根皮素納米混懸劑的制備及其體內(nèi)藥動學研究

張偉利， 決利利， 李曉婷

(鄭州工業(yè)應用技術學院，河南 鄭州 451150)

根皮素作為黃酮多酚類化合物，主要存在于蘋果、梨等水果的根莖中，具有抗糖尿病、抗氧化、抗菌、保護神經(jīng)系統(tǒng)、抗前列腺癌等多種藥理作用[1-2]，但該成分在25 ℃水中的溶解度僅為33.64 μg/mL，溶出速率、溶出度均較低，可能會導致其口服吸收困難[3]，從而影響藥效發(fā)揮。因此，提高根皮素的溶解度及溶出度、改善口服吸收生物利用度是首要解決的問題，目前該成分劑型主要有包合物[4]、磷脂復合物[5]、固體分散體[3]等。

納米混懸劑具有載藥量大、工藝簡單等優(yōu)勢，可顯著提高溶解度及口服吸收生物利用度，該技術是將藥物與穩(wěn)定劑(如PVP K30、SDS、泊洛沙姆188等)通過某種制劑手段(高壓均質(zhì)、超聲等)所得到的膠態(tài)分散體系[6-9]，工業(yè)化應用程度相對較高。本實驗首先通過單因素試驗考察穩(wěn)定劑種類、用量、超聲功率等對根皮素納米混懸劑粒徑、PDI的影響，確定制備工藝，再測定其粒徑、Zeta電位、載藥量、溶解度、溶出度等情況，最后考察其在大鼠體內(nèi)的藥動學，以期為該劑型進一步開發(fā)應用提供參考。

1 材料

Agilent 1260型高效液相色譜儀(配置DAD檢測器和自動進樣器，美國Agilent公司)；MSE 125P-CE型電子天平(配置防風罩，德國Sartorius公司)；C-MAG-HS7型恒溫加熱磁力攪拌器(德國IKA公司)；ATS型均質(zhì)機(美國Seeker公司)；BDF-86H50型超低溫冰箱(山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司)；Nano-S90型粒度分析儀(馬爾文帕納科公司)；TYH-2型氮氣吹掃儀(廣西大學附屬科學儀器有限公司)。

根皮素原料藥(批號191005-2，純度98.0%，成都嘉葉生物科技有限公司)；根皮素對照品(批號P7912，純度99.9%，美國Sigma公司)；聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP K30，批號240379，美國Ashland公司)；十二烷基磺酸鈉(SDS，批號171114，國藥集團化學試劑有限公司)；泊洛沙姆188(批號171225，山河藥用輔料有限公司)。

SD大鼠，雌雄兼用，體質(zhì)量(300±20)g，購自河南省動物實驗中心，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(豫)2016-0001，飼養(yǎng)溫度、相對濕度分別為25 ℃、55%。

2 方法與結果

2.1 HPLC法測定根皮素含量

2.1.1 色譜條件 Waters C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相乙腈-水(35∶65)；體積流量1.0 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長286 nm；進樣量20 μL。

2.1.2 線性關系考察 稱根皮素對照品20.0 mg，置于100 mL量瓶中，加入約80 mL乙腈超聲提取3 min溶解，乙腈定容至0.2 mg/mL，作為貯備液，再配制500 mL 乙腈-水(35∶65)混合液，作為稀釋液。精密量取10 mL貯備液，置于100 mL量瓶中，稀釋液定容，即得20.0 μg/mL對照品溶液，稀釋液依次稀釋至10.0、5.0、1.0、0.5、0.05 μg/mL，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定。以峰面積(Y)對根皮素質(zhì)量濃度(X)進行回歸，得方程為Y=12.941 8X+44.066 1(r=0.999 9)，在0.05～20.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.1.3 方法學考察 取根皮素納米混懸劑1.0 mL至10 mL量瓶中，加入約7 mL乙腈超聲處理3 min后定容，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液0.5 mL至10 mL量瓶中，“2.1.2”項下稀釋液定容，即得供試品溶液。取同一份樣品，平行制備6份供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得根皮素峰面積RSD為1.44%，表明該方法重復性良好。取供試品溶液適量，于0、4、8、12、24、48 h在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得根皮素峰面積RSD為1.17%，表明溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。取20.0、5.0、0.05 μg/mL對照品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得根皮素峰面積RSD分別為0.28%、0.13%、0.21%，表明儀器精密度良好。精密稱取根皮素對照品12.0 mg，置于10 mL量瓶中，加入約7 mL乙腈超聲處理3 min后定容，即得1.2 mg/mL對照品溶液，再取9份根皮素納米混懸劑，每份1.0 mL，置于10 mL量瓶中，分為3組，分別加入對照品溶液0.5、1.0、1.5 mL，再加入約7 mL乙腈超聲處理3 min后定容，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液0.5 mL至10 mL量瓶中，“2.1.2”項下稀釋液定容，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得加樣回收率分別為100.19%、99.67%、100.37%，RSD分別為0.63%、1.31%、0.94%。

2.2 單因素試驗

2.2.1 穩(wěn)定劑種類 固定穩(wěn)定劑用量為30 mg，考察不同穩(wěn)定劑(PVP K30、SDS、泊洛沙姆188)及其組合(PVP K30+SDS、PVP K30+泊洛沙姆188、SDS+泊洛沙姆188，比例均為1∶1)對納米混懸劑粒徑、PDI的影響，結果見表1。由此可知，PVP K30+泊洛沙姆188作為穩(wěn)定劑時粒徑、PDI均較低。

表1 穩(wěn)定劑種類對粒徑、PDI的影響

2.2.2 穩(wěn)定劑比例 固定穩(wěn)定劑用量為30 mg，考察PVP K30+泊洛沙姆188不同比例(1∶2、1∶1、2∶1)對納米混懸劑粒徑、PDI的影響，結果見表2。由此可知，PVP K30與泊洛沙姆188比例為1∶1時粒徑、PDI均較低。

表2 穩(wěn)定劑比例對粒徑、PDI的影響

2.2.3 穩(wěn)定劑用量 固定PVP K30與泊洛沙姆188比例為1∶1，考察不同穩(wěn)定劑用量(20、30、40、50、60 mg)對納米混懸劑粒徑、PDI的影響，結果見表3。由此可知，穩(wěn)定劑用量過大或過小均會對粒徑、PDI產(chǎn)生影響，在40 mg時兩者均較低，而超過40 mg時粒徑反而上升，可能是過多的穩(wěn)定劑吸附在納米粒子表面所致。

表3 穩(wěn)定劑用量對粒徑、PDI的影響

2.2.4 超聲功率 固定根皮素用量為60 mg，PVP K30與泊洛沙姆188比例為1∶1，穩(wěn)定劑用量為40 mg，考察不同超聲功率(200、250、300、350、400 W)對納米混懸劑粒徑、PDI的影響，結果見表4。由此可知，超聲功率為350 W時粒徑、PDI均較低，而進一步增加時粒徑反而有所升高，可能是功率過高可提升納米粒子碰撞幾率所致[9]。

表4 超聲功率對粒徑、PDI的影響

2.2.5 超聲時間 固定根皮素用量為60 mg，PVP K30與泊洛沙姆188比例為1∶1，穩(wěn)定劑用量為40 mg，超聲功率為350 W，考察不同超聲時間(20、25、30、35 min)對納米混懸劑粒徑、PDI的影響，結果見表5。由此可知，超聲時間為30 min時粒徑、PDI均較低，而進一步延長時兩者反而有所升高。

表5 超聲時間對粒徑、PDI的影響

2.2.6 制備工藝確定 取60 mg根皮素，置于圓底燒瓶中，加入10 mL無水乙醇得混懸液，磁力攪拌(50 ℃)2.5 h至溶液澄清，作為有機相；稱取PVP K30、泊洛沙姆188(比例為1∶1)共40 mg，加入50 mL蒸餾水溶解，作為水相，將有機相滴加至水相中，繼續(xù)磁力攪拌攪拌2 h，再置于超聲儀中超聲處理30 min(功率350 W，每工作2 s停止2 s)，加入蒸餾水至50 mL，即得。

2.3 納米混懸劑表征

2.3.1 粒徑、Zeta電位 平行制備3批納米混懸劑，蒸餾水稀釋50倍，混勻，取約3 mL至比色皿中，測定粒徑、Zeta電位，結果分別見圖1～2。由此可知，其平均粒徑為167.2 nm，RSD為0.95%；平均PDI為0.138，RSD為0.67%；平均Zeta電位為-36.4 mV，RSD為0.77%，表明處方和工藝重復性良好。

圖1 納米混懸劑粒徑分布

圖2 納米混懸劑Zeta電位

2.3.2 載藥量 取納米混懸劑1.0 mL至超濾離心管中，8 000 r/min離心10 min，取外管濾液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，計算游離根皮素量(M游離)；取根皮素納米混懸劑1.0 mL至10 mL量瓶中，加入約7 mL乙腈超聲處理3 min后定容，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液0.5 mL至10 mL量瓶中，“2.1.2”項下稀釋液定容，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測定根皮素總量(M總藥)；取1.0 mL根皮素納米混懸劑，凍干(不加凍干保護劑)，稱定質(zhì)量(M總)，平行3次，計算載藥量，公式為載藥量=[(M總藥-M游離)/M總]×100%，測得其平均值為51.43%，RSD為0.82%。

2.4 凍干粉制備及其溶解度測定 取納米混懸劑適量，加入4%甘露醇混勻，分成若干份，每份約4 mL，置于-50 ℃冰箱中預凍2 d，再迅速置于-30 ℃真空狀態(tài)的冷凍干燥機中2 d，于3 h內(nèi)勻速升溫至25 ℃，繼續(xù)保持3 h后取出，即得，見圖3。取適量蒸餾水復溶，測得其平均粒徑為193.4 nm，平均PDI為0.166，平均Zeta電位為-27.7 mV，見圖4～5。

圖3 凍干粉外觀

圖4 凍干粉復溶后粒徑分布

圖5 凍干粉復溶后Zeta電位

取過量根皮素、物理混合物(根皮素-輔料，兩者比例同納米混懸劑)、納米混懸劑凍干粉，置于三角燒瓶中，加入蒸餾水得混懸液，固定于振蕩器上，設置溫度、轉(zhuǎn)速分別為25 ℃、100 r/min，振蕩2 d后取出，12 500 r/min離心15 min，吸取上清液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定。結果顯示，根皮素、物理混合物溶解度分別為33.64、68.27 μg/mL，推測后者溶解度升高可能與處方中含有表面活性劑有關；納米混懸劑凍干粉溶解度達867.35 μg/mL，提高至25.78倍。

2.5 體外釋藥研究 取根皮素及其納米混懸劑凍干粉適量(以根皮素計均為8 mg)，置于離心管中，加入2 mL蒸餾水得混懸液，剪取透析袋(截留分子量8 000～14 000 Da)，去離子水煮沸20 min，常溫去離子水洗滌，將混懸液轉(zhuǎn)移至透析袋中，細尼龍繩兩端扎緊，每份樣品平行制備3份。取蒸餾水適量，超聲處理30 min后量取900 mL，作為溶出介質(zhì)。在溫度37 ℃、轉(zhuǎn)速100 r/min條件下，從樣品接觸溶出介質(zhì)開始計時，每個取樣點取樣3 mL后，立即補加3 mL超聲后蒸餾水，12 500 r/min離心15 min，吸取上清液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，結果見圖6。由此可知，原料藥在240 min內(nèi)的溶出度僅為36.73%，而其納米混懸劑凍干粉末在45 min內(nèi)基本完全溶出。

圖6 根皮素體外釋藥曲線(n=3)

2.6 體內(nèi)藥動學研究

2.6.1 灌胃液制備、給藥及取血 取根皮素及其納米混懸劑凍干粉適量，加入0.5% CMC-Na溶液，超聲處理30 s，即得12.5 mg/mL灌胃液。取12只SD大鼠，拋幣法隨機分為2組，每組6只，實驗前禁食12 h，自由飲水，按100 mg/kg劑量灌胃給藥，于0.167、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12 h取血各約0.3 mL，置于肝素浸潤的離心管中，混勻后3 000 r/min離心約2 min(視情況延長或縮短時間)，取上層血漿，保存于冰箱中。

2.6.2 血漿樣品處理 將血漿樣品在室溫下解凍后，精密吸取0.2 mL至空白離心管中，加入1 mL乙腈渦旋5 min，12 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液，45 ℃氮氣吹干，0.2 mL乙腈復溶，12 000 r/min離心5 min，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定。

2.6.3 線性關系考察 取5.0 μg/mL對照品溶液，乙腈依次稀釋至2 500、1 000、500、100、50、20 ng/mL，各取0.2 mL，45 ℃氮氣吹干，加入0.2 mL空白血漿，混勻，按“2.6.2”項下方法處理，即得血漿對照品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定。以峰面積為縱坐標(Y)，血漿對照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(X)進行回歸，得方程為Y=0.013 3X+0.461 5(r=0.994 2)，在20～2 000 ng/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.6.4 方法學考察 取空白血漿、血漿樣品、血漿對照品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，結果見圖7，可知血漿內(nèi)源性物質(zhì)不干擾根皮素色譜峰，專屬性良好。取血漿樣品6份，按“2.6.2”項下方法處理，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得根皮素峰面積RSD為1.42%，表明該方法重復性良好。取20、500、2 500 ng/mL血漿對照品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得根皮素峰面積RSD分別為7.31%、5.94%、2.34%，表明該方法日內(nèi)精密度良好；各質(zhì)量濃度每天進樣測定1次，連續(xù)6 d，測得根皮素峰面積RSD分別為10.11%、7.04%、4.87%，表明該方法日間精密度良好。取血漿樣品，于0、4、12、24、36、48 h在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得根皮素峰面積RSD為7.77%，表明該方法穩(wěn)定性良好。取2 500、500、20 ng/mL血漿對照品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，將實際質(zhì)量濃度與配制質(zhì)量濃度進行比較，測得加樣回收率分別為93.61%、89.25%、91.73%，RSD分別為7.01%、8.46%、9.08%。

1.根皮素

2.6.5 藥動學研究 圖8、表6顯示，與原料藥比較，納米混懸劑tmax縮短(P<0.05)，Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高(P<0.01)，相對生物利用度增加至3.47倍，而物理混合物均無明顯變化(P>0.05)。

表6 根皮素主要藥動學參數(shù)

圖8 根皮素血藥濃度-時間曲線(n=6)

3 討論

本實驗發(fā)現(xiàn)，當溶有根皮素的有機相接觸到水相時，乙醇會迅速擴散到水相中，由于該成分在水中的溶解度較低，從而會析出形成納米級別的微小晶核，同時穩(wěn)定劑可形成空間阻力，有效防止晶核聚集[10-12]，最終形成納米混懸劑。與原料藥比較，納米混懸劑tmax顯著提前，可能是由于該劑型可提高根皮素溶出速率，加快了后者進入體循環(huán)的速度；Cmax、生物利用度顯著升高，可能是由于納米混懸劑將根皮素的溶解度提高至25.78倍，后者溶出度、溶出速率也得到很大改善，表明該劑型可增加藥物與胃腸道的接觸面，有助于后者被充分吸收[13]，而且吸收途徑也發(fā)生了改變[14]。

馬記平等[5]采用磷脂復合物增溶技術提高了根皮素水溶性和脂溶性，但它由于黏性較大，導致溶出受限[15]；本實驗制備的納米混懸劑不僅改善了藥物溶解度和溶出度，而且還能發(fā)揮納米制劑特殊的促吸收機制，使其口服生物利用度升高程度高于磷脂復合物[16]。另外，盡管納米混懸劑技術在促進藥物體內(nèi)吸收、提高生物利用度方面得到了制劑研究人員的認可，但不同藥物納米混懸劑促吸收的程度存在較大差別，可能與藥物本身性質(zhì)[17](如穩(wěn)定性、脂溶性等)、粒徑等因素有關，具體有待進一步研究。