川芎化學(xué)成分及其抑制子宮平滑肌收縮作用(Ⅱ)

馮 芮， 彭 成， 周 飛， 郭 力， 劉 娟*， 熊 亮*

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院省部共建西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611137；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)西南特色藥材創(chuàng)新藥物成分研究所，四川 成都 611137)

川芎為傘形科藁本屬多年生草本植物L(fēng)igusticumstriatumDC.(同名Ligusticumchuanxiong)的干燥根莖，為著名川產(chǎn)道地藥材。其性辛、溫，歸肝、膽、心包經(jīng)，具有祛風(fēng)止痛、活血行氣的功效。川芎生物堿是川芎重要的活性部位，在心腦血管保護(hù)[1-2]、抗偏頭痛[3]、抗血小板聚集[4]、神經(jīng)保護(hù)[5]和抑制子宮平滑肌收縮[6]等方面發(fā)揮著重要作用，目前針對(duì)川芎生物堿成分的研究主要集中在川芎嗪，對(duì)于其他生物堿成分研究較少，截止目前，僅報(bào)道了20余種生物堿類成分[7-10]，因此，針對(duì)川芎生物堿類成分研究具有較好的創(chuàng)新性。本課題組前期首次發(fā)現(xiàn)其能顯著抑制子宮平滑肌收縮[6]。但川芎生物堿抑制子宮平滑肌的物質(zhì)基礎(chǔ)尚不清楚，課題組又進(jìn)一步明確了二酮哌嗪生物堿是抑制子宮平滑肌收縮的物質(zhì)基礎(chǔ)[10]。為進(jìn)一步完善和豐富川芎生物堿類成分，彌補(bǔ)川芎抑制子宮平滑肌物質(zhì)基礎(chǔ)研究的匱乏，本課題組對(duì)川芎生物堿部位進(jìn)行持續(xù)研究，從中獲得了10個(gè)生物堿化合物，并結(jié)合縮宮素致大鼠離體子宮平滑肌收縮模型考察其對(duì)子宮平滑肌收縮活動(dòng)的影響，發(fā)現(xiàn)化合物2、5在50 μmol/L時(shí)具有抑制大鼠離體子宮平滑肌收縮作用。

1 材料

1.1 儀器 Búchi Gradient Former B-687中壓液相色譜儀(瑞士Búchi公司)；Agilent 1220型半制備型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；Bruker AVANCE NEO-600 核磁共振波譜儀、Bruker AVANCE NEO-700 核磁共振波譜儀(德國(guó)Bruker公司)；D101大孔吸附樹脂(成都科龍化工試劑廠)；732型陽離子交換樹脂(河北華偉樹脂廠)；柱層析硅膠(200～300目，青島海洋硅膠干燥劑廠)；葡聚糖凝膠Sephadex LH-20(40～70 μm，瑞典Amersham Pharmacia公司)；薄層層析硅膠GF254(青島海洋硅膠干燥劑廠)；高效薄層GF254、硅膠制備薄層(煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司)；FA2004B電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)；Powerlab多功能生理記錄儀、恒溫水浴槽和Labchart Pro專業(yè)版軟件[澳大利亞埃德儀器國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司]；DZKW-S-4電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)。

1.2 試劑 95%乙醇、正丁醇、氨水、甲醇、二氯甲烷、二甲亞砜等分析純?cè)噭?成都科隆化工試劑廠)；色譜甲醇，4 L/瓶(美國(guó)Sigma公司)；顯色劑碘蒸氣、改良碘化鉍鉀試劑(上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司)?？s宮素注射液(江西省創(chuàng)欣藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)191011，規(guī)格2 mL:10單位，使用時(shí)用生理鹽水配成 1 U/mL)；戊酸雌二醇片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，批號(hào)498A，規(guī)格1 mg/片，使用時(shí)用純水制備成0.8 mg/mL)。

1.3 藥材 川芎飲片由四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司提供，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)高繼海副教授鑒定為傘形科多年生草本植物川芎LigusticumstriatumDC.的根莖，標(biāo)本(LC-20161030)現(xiàn)保存在成都中醫(yī)藥大學(xué)“省部共建西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”。

1.4 動(dòng)物 健康未孕成年SD大鼠，普通級(jí)，雌雄，體質(zhì)量220～250 g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(川)2015-030]。

2 提取與分離

100 kg干燥川芎，煎煮3次(每次8倍量純水，2.5 h)，合并水煎液濃縮后得到川芎水提取物(28.8 kg)。該水提物用正丁醇萃取，濃縮后得到正丁醇萃取物(9.3 kg)。正丁醇萃取物再用D101大孔吸附樹脂進(jìn)行分離，用0%、10%、30%、50%、70%、95%乙醇進(jìn)行梯度洗脫，濃縮后得到6個(gè)洗脫部位。取30%乙醇水洗脫部位(701 g)用離子交換樹脂進(jìn)行生物堿富集，依次用純水、75%乙醇、75%氨水乙醇梯度洗脫，回收溶劑得到3個(gè)洗脫部分。將75%氨水乙醇部分(120 g)采用硅膠柱色譜，以二氯甲烷-甲醇(100∶1～0∶1)洗脫，獲得9個(gè)餾分(F1～F9)。

采用反相中壓液相色譜分離餾分F6，甲醇溶液(10%～100%)梯度洗脫后得到9個(gè)洗脫部分(F6-a～F6-i)，F(xiàn)6-c采用反相Sephadex LH-20柱，以85%甲醇水溶液洗脫后得到7個(gè)部分(F6-c-1～F6-c-7)，F(xiàn)6-c-2經(jīng)硅膠柱，用二氯甲烷-甲醇(80∶1～0∶100)梯度洗脫得到5個(gè)部分(F6-c-2a～F6-c-2e)，F(xiàn)6-c-2a經(jīng)反相半制備高效液相色譜，以甲醇-水(30∶70)處理后得化合物1(3.0 mg)、2(2.7 mg)。F6-c-2b經(jīng)制備薄層色譜，以二氯甲烷-甲醇(13∶1)洗脫和反相半制備高效液相色譜(46%甲醇-水溶液)處理后得化合物3(1.0 mg)、4(2.8 mg)。F6-c-3經(jīng)硅膠柱，以二氯甲烷-甲醇(80∶1～0∶100)梯度洗脫得到6個(gè)部分(F6-c-3a～F6-c-3f)，F(xiàn)6-c-3b經(jīng)制備薄層色譜，二氯甲烷-甲醇(10∶1)洗脫和反相半制備高效液相(40%甲醇-水溶液)處理后得化合物5(4.3 mg)、6(0.8 mg)、7(3.1 mg)。F6-c-4經(jīng)硅膠柱，用二氯甲烷-甲醇(100∶1～0∶100)梯度洗脫得到8個(gè)部分(F6-c-4a～F6-c-4h)，F(xiàn)6-c-4c經(jīng)制備薄層色譜，以二氯甲烷-甲醇(10∶1)洗脫和反相半制備高效液相色譜(50%甲醇-水溶液)處理后得化合物8(0.7 mg)。F6-c-5經(jīng)硅膠柱，以二氯甲烷-甲醇(100∶1～0∶100)梯度洗脫得到7個(gè)部分(F6-c-5a～F6-c-5g)，F(xiàn)6-c-5b和F6-c-5d經(jīng)反相半制備高效液相色譜，分別以甲醇-水(62∶38)和甲醇-水(60∶40)處理后得到化合物9(0.9 mg)、10(3.2 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色粉末，易溶于甲醇；碘蒸熏顯黃色，改良碘化鉍鉀顯藍(lán)色。ESI-MSm/z：257.1[M+Na]+，分子式C12H14N2O3。1H-NMR(CD3OD，600 MHz)δ：7.34～7.21(5H，m，H-10，11，12，13，14)，4.24～4.20(1H，m，H-3)，3.85～3.82(1H，m，H-6)，3.44(1H，dd，J=3.6，11.4 Hz，H-7a)，3.24(1H，dd，J=6.6，13.8 Hz，H-8a)，3.12(1H，dd，J=4.8，13.8 Hz，H-8b)，2.88(1H，dd，J=6.0，10.8 Hz，H-7b)；13C-NMR(CD3OD，150 MHz)δ：169.5(C-5)，168.2(C-2)，137.3(C-9)，131.3(2C，C-10，14)，129.7(2C，C-11，13)，128.2(C-12)，64.7(C-7)，58.7(C-6)，57.6(C-3)，41.6(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致，故鑒定為環(huán)(L-苯丙氨酸-L-絲氨酸)。

化合物2：白色粉末，易溶于甲醇；碘蒸熏顯黃色，改良碘化鉍鉀顯藍(lán)色。ESI-MSm/z：257.1[M+Na]+，分子式C12H14N2O3。1H-NMR(CD3OD，600 MHz)δ：7.31～7.21(5H，m，H-10，11，12，13，14)，4.31(1H，t，J=4.2 Hz，H-3)，3.75(1H，dd，J=3.6，11.4 Hz，H-7a)，3.56(1H，dd，J=3.6，11.4 Hz，H-7b)，3.26(1H，dd，J=4.2，13.8 Hz，H-8a)，3.05～2.98(2H，m，H-6，8b)；13C-NMR(CD3OD，150 MHz)δ：170.2(C-5)，169.1(C-2)，136.5(C-9)，131.5(2C，C-10，14)，129.5(2C，C-11，13)，128.3(C-12)，63.5(C-7)，57.6(C-6)，57.3(C-3)，40.4(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致，故鑒定為環(huán)(D-苯丙氨酸-L-絲氨酸)。

化合物3：白色粉末，易溶于甲醇；碘蒸熏顯黃色，改良碘化鉍鉀顯藍(lán)色。ESI-MSm/z：298.1[M+Na]+，分子式C14H17N3O3。1H-NMR(CD3OD，600 MHz)，δ:7.29(2H，t，J=7.2 Hz，H-14，16)，7.24(1H，t，J=7.2 Hz，H-15)，7.21(2H，d，J=7.2 Hz，H-13，17)，4.33(1H，t，J=4.8 Hz，H-3)，3.81(1H，t，J=6.0 Hz，H-6)，3.31(1H，m，H-11a)，2.95(1H，dd，J=4.8，13.8 Hz，H-11b)，1.84(2H，t，J=8.4，CH2-8)，1.30(1H，m，H-7a)，1.00(1H，m，H-7b)；13C-NMR(CD3OD，150 MHz)δ：174.2(C-9)，169.3(C-5)，169.0(C-2)，136.7(C-12)，131.7(2C，C-13，17)，129.6(2C，C-14，16)，128.5(C-15)，57.4(C-3)，54.8(C-6)，40.0(C-11)，30.4(C-8)，30.0(C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道基本一致，故鑒定為環(huán)(L-苯丙氨酸-L-谷氨酰胺)。

化合物4：白色粉末，易溶于甲醇；碘蒸熏顯黃色，改良碘化鉍鉀顯藍(lán)色。ESI-MSm/z：241.1[M+Na]+，分子式C13H18N2O。1H-NMR(CD3OD，600 MHz)δ：7.30～7.24(2H，m，H-11，15)，7.24～7.19(3H，m，H-12，13，14)，4.31(1H，t，J=5.4 Hz，H-2)，3.64(1H，d，J=4.2 Hz，H-5)，3.23(1H，dd，J=5.4，13.8 Hz，H-6a)，3.04(1H，dd，J=4.8，13.8 Hz，H-6b)，1.64(1H，m，H-7)，0.79(3H，d，J=6.6 Hz，CH3-8)，0.43(3H，d，J=6.6 Hz，CH3-9)；13C-NMR(CD3OD，150 MHz)δ：169.4(C-4)，137.1(C-10)，131.5(2C，C-11，15)，129.6(2C，C-12，14)，129.2(C-13)，61.3(C-5)，57.3(C-2)，40.1(C-6)，33.3(C-7)，19.1(C-8)，17.1(C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道基本一致，故鑒定為2-isopropyl-5-phenylmethyl-imidazolidinone-4-one。

化合物5：白色粉末，易溶于甲醇，碘蒸熏顯黃色，改良碘化鉍鉀顯藍(lán)色。ESI-MSm/z：241.1[M+Na]+，分子式C12H14N2O2。1H-NMR(CD3OD，600 MHz)δ：7.33～7.19(5H，m，H-10，11，12，13，14)，4.31(1H，t，J=4.2 Hz，H-3)，3.76(1H，q，J=7.2，13.8 Hz，H-6)，3.28(1H，dd，J=4.2，13.8 Hz，H-8a)，2.96(1H，q，J=4.2，13.8 Hz，H-8b)，0.52(1H，d，J=7.2 Hz，CH3-7)；13C-NMR(CD3OD，150 MHz)δ：170.6(C-2)，168.5(C-5)，136.6(C-9)，131.8(2C，C-10，14)，129.5(2C，C-11，13)，128.3(C-12)，57.4(C-6)，51.7(C-3)，40.3(C-8)，20.4(C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道基本一致，故鑒定為環(huán)(L-苯丙氨酸-L-丙氨酸)。

化合物6：白色粉末，易溶于甲醇；碘蒸熏顯黃色，改良碘化鉍鉀顯藍(lán)色。ESI-MSm/z：299.1[M+Na]+，分子式C15H20N2O3。1H-NMR(CD3OD，600 MHz)δ：7.02(2H，d，J=8.4 Hz，H-13，17)，6.70(2H，d，J=7.8 Hz，H-14，16)，4.26(1H，m，H-3)，3.70(1H，m，H-6)，3.18(1H，dd，J=4.2，13.8 Hz，H-11a)，2.89(1H，dd，J=6.4，13.8 Hz，H-11b)，1.41(1H，m，H-7)，1.18(1H，m，CH2-9)，0.76(3H，d，J=6.6 Hz，CH3-8)，0.71(3H，t，J=7.2 Hz，CH3-10)；13C-NMR(CD3OD，150 MHz)δ：170.0(C-5)，167.9(C-2)，157.0(C-15)，132.6(2C，C-13，17)，127.2(C-12)，116.3(2C，C-14，16)，60.9(C-6)，57.5(C-3)，39.8(C-7)，38.9(C-11)，24.7(C-9)，15.4(C-8)，11.9(C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道基本一致，故鑒定為環(huán)(L-酪氨酸-L-亮氨酸)。

化合物7：白色粉末，易溶于甲醇；碘蒸熏顯黃色，改良碘化鉍鉀顯藍(lán)色。ESI-MSm/z：333.1[M+Na]+，分子式C18H18N2O3。1H-NMR(CD3OD，600 MHz)δ：7.34(2H，t，J=7.2 Hz，H-17，19)，7.25(1H，t，J=7.2 Hz，H-18)，7.11(2H，d，J=7.2 Hz，H-16，20)，6.94(2H，d，J=7.8 Hz，H-9，13)，6.76(2H，t，J=7.8 Hz，H-10，12)，4.07(1H，m，H-3)，4.05(1H，m，H-6)，2.81(1H，dd，J=4.2，13.8 Hz，H-14a)，2.72(1H，dd，J=3.6，13.8 Hz，H-7a)，2.19(1H，dd，J=6.6，13.8 Hz，H-7b)，2.10(1H，dd，J=7.2，13.8 Hz，H-14b)；13C-NMR(CD3OD，150 MHz)δ：169.2(C-5)，169.1(C-2)，157.9(C-11)，137.3(C-15)，132.3(2C，C-9，13)，131.1(2C，C-16，20)，129.8(2C，C-17，19)，128.2(C-18)，127.6(C-8)，116.5(2C，C-10，12)，57.7(C-6)，57.5(C-3)，41.2(C-14)，40.2(C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道基本一致，故鑒定為環(huán)(L-苯丙氨酸-L-酪氨酸)。

化合物8：白色粉末，易溶于甲醇；碘蒸熏顯黃色，改良碘化鉍鉀顯橘紅色。ESI-MSm/z：147.1[M+H]+，分子式C8H6N2O。1H-NMR(CD3OD，600 MHz)δ：8.24(1H，dd，J=1.8，7.8 Hz，H-5)，8.10(1H，s，H-2)，7.85(1H，td，J=1.2，7.8 Hz，H-6)，7.71(1H，d，J=7.8 Hz，H-8)，7.57(1H，td，J=1.2，7.8 Hz，H-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道基本一致，故鑒定為4(3H)-喹唑酮。

化合物9：白色粉末，易溶于甲醇；碘蒸熏顯黃色，改良碘化鉍鉀顯橘紅色。ESI-MSm/z：146.1[M+H]+，分子式C9H7NO。1H-NMR(CD3OD，700 MHz)δ：8.52(1H，d，J=2.8 Hz，H-2)，7.91(1H，d，J=7.7 Hz，H-8)，7.75(1H，m，H-5)，7.55～7.49(3H，m，H-4，6，7)；13C-NMR(CD3OD，175 MHz)δ：152.7(C-3)，144.5(C-8a)，143.6(C-2)，131.0(C-4a)，128.8(C-8)，128.3(C-6)，127.7(C-7)，127.6(C-5)，117.9(C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道基本一致，故鑒定為3-羥基喹啉。

化合物10：白色粉末，易溶于甲醇；碘蒸熏顯黃色，改良碘化鉍鉀顯橘紅色。ESI-MSm/z：169.1[M+H]+，分子式C11H8N2。1H-NMR(CD3OD，700 MHz)δ：8.96(1H，s，H-4)，8.28(1H，m，H-7)，8.04(1H，m，H-8)，7.62(1H，d，J=3.5 Hz，H-2)，7.61～7.56(2H，m，H-6，9)，7.13(1H，d，J=3.5 Hz，H-1)；13C-NMR(CD3OD，175 MHz)δ：142.8(C-5a)，138.6(C-4)，130.6(C-9b)，130.1(C-3a)，129.4(C-2)，129.1(C-8)，127.2(C-6)，127.0(C-9)，125.1(C-9a)，124.4(C-7)，101.8(C-1)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道基本一致，故鑒定為marinoquinoline K。

4 對(duì)大鼠離體子宮平滑肌收縮活動(dòng)的影響

川芎生物堿成分對(duì)縮宮素致子宮平滑肌收縮活動(dòng)影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，見表1，與空白組比較，化合物2、5對(duì)子宮平滑肌收縮活動(dòng)影響較小，僅在50 μmol/L時(shí)表現(xiàn)出對(duì)子宮平滑肌收縮張力有影響(P<0.05)，12.5、25 μmol/L濃度下對(duì)子宮平滑肌收縮作用均不明顯(P>0.05)。本研究結(jié)果與前期基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，進(jìn)一步明確了二酮哌嗪生物堿是抑制子宮平滑肌收縮的物質(zhì)基礎(chǔ)。

表1 各化合物對(duì)子宮平滑肌收縮活動(dòng)的影響

5 討論

本實(shí)驗(yàn)遵循川芎傳統(tǒng)使用方法，持續(xù)對(duì)其水煎液進(jìn)行研究，從水煎液正丁醇部位中獲得10個(gè)生物堿類化合物，這些生物堿均為首次從川芎中分離得到，包含6個(gè)二酮哌嗪類生物堿(1～3、5～7)、1個(gè)咪唑啉酮類(4)、1個(gè)喹唑酮類(8)以及2個(gè)喹啉類生物堿(9～10)。其中，與大部分生物堿的碘化鉍鉀顯橘紅色不同的是，二酮哌嗪多顯藍(lán)色，可為后續(xù)二酮哌嗪的快速分離提供參考。川芎生物堿作為川芎的重要活性部位，具有腦保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)、抗偏頭痛、抗心肌缺血、舒張子宮平滑肌等多種藥理活性。而目前主要針對(duì)吡嗪類生物堿川芎嗪進(jìn)行廣泛而深入的研究，包括提取工藝、含量測(cè)定、人工合成、活性機(jī)制等，其他生物堿研究報(bào)道很少，相較于之前報(bào)道的20余個(gè)生物堿化合物[7-10]，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步豐富了川芎化學(xué)成分，以期彌補(bǔ)川芎生物堿類成分報(bào)道的缺乏。

二酮哌嗪是廣泛存在于自然界的最小環(huán)肽類化合物，現(xiàn)代藥理研究表明二酮哌嗪類生物堿具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒等多種藥理活性。本課題組前期發(fā)現(xiàn)川芎生物堿對(duì)子宮平滑肌收縮具有顯著的抑制作用，并發(fā)現(xiàn)其中的活性成分(二酮哌嗪生物堿)，本實(shí)驗(yàn)在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)之上，考察了川芎生物堿成分抑制子宮平滑肌收縮活性，并發(fā)現(xiàn)化合物2、5也具有一定的舒張子宮平滑肌作用，進(jìn)一步明確了二酮哌嗪生物堿是抑制子宮平滑肌收縮的物質(zhì)基礎(chǔ)，以期為闡釋川芎傳統(tǒng)功效提供參考。