加味龜鹿二仙膠湯對肺癌耐藥裸鼠化療藥敏性的改善作用

師 林， 黃圓圓， 柯 斌*

(1.南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院中醫(yī)科，廣東 廣州 510282；2.中山大學腫瘤防治中心中醫(yī)科，廣東 廣州 510060)

肺癌是臨床上常見的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占所有肺癌病例的85%左右，由于現(xiàn)代環(huán)境和生活方式的改變，其發(fā)病率也在增加，已成為嚴重威脅人類生命和健康的疾病。隨著化療技術(shù)的不斷成熟，對肺癌的治療效果大大提高，但5年總生存率僅為10%～15%，長期療效較差[1]。研究表明，以順鉑為代表的含鉑方案是晚期NSCLC的標準輔助治療策略，但其化療耐藥會影響患者的臨床療效[2]。

腫瘤中調(diào)節(jié)性T(Treg)細胞的增加會形成免疫抑制性微環(huán)境，從而降低抗腫瘤能力，促進腫瘤生長[3]。肺癌耐藥相關(guān)基因(P-gp、MRP1)的表達在肺癌耐藥中扮演了重要的角色[4]，IL-7介導的JAK3/STAT5信號通路在NSCLC順鉑耐藥中發(fā)揮了重要作用[5]，因此，探索新的逆轉(zhuǎn)NSCLC順鉑耐藥的藥物或方法已成為當前臨床研究的重要方向。中醫(yī)藥在調(diào)節(jié)免疫、逆轉(zhuǎn)肺癌化療耐藥、減輕化療毒性反應方面療效確切，本實驗建立氣陰兩虛型肺癌耐藥裸鼠模型，觀察加味龜鹿二仙膠湯對其抗腫瘤活性，以及改善肺癌順鉑化療耐藥的機制，以期為后續(xù)相關(guān)研究提供參考。

1 材料

1.1 藥物 加味龜鹿二仙膠湯由西洋參15 g、沙參30 g、黃芪30 g、龜板15 g(先煎30 min)、枸杞子15 g、鹿角膠15 g(烊化)、阿膠15 g(烊化)、當歸6 g、三七10 g組成，常規(guī)水煎2次，合并煎液，雙層紗布過濾，水浴濃縮至含生藥量1 g/mL，濃縮后置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。所有藥材均購自南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院中藥房，經(jīng)南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院中醫(yī)科孫曉敏教授鑒定為正品；順鉑(cisplatin，DDP)購自南京制藥廠有限公司，批號H20103216。

1.2 動物與瘤株 50只SPF級Balb/c裸鼠，4～5周齡，體質(zhì)量13～15 g，購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(粵)2016-0041，實驗動物使用許可證號SYXK(粵)2016-0167，飼養(yǎng)于溫度(20±2)℃、相對濕度36%的屏障環(huán)境中，自由攝食飲水。肺癌耐順鉑細胞株(A549/DDP)，由中山大學動物實驗中心提供。

1.3 儀器與試劑 超凈工作臺(蘇州賽恩斯儀器有限公司，型號ESCOACB-4A1)；光學顯微鏡(日本Olympus公司，型號CX23)；電子天平(沈陽龍騰電子有限公司，型號B200-3)；臺式離心機(德國Sigma公司，型號Sigma 1-14 K)；多功能酶標儀(德國BMG公司，型號LUMIstar Omega)；流式細胞儀(美國Thermo Fisher Scientific公司，型號Attune NxT)；PCR基因擴增儀、電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司，型號伯樂T100、伯樂1645050、Trans-Blot Turbo)。FITC anti-mouse CD4抗體、PE anti-mouse CD2抗體(美國Biolegend公司，批號100405、100107)；IL-7 ELISA試劑盒(英國Abcam公司，批號K1051-100)；反轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒(美國Invitrogen公司，批號K1622)；Phospho-JAK3抗體、Phospho-STAT5抗體(美國CST公司，批號5031T、4322T)。

2 方法

2.1 模型建立 氣陰兩虛型小鼠模型制備方法參考文獻[6]，癥狀表現(xiàn)為精神萎靡，反應遲鈍，少動，毛色略有干枯、發(fā)黃，體質(zhì)量下降，攝食量減少，飲水量增加，小便黃，大便秘結(jié)。肺癌耐藥裸鼠模型建立方法參考文獻[7]進行，A549/DDP肺癌細胞在37 ℃下復蘇后14 000 r/min離心，棄去上清液，以1×107/mL的細胞密度稀釋成懸浮液，取0.2 mL，皮下接種至裸鼠左前腋窩皮下，造模后5～7 d皮下可明顯捫及腫瘤，表明造模成功。

2.2 分組與給藥 50只荷瘤裸鼠按體質(zhì)量隨機分為5組，每組10只，分別為正常對照組，正常飼養(yǎng)，不造模；模型組，給予生理鹽水灌胃，0.4 mL/只，持續(xù)3周；順鉑組，腹腔注射順鉑(2 mg/kg)，每周2次，共6次；中藥組，按照臨床等效劑量(根據(jù)人和動物按表面積折算的等效劑量比率表計算[8])，給予灌胃加味龜鹿二仙膠湯19.63 g/kg，持續(xù)用藥3周；中藥+順鉑組，即聯(lián)合組，給予加味龜鹿二仙膠湯19.63 g/kg，持續(xù)用藥3周，同時腹腔注射順鉑(2 mg/kg)，每周2次，共6次。

2.3 指標檢測

2.3.1 一般情況 給藥后，每天觀察各組裸鼠食欲、大便、毛色、活動等狀況。

2.3.2 脾臟指數(shù)、抑瘤率 在第22天頸椎脫臼處死裸鼠，切除腫瘤，分離脾臟組織，計算脾臟指數(shù)、腫瘤抑制率，公式為脾臟指數(shù)=(脾臟質(zhì)量/體質(zhì)量)×100%、抑瘤率=[(模型組平均瘤質(zhì)量-實驗組平均瘤質(zhì)量)/模型組平均瘤質(zhì)量]×100%。

2.3.3 CD4+CD25+Treg細胞比例 第22天頸椎脫臼處死裸鼠，眼科剪分離取出脾臟，放置在200目不銹鋼網(wǎng)上，注射器針芯輕輕研壓脾臟，得到細胞懸液，通過流式細胞儀檢測CD4+CD25+Treg細胞比例。

2.3.4 血清IL-7水平 第22天裸鼠眼眶取血，3 000 r/min離心5 min，采用ELISA法檢測血清IL-7水平。

2.3.5 腫瘤組織中耐藥相關(guān)基因(P-gp、MRP1)表達 采用RT-qPCR法，按照Trizol試劑盒說明書提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄程序為42 ℃ 30 min，85 ℃ 10 min；定量PCR反應程序為95 ℃ 3 min，95 ℃ 12 s，62 ℃ 40 s，共40個循環(huán)，以GAPDH的CT值作內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法進行樣本分析。引物序列為P-gp正向5′-AGCAGAGGATCGCCATTGC-3′，反向5′-CTGAACCACTGCTTCGCTTTC-3′，片段長度105 bp；MRP1正向5′-GCTGTGAAGACCCAGG AGAG-3′，反向5′-AAGCACCAGGAAACCACTTG-3′，片段長度123 bp；GAPDH正向5′-AGAAGGC TGGGGCTCATTTG-3′，反向5′-AGGGGCCATCCA CAGTCTTC-3′，片段長度258 bp。

2.3.6 腫瘤組織中JAK3/STAT5信號通路的蛋白表達 采用Western blot法，含蛋白酶抑制劑混合物的RIPA緩沖液裂解細胞，提取腫瘤組織總蛋白，BCA蛋白檢測試劑盒檢測其濃度，10%SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠分離等量蛋白，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%BSA封閉，與一抗(1∶300)4 ℃孵育過夜，洗膜后辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(1∶400)孵育1 h，通過ECL化學發(fā)光試劑盒檢測蛋白信號，通過Image J軟件進行定量，以GAPDH為內(nèi)參蛋白。

3 結(jié)果

3.1 一般情況 氣陰兩虛型肺癌模型組裸鼠出現(xiàn)毛色干枯、發(fā)黃、脫毛，精神狀態(tài)較差，反應遲鈍，倦臥懶動，體質(zhì)量下降，攝食量減少，飲水量增加，小便黃，大便秘結(jié)等典型的氣陰兩虛癥狀；順鉑組除了上述氣陰兩虛癥狀外，還有不同程度的嘔吐，整體狀態(tài)比模型組差；中藥組及聯(lián)合組精神狀態(tài)較好，反應靈敏，毛色光亮，活動增多，攝食量增加，體質(zhì)量增加，小便顏色正常，大便接近正常。

3.2 脾臟指數(shù) 由表1可見，模型組脾臟指數(shù)較正常對照組降低(P<0.01)；中藥組脾臟指數(shù)較模型組升高(P<0.05，P<0.01)；聯(lián)合組脾臟指數(shù)較順鉑組升高(P<0.01)。

表1 各組脾臟指數(shù)

3.3 抑瘤率 由表2可見，順鉑組、聯(lián)合組瘤重較模型組下降(P<0.01)；中藥組抑瘤率較順鉑組下降(P<0.01)，聯(lián)合組抑瘤率較順鉑組升高(P<0.01)。

表2 各組腫瘤質(zhì)量及抑瘤率

3.4 脾臟CD4+CD25+Treg/CD4+細胞比值 由表3可見，模型組脾臟CD4+CD25+Treg/CD4+細胞比值高于正常對照組(P<0.01)；中藥組、聯(lián)合組CD4+CD25+Treg/CD4+細胞比值低于模型組(P<0.01)；中藥組、聯(lián)合組CD4+CD25+Treg/CD4+細胞比值較順鉑組降低(P<0.01)。

表3 各組脾臟CD4+ CD25+Treg/CD4+細胞比值

3.5 血清IL-7水平 由表4可見，與正常對照組比較，模型組IL-7水平降低(P<0.01)；與模型組比較，順鉑組IL-7水平降低(P<0.01)；與順鉑組比較，中藥組、聯(lián)合組IL-7水平升高(P<0.01)。

表4 各組血清IL-7水平

3.6P-gp、MRP1 mRNA表達 由圖1可見，與正常對照組比較，模型組P-gp、MRP1表達有升高趨勢，但無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；與模型組比較，順鉑組、中藥組、聯(lián)合組P-gp、MRP1表達降低(P<0.05，P<0.01)；與順鉑組比較，中藥組、聯(lián)合組P-gp、MRP1表達降低(P<0.05，P<0.01)。

注：與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與順鉑組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3.7 p-JAK3、p-STAT5蛋白表達 由圖2可見，與正常對照組比較，模型組p-JAK3、p-STAT5表達有升高趨勢，但無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；與模型組比較，順鉑組、中藥組、聯(lián)合組p-JAK3、p-STAT5表達降低(P<0.05)；與順鉑組比較，中藥組、聯(lián)合組p-JAK3、p-STAT5表達降低(P<0.01)。

注：A為JAK3/STAT5信號通路的蛋白表達條帶圖，B為JAK3/STAT5信號通路的蛋白表達柱狀圖。與模型組比較，△P<0.05；與順鉑組比較，##P<0.01。

4 討論

手術(shù)和化療是當前肺癌的主要治療手段，但經(jīng)過化療后患者的免疫功能會有不同程度的影響。中藥在抗腫瘤、調(diào)節(jié)腫瘤患者免疫功能方面具有療效確切、不良反應少的優(yōu)勢，已成為當下中西醫(yī)結(jié)合研究腫瘤的熱點[9]。肺癌順鉑化療后主要表現(xiàn)為氣陰兩虛、脾腎虧虛[10]。因此，本研究建立了氣陰兩虛型肺癌耐藥裸鼠模型。加味龜鹿二仙膠湯屬于單純“扶正培本”類方劑，具有益氣養(yǎng)陰、補腎填精、養(yǎng)血生髓的功效，在減輕化療所致的骨髓毒性、增強順鉑敏感性方面療效確切[11-13]。

目前，肺癌抗腫瘤治療主要集中在提高患者的抗腫瘤免疫力和直接抑制腫瘤兩方面。為了驗證加味龜鹿二仙膠湯是否有直接抑制腫瘤作用，在本研究中分析了腫瘤質(zhì)量和腫瘤抑制率。研究結(jié)果表明，單純加味龜鹿二仙膠湯治療后的腫瘤質(zhì)量有一定的下降趨勢，但抑瘤率較低(9.27%)，表明加味龜鹿二仙膠湯抑瘤作用較弱，其抗腫瘤作用不是通過直接抑制腫瘤實現(xiàn)的。此外，聯(lián)合組抑瘤率較順鉑組升高(分別為70.12%和40.25%)，表明中藥聯(lián)合順鉑對腫瘤的抑制作用比單用順鉑的作用更強。

脾臟和胸腺是動物的兩個主要免疫器官，也是中樞和外周免疫器官組織的重要組成部分。內(nèi)臟指數(shù)可以反映免疫狀態(tài)[14]。本研究結(jié)果表明，與正常對照組比較，模型組脾臟指數(shù)下降，說明肺癌狀態(tài)下，裸鼠機體處于免疫低下狀態(tài)；中藥組、聯(lián)合組脾臟指數(shù)較模型組升高，說明中藥的使用提高了脾臟指數(shù)，表明使用中藥后裸鼠在細胞免疫方面得到增強。

免疫系統(tǒng)在肺癌的發(fā)展和進程中起著至關(guān)重要的作用。研究表明，在肺癌細胞的生長過程中存在免疫逃逸，這是肺癌發(fā)生、發(fā)展的重要因素[15]。Treg細胞在腫瘤免疫逃逸中起重要作用[16]，CD4+CD25+Treg細胞可作為NSCLC患者免疫狀態(tài)和預后的預測指標[17]。因此，免疫功能在腫瘤治療中起關(guān)鍵作用[18]。本研究結(jié)果表明，模型組CD4+CD25+Treg/CD4+細胞的百分率均高于正常組，提示肺癌裸鼠機體免疫功能處于受抑制狀態(tài)。中藥組、聯(lián)合組CD4+CD25+Treg/CD4+細胞的百分率均低于模型組；中藥組、聯(lián)合組CD4+CD25+Treg/CD4+細胞的百分率較順鉑組降低，提示加味龜鹿二仙膠湯可以糾正CD4+CD25+Treg細胞比例，解除機體免疫抑制狀態(tài)，顯著提升肺癌裸鼠的免疫功能。

T淋巴細胞分泌的細胞因子與腫瘤之間的關(guān)系密切。IL-7是IL-2超家族的成員之一，作為T細胞發(fā)育和成熟T細胞穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵細胞因子，可通過促進活化T細胞、B細胞和NK細胞的發(fā)育而對腫瘤治療有益[19]。本研究結(jié)果表明，與正常對照組比較，模型組IL-7水平降低，提示肺癌裸鼠體內(nèi)分泌的細胞因子降低，機體抗腫瘤能力減弱；與順鉑組比較，中藥組、聯(lián)合組IL-7水平升高，提示加味龜鹿二仙膠湯能夠促進機體產(chǎn)生細胞因子，增強機體抗腫瘤能力。

IL-7與IL-7受體(IL-7R)結(jié)合而發(fā)揮作用，IL-7R是由IL-7受體α和γ鏈組成的異二聚體。IL-7R被發(fā)現(xiàn)在多種類型的細胞上表達，在免疫細胞的發(fā)育中起關(guān)鍵作用。IL-7介導的JAK/STAT信號通路是涉及腫瘤細胞分化、遷移、增殖和耐藥的關(guān)鍵通路之一[5]。P-gp和MRP1表達升高在肺癌順鉑化療耐藥中發(fā)揮重要作用[4]。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，與A549細胞相比，A549/DDP細胞中IL-7R的mRNA和蛋白表達均增加，IL-7與IL-7R結(jié)合后，酪氨酸激酶JAK1和JAK3被激活，從而導致STAT5激活。本研究結(jié)果表明，與順鉑組比較，中藥組、聯(lián)合組P-gp、MRP1基因表達降低，中藥組、聯(lián)合組p-JAK3、p-STAT5蛋白表達降低，提示加味龜鹿二仙膠湯發(fā)揮改善肺癌順鉑化療耐藥作用是通過調(diào)節(jié)IL-7介導的JAK3/STAT5信號通路實現(xiàn)的。

綜上所述，加味龜鹿二仙膠湯能夠提高脾臟指數(shù)，糾正CD4+CD25+Treg細胞比例，解除機體免疫抑制狀態(tài)，促進機體產(chǎn)生IL-7等細胞因子，調(diào)節(jié)IL-7介導的JAK3/STAT5信號通路，減少肺癌組織中耐藥相關(guān)基因(P-gp、MRP1)的表達，顯著提升肺癌裸鼠的免疫功能，從而改善肺癌順鉑化療耐藥。