點估計值，以均數(shù)加減2倍標準差的數(shù)據(jù)估計總體值(約為95%)，使絕大部分落在可信區(qū)間內(nèi)。以新綠原酸為例，可認為其與東莨菪內(nèi)酯的峰面積比值落在(0.079±0.050)范圍內(nèi)是以丁公藤投料，比值在(0.765±0.546)范圍內(nèi)是以大果飛蛾藤投料。同樣，可認為隱綠原酸與東莨菪內(nèi)酯峰面積比值落在(0.122±0.068)范圍內(nèi)是以丁公藤投料，在(0.888±0.560)范圍內(nèi)是以大果飛蛾藤投料。異綠原酸B與東莨菪內(nèi)酯峰面積比值落在(0.367±0.294)范圍內(nèi)是以丁公藤投料，在(1.894±1.866)范圍內(nèi)是以大果飛蛾藤投料。然而，大果飛蛾藤、丁公藤投料的藥酒中，異綠原酸B與東莨菪內(nèi)酯峰面積比值95%置信區(qū)間大部分重合，因此該項指標無法用于不同投料的藥酒鑒別。綜上，新綠原酸與東莨菪內(nèi)酯峰面積比值，隱綠原酸與東莨菪內(nèi)酯峰面積比值可用于以丁公藤、大果飛蛾藤投料的馮了性風濕跌打藥酒的鑒別，見表2。

表2 丁公藤、大果飛蛾藤投料的馮了性風濕跌打藥酒鑒別指標

2.7 差異性成分網(wǎng)絡(luò)藥理學研究 對篩選得到的差異性成分借助TCMSP[12](https://tcmspw.com/tcmsp.php)、Swiss Target Prediction[13](http://www.swisstargetprediction.ch/)數(shù)據(jù)庫，依據(jù)成分的2D結(jié)構(gòu)進行在線靶點預測，剔除評分值為0的預測靶標，篩選得到活性成分相關(guān)的靶標蛋白。新綠原酸的靶點蛋白有AKR1B1、AKR1B10、MMP13、MMP2、APP、MMP12、ELANE、SLC37A4、PYGL、PRKCD、PRKCA、NEU4、BACE1、PDE4D、PDE9A、PDE1B、ABCB1、PTPN22；隱綠原酸的靶點蛋白有NEU3、NEU2、MGLL；異綠原酸B的靶點蛋白有FYN、SELE、SELP、YARS、HCAR2、PTGDR2、CASP3、PIM1、FOLH1、CASP6、CASP7、CASP8、CASP1。再分別以“Rheumatoid Arthritis(類風濕性關(guān)節(jié)炎)”為檢索詞在Dragbank[14](https://www.drugbank.ca/)、OMIM[15](https://omim.org/)、GeneCards[16](https://www.genecards.org/)、TTD[17](http://db.idrblab.net/ttd/)、Disgenet[18](https://www.disgenet.org/)等在線數(shù)據(jù)庫檢索相應(yīng)的疾病靶點，根據(jù)不同數(shù)據(jù)庫的篩選條件，將篩選結(jié)果歸納合并，去除重復合并后得到2 842個類風濕性關(guān)節(jié)炎的相關(guān)疾病靶標蛋白。利用STRING平臺數(shù)據(jù)庫形成PPI(protein-protein interaction)關(guān)系，隱藏掉一些游離散在的靶點，采用Cytoscape 3.7.2軟件建立“Merged Network”網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓撲學參數(shù)(DC值、BC值、CC值)提取得到Hub核心網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)度值的大小，按從大到小的排序列出排名前10的核心靶點，分別為CASP3、ELANE、MMP2、CASP8、SELP、MMP13、CASP1、MMP12、ABCB1、SELE。在該網(wǎng)絡(luò)關(guān)系中，節(jié)點大小根據(jù)度值從小到大，節(jié)點由小到大；節(jié)點顏色根據(jù)度值從小到大，顏色由暗變亮；節(jié)點間的連線根據(jù)相互作用強度由細到粗，見圖6。

圖6 核心靶點的PPI關(guān)系圖

Excel求取成分和疾病的交集靶點，得到16個交集靶點蛋白，上傳到DAVID 6.8在線數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)進行KEGG信號通路的生物學富集分析[19-21]，KEGG通路富集分析篩選得到40條結(jié)果(P<0.05)，篩選出富集靶點最多的前15條結(jié)果，刪除一些疾病如“癌癥”“乙肝”“類風濕性關(guān)節(jié)炎”等，最終得到MAPK、TNF、Chemokine、Toll-like 4條通路，均參與炎癥反應(yīng)，見圖7。

圖7 差異性成分的KEGG代謝通路富集分析

3 討論

3.1 指紋圖譜條件優(yōu)化 參照課題組前期研究[22]，鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿在210 nm處有最大吸收；新綠原酸、東莨菪苷、綠原酸、隱綠原酸、東莨菪內(nèi)酯、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C在345 nm處有較大吸收；桂皮醛在300 nm處有最大吸收。根據(jù)馮了性風濕跌打藥酒中不同成分的吸收波長，以及實驗過程中指紋圖譜體現(xiàn)的色譜峰信息，最終選擇了本研究采用的波長切換方法。

3.2 指紋圖譜模式識別及鑒定方法 共標定了29個共有峰，相似度在0.9以上，表明不同批樣品具有較強的一致性，這證明采用大果飛蛾藤作為丁公藤替代品投料，在實際應(yīng)用中較難鑒別。PCA分析將9批樣品自動分為丁公藤投料和大果飛蛾藤投料2類，PLS-DA分析證實了PCA分類結(jié)果，且模型擬合程度較好，具有較強的預測性。利用VIP分析發(fā)掘差異性變量，分別為新綠原酸、隱綠原酸和異綠原酸B。但3種差異性成分在丁公藤、大果飛蛾藤投料的馮了性風濕跌打藥酒中均有分布，僅存在含量上的差異，這為不同投料藥酒的鑒別帶來困難。

本研究探索將差異性成分與不同投料藥酒中標志性成分的峰面積比值范圍，用于藥酒的快速鑒別。3種差異性成分中，新綠原酸、隱綠原酸指紋圖譜色譜行為較好，不同投料藥酒中新綠原酸、隱綠原酸與東莨菪內(nèi)酯峰面積的比值95%置信區(qū)間不存在重合，故此選擇此2個指標用于藥酒的快速鑒別。采用規(guī)定峰面積比值范圍的鑒別方法相比含量測定法更為簡便、快捷，且能夠克服在藥酒制備過程中藥材吸附，轉(zhuǎn)移過程中藥液損失等造成的成分含量的差異。指紋圖譜中93.00 min處的專屬峰，未能通過標準品比對實現(xiàn)鑒定，因此僅作為采用峰面積比值范圍鑒定的補充。

3.3 差異性成分網(wǎng)絡(luò)藥理學研究 本研究通過構(gòu)建成分-疾病-蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)相互作用關(guān)系圖，提取出核心網(wǎng)絡(luò)，篩選出度值排名前10的核心網(wǎng)絡(luò)靶點。通過KEGG分析得到差異性成分治療類風濕性關(guān)節(jié)炎所作用的信號通路。MAPK信號通路被激活后參與細胞免疫調(diào)節(jié)，炎癥反應(yīng)及細胞增殖、凋亡等生物學過程，同時參與多種應(yīng)激反應(yīng)的信號傳導[23]。秦理等[24]發(fā)現(xiàn)阻斷MAPK通路，能夠抑制類風濕關(guān)節(jié)炎成纖維細胞樣滑膜細胞的遷徙與侵襲，有助于減輕類風濕關(guān)節(jié)炎的嚴重程度。TNF是炎癥細胞因子的重要成員，研究發(fā)現(xiàn)TNF-α與類風濕關(guān)節(jié)炎病變密切相關(guān)[25]。TLR是一種天然免疫識別受體，激活Toll-like信號通路可導致各種炎癥性因子表達升高[26]。類風濕關(guān)節(jié)炎患者外周血單核細胞、滑膜組織、滑液等均存在TLRs表達增加[27]。采用丁公藤替代品大果飛蛾藤投料制得的馮了性風濕跌打藥酒中新綠原酸、隱綠原酸和異綠原酸B的含量顯著高于丁公藤藥材投料制得的藥酒，而此3種差異性成分主要通過作用于MAPK、TNF、Chemokine、Toll-like 4條信號通路發(fā)揮抗風濕藥效，這提示采用兩種藥材投料制備的藥酒在作用于此4條通路上存在一定藥效差異。當然，網(wǎng)絡(luò)藥理學研究的結(jié)果仍需進一步的藥效學研究進行驗證。

表2中規(guī)定的鑒別范圍，由于采用少數(shù)樣品來估計總體值，不排除存在離群值及抽樣誤差，但以此為突破口，為快速鑒定不同投料馮了性風濕跌打藥酒提供了可能。丁公藤、光葉丁公藤樣本極難采收，這為本研究帶來了客觀困難，后續(xù)課題組將持續(xù)采收丁公藤藥材，以為本研究提供更多的數(shù)據(jù)支撐。