一測多評法同時測定芍藥湯中6種成分

阮家釗， 趙 芳， 李高天， 陳瑞杰， 陳薇喬， 季旭明,3,4*

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053；2.杭州市食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江 杭州 310022；3.浙江省神經(jīng)藥理學(xué)與轉(zhuǎn)化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310053；4.浙江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院，浙江 杭州 310053)

芍藥湯是經(jīng)典名方，出自《素問病機(jī)氣宜保命集》，由白芍、黃連、當(dāng)歸、檳榔、黃芩、大黃、木香、肉桂、甘草9味藥材組成，具有調(diào)和氣血、清熱解毒之功效[1-3]，在臨床上有飲片、配方顆粒2種劑型。其中中藥配方顆粒具有便于使用調(diào)配的優(yōu)點(diǎn)[4-6]，但也存在提取工藝限制、未經(jīng)共同煎煮等問題，導(dǎo)致其質(zhì)量與療效受到質(zhì)疑[7-8]。

目前，我國對中藥質(zhì)量控制方法有外觀鑒別、性狀檢查、主要成分含量測定[9-10]，而配方顆粒主要以含量測定為依據(jù)。由于標(biāo)準(zhǔn)湯劑被用于標(biāo)準(zhǔn)化臨床用藥，保障用藥劑量的一致性[11-12]，故可以其為參考，進(jìn)行芍藥湯配方顆粒的質(zhì)量評價[13]。

一測多評法是內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法、校正因子法等分析方法的擴(kuò)展與延伸，能在節(jié)約成本的同時全面地反映制劑內(nèi)在質(zhì)量[14-15]。本實(shí)驗(yàn)采用該方法同時測定芍藥湯中阿魏酸、甘草苷、鹽酸小檗堿、大黃素、芍藥苷、黃芩苷的含量，并依據(jù)其標(biāo)準(zhǔn)湯劑對配方顆粒主要成分含量進(jìn)行分析，以期為今后其他中藥配方顆粒的質(zhì)量評價提供有效可行的方法。

1 材料

1.1 儀器 LC-20AD高效液相色譜儀(日本島津公司)；Agilent 1260高效液相色譜儀、Agilent Extend C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱(美國Agilent公司)；菲羅門ACE Excel C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)(廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司)；Waters XBridge Shield RP18(250 mm×4.6 mm，5 μm)(美國Waters公司)；KQ-300DB型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；XSE105DU型電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；5424R型高速離心機(jī)(德國艾本德股份公司)。

1.2 試劑與藥物 阿魏酸(批號110773-201614)、甘草苷(批號11610-201607)、鹽酸小檗堿(批號110713-201814)、大黃素(批號110756-201512)、芍藥苷(批號110736-201337)、黃芩苷(批號110715-201821)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇為色譜純；水為純凈水。

芍藥(批號200501、057190702、200601、320030001、200300029、200302、20200201、200403、200402)、當(dāng)歸(批號20052319、c01200216、191129、200501)、黃連(批號200511、1191022t、191029001、20181215)、黃芩(批號200323、2191220t、19082101、1912001)、大黃(批號200504、1200110t、320040001)、檳榔(批號191107、151021、200101、190901、1903001)、木香(批號190901、1191224t、200413、200502、320050001)、肉桂(批號200527、1200102t、200501、200502、320050001)、甘草(批號200501、969190501、200328、319120001)購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)門診部與杭州市各家藥房，均經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院黃真教授鑒定為正品，符合2020年版《中國藥典》相關(guān)規(guī)定。平行制備10批標(biāo)準(zhǔn)湯劑，編號S1～S10。

芍藥湯配方顆粒具體信息見表1，隨機(jī)組合成10批組方，批號G1～G10。

表1 配方顆粒信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 ACE Excel C18色譜柱(250mm×4.6 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-水(含0.1%磷酸)(B)，梯度洗脫(0～15 min，5%～12%A；15～30 min，12%A；30～60 min，12%～25%A；60～80 min，25%～55%A；80～90 min，55%～70%A；90～100 min，70%～95%A；100～110 min，95%A；110～120 min，5%A)；體積流量1.0 mL/min；檢測波長230 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取阿魏酸、甘草苷、鹽酸小檗堿、大黃素、芍藥苷、黃芩苷對照品適量，制成質(zhì)量濃度分別為0.040 0、0.088 4、0.520 1、0.002 2、0.652 6、0.778 0 mg/mL的溶液，即得。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液 按原方劑量稱取9味藥材，浸泡30 min，煮沸后轉(zhuǎn)小火煎30 min，合并藥液，濃縮至生藥量1 g/mL，即得芍藥湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑。取0.2 mL，甲醇定容至1 mL，超聲提取30 min，冷卻至室溫，甲醇補(bǔ)足減失的體積，離心，取上清液，過膜，即得。

2.2.3 配方顆粒供試品溶液 精密稱取相當(dāng)于原方劑量的配方顆粒，加入適量沸水溶解，定容至生藥量為1 g/mL，即得芍藥湯配方顆粒。取0.2 mL，甲醇定容至1 mL，超聲提取30 min，冷卻至室溫，甲醇補(bǔ)足減失的體積，離心，取上清液，過膜，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液 制備缺白芍、當(dāng)歸、黃芩、黃連、大黃、甘草的陰性樣品，按“2.2.2”項下方法制備，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 取對照品、供試品、陰性樣品溶液各10 μL，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，陰性無干擾，表明方法專屬性良好。

1.芍藥苷 2.阿魏酸 3.甘草苷 4.黃芩苷 5.鹽酸小檗堿 6.大黃素

2.3.2 線性關(guān)系考察 將“2.2”項下對照品溶液稀釋成不同質(zhì)量濃度，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液適量，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定6次，測得阿魏酸、甘草苷、鹽酸小檗堿、大黃素、芍藥苷、黃芩苷含量RSD分別為0.72%、0.93%、1.05%、1.14%、0.63%、1.36%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.2.2”項下標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液適量，于0、2、4、8、12、24 h在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得阿魏酸、甘草苷、鹽酸小檗堿、大黃素、芍藥苷、黃芩苷含量RSD分別為1.41%、0.55%、0.74%、0.42%、1.68%、0.63%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取標(biāo)準(zhǔn)湯劑適量，按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得阿魏酸、甘草苷、鹽酸小檗堿、大黃素、芍藥苷、黃芩苷含量RSD分別為0.68%、0.79%、1.36%、1.42%、0.97%、1.03%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取9份標(biāo)準(zhǔn)湯劑，每份0.2 mL，分別以1∶0.5、1∶1、1∶1.5的比例加入一定量“2.2.1”項下對照品溶液，甲醇定容至1 mL，超聲提取30 min，冷卻至室溫，甲醇補(bǔ)足減失的體積，離心，取上清液，過膜，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，計算回收率。結(jié)果，阿魏酸、甘草苷、鹽酸小檗堿、大黃素、芍藥苷、黃芩苷平均加樣回收率(RSD)分別為98.54%(1.97%)、101.36%(1.67%)、100.62%(1.24%)、100.52%(1.65%)、99.37%(0.62%)、97.48%(1.33%)。

2.4 一測多評法分析

2.4.1 相對校正因子測定 相對校正因子(fk/s)計算公式為fk/s=fk/fs=(CkAs)/(CsAk)[16]，其中Ck為其他成分含量，Ak為其他成分峰面積，Cs為內(nèi)標(biāo)含量，As為內(nèi)標(biāo)峰面積。精密吸取6份“2.2.1”項下對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，以阿魏酸為內(nèi)標(biāo)，計算其他5種成分的相對校正因子，結(jié)果見表3。

表3 各成分相對校正因子

2.4.2 不同儀器、色譜柱對校正因子的影響 本實(shí)驗(yàn)考察了島津LC-20AD、Agilent 1260色譜儀，以及菲羅門ACE Excel C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Waters XBridge Shield RP18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent Extend C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱對相對校正因子的影響，結(jié)果見表4，可知均無明顯影響(RSD<2%)。

表4 不同儀器、色譜柱對相對校正因子的影響

2.4.3 不同柱溫對校正因子的影響 本實(shí)驗(yàn)考察了不同柱溫(25、27、30、32、35 ℃)對相對校正因子的影響，結(jié)果見表5，可知均無明顯影響(RSD<2%)。

表5 不同柱溫對相對校正因子的影響

2.4.4 色譜峰定位 本實(shí)驗(yàn)考察了各成分相對保留值(ri/s=tRi/tRs)在不同儀器、色譜柱下的重復(fù)性，結(jié)果見表6。由此可知，各成分相對保留時間RSD均小于1.0%，故采用該方法進(jìn)行色譜峰定位。

表6 不同儀器、色譜柱對相對保留時間的影響

2.5 配方顆粒含量測定 取10批配方顆粒(G1～G10)，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，分別采用外標(biāo)法、一測多評法計算含量，結(jié)果見表7。由此可知，2種方法所得結(jié)果相關(guān)性較高(r>0.986 0)，無明顯差異(P>0.05)。

表7 配方顆粒中各成分含量測定結(jié)果(mg/mL，n=3)

2.6 標(biāo)準(zhǔn)湯劑含量測定 取10批標(biāo)準(zhǔn)湯劑(S1～S10)，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，采用一測多評法計算含量，結(jié)果見表8。

表8 標(biāo)準(zhǔn)湯劑中各成分含量測定結(jié)果(mg/mL，n=3)

3 討論

芍藥湯屬經(jīng)典名方，配伍精妙，療效確切[17]，對于其配方顆粒的質(zhì)量評價符合臨床需要，具有現(xiàn)實(shí)意義。本實(shí)驗(yàn)分別考察了不同溶劑、流動相、柱溫、檢測波長[18]下芍藥湯色譜峰的分離度、保留時間、峰數(shù)量，最終選擇溶劑70%甲醇、流動相乙腈-水(含0.1%磷酸)、柱溫30 ℃、檢測波長230 nm作為檢測條件。

本研究建立了一測多評法同時測定芍藥湯配方顆粒中阿魏酸、甘草苷、鹽酸小檗堿、大黃素、芍藥苷、黃芩苷的含量，發(fā)現(xiàn)所得結(jié)果與外標(biāo)法無明顯差異，證明了該方法的可行性，再同法測定芍藥湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑中上述成分的含量，發(fā)現(xiàn)其平均值均高于配方顆粒。研究表明，大黃與甘草共同煎煮時會使后者中甘草酸溶出率升高[19]，而且該成分和甘草次酸屬于三萜皂苷類物質(zhì)，具有表面活性劑的性質(zhì)，又可增加黃芩苷、芍藥苷等成分在水中的溶解度[20]，故推測上述現(xiàn)象可能是由于配方顆粒中各藥味之間未經(jīng)共同煎煮所致。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立一測多評法同時測定芍藥湯中阿魏酸、甘草苷、鹽酸小檗堿、大黃素、芍藥苷、黃芩苷的含量，該方法操作簡便、穩(wěn)定性高、重復(fù)性好，可應(yīng)用于該方質(zhì)量控制和評價。