黃河口潮間帶沉積物細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征

尹 霞,李思琦,尚天微,江雪艷,甄 毓,*

1 中國(guó)海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,青島 266100 2 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室,青島 266237 3 海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青島 266100 4 中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院,青島 266003 5 中國(guó)海洋大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,青島 266100

黃河口潮間帶位于渤海灣南岸和萊州灣西岸,屬鹽堿濕地[1]。黃河口潮間帶濕地是我國(guó)暖溫帶保存最完整、最年輕、發(fā)展速度最快的濕地。該區(qū)域蘊(yùn)藏著豐富的石油和生物資源,尤其有一些瀕危鳥(niǎo)類(lèi)在此棲息,維持該生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定對(duì)保護(hù)自然資源和生物多樣性具有重要意義。

微生物是潮間帶濕地生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。與其它生物相比,微生物具有體積小、種類(lèi)多、分布廣、繁殖快、代謝能力強(qiáng)和易變異等特點(diǎn),能及時(shí)反映出所處環(huán)境的變化[2]。對(duì)于微生物而言,潮間帶不是一個(gè)良好的生存環(huán)境。潮間帶微生物必須應(yīng)對(duì)高溫、紫外線(xiàn)輻射、不規(guī)律的干旱與淹沒(méi)等重重考驗(yàn),以及由于爭(zhēng)奪養(yǎng)分和空間而產(chǎn)生的激烈的生物相互作用[3]。這些環(huán)境因子的限制可能有利于某些具有特殊生理和代謝功能微生物的生存和發(fā)展。研究環(huán)境微生物結(jié)構(gòu)和功能,有助于發(fā)現(xiàn)和利用新的重要的微生物資源,對(duì)探究微生物群落和生境的關(guān)系,指導(dǎo)微生物群落功能的定向調(diào)控具有重要意義。

有研究指出濕地植被組成及土壤性質(zhì)是影響濕地土壤微生物群落組成和功能活性的重要因素[4]。植被是潮間帶生態(tài)系統(tǒng)初級(jí)生產(chǎn)力的重要來(lái)源,在維持該生態(tài)系統(tǒng)相關(guān)功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5]。植物光合作用近30%的產(chǎn)物可以通過(guò)植物根系釋放到土壤中被微生物利用[6],而微生物也可以通過(guò)自身代謝活動(dòng)將土壤中有機(jī)物降解為無(wú)機(jī)物供植物吸收利用,促進(jìn)植物生長(zhǎng)。由此可見(jiàn),潮間帶植物與土壤微生物具有密切聯(lián)系。對(duì)黃河口潮間帶沉積物中微生物的研究已有一些報(bào)道[7- 9]。已有的研究主要分析了黃河口潮間帶沉積物中微生物的群落結(jié)構(gòu),卻沒(méi)有對(duì)有植被與無(wú)植被沉積物中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其潛在功能進(jìn)行比較分析。本研究選取黃河口潮間帶表面覆蓋有植被和表面無(wú)植被的兩個(gè)區(qū)域,對(duì)比了解兩個(gè)區(qū)域沉積物中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能,為黃河口潮間帶生態(tài)系統(tǒng)的保護(hù)以及充分利用潮間帶微生物資源提供依據(jù),對(duì)研究潮間帶生態(tài)系統(tǒng)的運(yùn)行機(jī)制、功能,表征潮間帶環(huán)境變化,維持其平穩(wěn)運(yùn)作具有指導(dǎo)作用[10]。

1 材料和方法

1.1 樣品的采集與保存

2019年3月20日—21日于黃河口潮間帶分別選擇表面無(wú)植被(UT)的光灘區(qū)域和表面長(zhǎng)有蘆葦植被(VT)區(qū)域設(shè)置采樣站位(圖1)。將直徑為11 cm、長(zhǎng)為30 cm的PVC管打入潮間帶沉積物中采集柱狀樣品,以每2 cm的間隔進(jìn)行切割,分裝于無(wú)菌的聚氯乙烯塑料封口袋,儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱,運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室后于-80 ℃保存,用于DNA的提取。每個(gè)采樣點(diǎn)分別挖一個(gè)深度約為40 cm的坑,在縱切面上利用Rhizon土壤溶液采樣器(荷蘭)以每2 cm的間隔采集間隙水樣品,經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后,將水樣分為兩份,一份在現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定鹽度、pH,另一份保存在-20 ℃冰箱,帶回實(shí)驗(yàn)室后測(cè)定硫酸鹽、銨鹽、硝酸鹽、亞硝酸鹽和磷酸鹽含量等參數(shù)。

圖1 黃河口潮間帶柱狀沉積物采樣點(diǎn)Fig.1 Location of sampling site in the intertidal mudflat of the Yellow River estuaryVT：有植被 Vegetation；UT：無(wú)植被 Vegetation-free

1.2 理化參數(shù)的測(cè)定

利用Multi 3620 IDS多參水質(zhì)檢測(cè)儀(德國(guó))對(duì)不同深度采集的間隙水樣的pH、鹽度進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定；利用營(yíng)養(yǎng)鹽自動(dòng)分析儀(Quaatro Bran-Lubbe Ltd.)對(duì)間隙水中硝酸鹽、亞硝酸鹽、銨鹽和磷酸鹽四種營(yíng)養(yǎng)鹽含量進(jìn)行測(cè)定；間隙水中硫酸根離子的濃度利用ICS- 3000離子色譜儀(DIONEX, USA)進(jìn)行測(cè)定。

1.3 DNA提取

利用Power Soil? Isolation Kit(MO Bio Laboratories, USA)DNA提取試劑盒分別對(duì)不同深度沉積物樣品的總基因組DNA進(jìn)行提取,參照試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。利用超微量分光光度計(jì)(Thermo Scientific, USA)對(duì)提取的DNA樣液進(jìn)行質(zhì)量和濃度檢測(cè),檢測(cè)合格后,挑選柱狀樣的表層(0—2 cm)、次表層(2—4 cm)、中層(14—16 cm)和底層(28—30 cm)的DNA樣品送于測(cè)序公司進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.4 Illumina高通量測(cè)序

以提取的DNA為PCR模板,用帶有測(cè)序標(biāo)簽barcode的引物338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)/806R(GGACTACNSGGGTWTCTAAT)[11]對(duì)樣品基因目標(biāo)片段進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增條件為：94 ℃,10 min；94 ℃,30 s；55 ℃,30 s；72 ℃,45 s,27個(gè)循環(huán)；72 ℃,10 min。將擴(kuò)增后經(jīng)純化檢驗(yàn)質(zhì)量合格后的PCR產(chǎn)物用于構(gòu)建測(cè)序文庫(kù),使用Illumina Sequencer MiSeq測(cè)序儀進(jìn)行2×300 bp的雙端測(cè)序。利用QIIME軟件對(duì)高通量測(cè)序下機(jī)的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行識(shí)別,剔除長(zhǎng)度小于160 bp及存在模糊堿基的問(wèn)題序列,再調(diào)用USEARCH對(duì)嵌合體序列進(jìn)行檢查并剔除,評(píng)估得到的有效序列的質(zhì)量,從而獲得可用于后續(xù)分析的優(yōu)質(zhì)序列。使用USEARCH軟件對(duì)上述過(guò)程得到的序列以97%的序列相似度進(jìn)行歸并和可操作分類(lèi)單元(operational taxonomic units, OTU)劃分,挑選出每個(gè)OTU中豐度最高的序列作為該OTU的代表序列,用RDF classifier將其與Silva數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)進(jìn)行注釋,以供后續(xù)分析。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

利用qPCR對(duì)有植被和無(wú)植被兩個(gè)研究區(qū)域0—30 cm的每隔2 cm的土壤樣品細(xì)菌豐度進(jìn)行了測(cè)定。配制20 μL的qPCR反應(yīng)體系：10 μL ROX(FastStart Universal SYBR Green Master, Roche, 瑞士),正反向引物(338F/806R)各0.6 μL,0.2 μL牛血清蛋白,6.6 μL超純水和2 μL DNA模板。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn),每組反應(yīng)添加陰性對(duì)照。反應(yīng)在ABI7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行,反應(yīng)條件設(shè)置為：94 ℃,10 min；94 ℃,30 s；58 ℃,45 s；72 ℃,1 min,35個(gè)循環(huán)；72 ℃,10 min。反應(yīng)結(jié)束后通過(guò)熔融曲線(xiàn)判斷擴(kuò)增的特異性,并用2%瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增效果。

1.6 PICRUSt功能預(yù)測(cè)

PICRUSt方法是基于已測(cè)細(xì)菌基因組的16S rRNA全長(zhǎng)序列,推斷它們共同祖先的基因功能譜,對(duì)Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)中其它未測(cè)物種的基因功能譜進(jìn)行推斷,構(gòu)建古菌和細(xì)菌域全譜系的基因功能預(yù)測(cè)譜,最后將測(cè)序得到的菌群組成“映射”到數(shù)據(jù)庫(kù)中,完成對(duì)菌群代謝功能的預(yù)測(cè)。

1.7 數(shù)據(jù)分析與處理

利用EXCEL 2010和Origin 2018對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(細(xì)菌豐度、群落結(jié)構(gòu))進(jìn)行初步處理與制圖。通過(guò)SPSS Statistics 25軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。應(yīng)用R 3.6.1軟件的“pheatmap”和“vegan”程序包,對(duì)細(xì)菌屬進(jìn)行聚類(lèi)分析并繪制熱圖[12]。使用CANOCO 4.5軟件對(duì)環(huán)境因子與群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行典范對(duì)應(yīng)分析(Canonical correspondence analysis, CCA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 環(huán)境因子特征

對(duì)黃河口潮間帶間隙水中環(huán)境因子的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。兩個(gè)研究區(qū)域的鹽度均隨沉積物深度的增加而降低,有植被區(qū)域鹽度梯度變化尤其顯著,由表層的35降低到底層為4.17。pH值隨沉積物深度的變化較小,有植被區(qū)域pH值為7.73—7.88,無(wú)植被區(qū)域?yàn)?.18—7.44。硫酸鹽濃度在兩個(gè)站位的差異性顯著(P<0.05),在無(wú)植被區(qū)域濃度介于17.40—28.79 mmol/L之間,而在有植被區(qū)域,表層濃度高達(dá)69.89 mmol/L,約為該區(qū)域最低濃度的100倍。銨鹽、亞硝酸鹽和磷酸鹽含量整體表現(xiàn)為有植被區(qū)域高于無(wú)植被區(qū)域。

2.2 細(xì)菌16S rRNA基因豐度

從表層有植被和表層無(wú)植被區(qū)域的細(xì)菌豐度垂直分布圖(圖2)可以看出,細(xì)菌豐度在不同區(qū)域、不同深度有明顯變化。在兩個(gè)區(qū)域,細(xì)菌豐度峰值均出現(xiàn)在中層,表層和底層豐度相對(duì)較低。在相同深度的沉積物樣品中細(xì)菌豐度在有植被區(qū)域比無(wú)植被區(qū)域高,有植被區(qū)域細(xì)菌豐度為3.55×105—1.29×107拷貝數(shù)/g,無(wú)植被區(qū)域細(xì)菌豐度為5.76×102—4.23×106拷貝數(shù)/g,說(shuō)明有植被環(huán)境可以為細(xì)菌提供更適宜的生存和發(fā)展環(huán)境。對(duì)熒光定量PCR產(chǎn)物進(jìn)行的凝膠電泳結(jié)果顯示均為明亮的單條帶,說(shuō)明擴(kuò)增的特異性(圖3)。

2.3 細(xì)菌群落多樣性

所有樣品中細(xì)菌測(cè)序覆蓋度均高于96.14%,說(shuō)明測(cè)序深度覆蓋了大多數(shù)細(xì)菌物種,基本能夠反映樣品中細(xì)菌的群落信息。經(jīng)質(zhì)控后,8個(gè)樣品共獲得126647條有效序列,97%的相似性聚類(lèi)得到12070個(gè)OTUs(表2)。在有植被區(qū)域沉積物中,豐富度指數(shù)Chao 1由表層到底層逐漸增加,多樣性指數(shù)Shannon在底層樣品中最高。無(wú)植被區(qū)域沉積物中細(xì)菌群落的豐富度和多樣性在中層樣品表現(xiàn)為最高。

圖2 黃河口潮間帶不同深度沉積物中細(xì)菌16S rRNA基因豐度Fig.2 The bacterial 16S rRNA gene abundances of columnar sediment in the intertidal mudflat of Yellow River estuaryVT：有植被 Vegetation；UT：無(wú)植被 Vegetation-free

圖3 熒光定量PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.3 Gel electrophoresis image of realtime fluorescent quantitative PCR products

2.4 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

對(duì)有植被和無(wú)植被兩個(gè)生境不同深度沉積物樣品的細(xì)菌群落在門(mén)分類(lèi)水平上進(jìn)行了分析,有植被區(qū)域共檢測(cè)到50個(gè)細(xì)菌門(mén),無(wú)植被共56個(gè)細(xì)菌門(mén)。選取其中相對(duì)豐度>1.0%的細(xì)菌進(jìn)行作圖。從圖4可以看出黃河口潮間帶沉積物兩個(gè)研究區(qū)域的細(xì)菌群落主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為變形菌(Proteobacteria)、綠彎菌(Chloroflexi)和放線(xiàn)菌(Actinobacteria),相對(duì)豐度和為59.0%—80.0%。無(wú)植被表層樣品(UT2)的最優(yōu)勢(shì)菌是綠彎菌(28.1%),除此之外,其它樣品中相對(duì)豐度最高的均為變形菌,為28.4%—49.6%。兩個(gè)研究區(qū)域沉積物中酸桿菌(Acidobacteria)的相對(duì)豐度都是隨著深度的增加而增加。不同細(xì)菌門(mén)在各個(gè)樣品中的相對(duì)豐度表現(xiàn)出差異,其中有植被區(qū)域表層樣品(VT1)與其它樣品差異尤為顯著。如綠彎菌在其它樣品中相對(duì)豐度較高,占14.8%—28.1%,在VT1中相對(duì)豐度僅為1.3%,而放線(xiàn)菌豐度高達(dá)29.0%,藍(lán)細(xì)菌豐度為3.8%,酸桿菌豐度與其它樣品相比較低,僅為0.4%。

根據(jù)屬分類(lèi)水平上細(xì)菌的注釋信息,選擇所有樣品中相對(duì)豐度排在前20的屬,對(duì)物種和樣品進(jìn)行聚類(lèi),繪制聚類(lèi)熱圖(圖5)。不同顏色代表不同豐度,顏色越紅代表該屬在對(duì)應(yīng)樣品中豐度越高,藍(lán)色越深則表示該屬的豐度越低。結(jié)果顯示,各樣品的優(yōu)勢(shì)菌屬表現(xiàn)出較大的差異,UT1、UT2、VT1、VT3聚為一組,UT3、UT4、VT2、VT4聚為一組,表明兩個(gè)區(qū)域優(yōu)勢(shì)菌屬組成差異不明顯。其中蒼白桿菌(Ochrobactrum)在多個(gè)樣品中為最優(yōu)勢(shì)菌屬,尤其在有植被表層樣品中相對(duì)豐度達(dá)25.4%,在無(wú)植被表層樣品中占9.8%。芽孢桿菌(Bacillus)、擬無(wú)枝菌酸菌(Amycolatopsis)和鞘脂單胞菌(Sphingomonas)等菌屬分別在不同樣品中豐度顯著。

圖4 門(mén)分類(lèi)水平上細(xì)菌的組成及豐度分布Fig.4 The composition and abundance distribution of bacterial communities at phylum level

圖5 黃河口潮間帶沉積物中細(xì)菌屬分類(lèi)水平豐度熱圖Fig.5 Genus abundance heatmap of bacterial community in the intertidal zone of Yellow River estuary

2.5 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的相關(guān)分析

圖6 細(xì)菌群落與環(huán)境因子典范對(duì)應(yīng)分析 Fig.6 Canonical correlation analysis between bacterial community and environmental factors銨鹽硝酸鹽亞硝酸鹽硫酸鹽磷酸鹽 Phosphate

典范對(duì)應(yīng)分析(CCA)結(jié)果顯示(圖6),第一和第二排序軸共解釋了樣本與環(huán)境因子間41.5%的累計(jì)變量。表3顯示與第一排序軸相關(guān)性較高的環(huán)境因子有銨鹽(0.7462)和硝酸鹽(-0.5396),與第二排序軸相關(guān)性較高的環(huán)境因子是亞硝酸鹽(-0.4518)和硫酸鹽(-0.5189)。

利用SPSS軟件分別對(duì)環(huán)境因子與多樣性和豐富度(表4)、環(huán)境因子與優(yōu)勢(shì)菌門(mén)(表5)進(jìn)行了相關(guān)性分析。其中Chao 1指數(shù)和Shannon指數(shù)均與鹽度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；Shannon指數(shù)與亞硝酸鹽和磷酸鹽呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。說(shuō)明鹽度、亞硝酸鹽和磷酸鹽是影響黃河口潮間帶沉積物中細(xì)菌群落豐富度和多樣性的重要因素。優(yōu)勢(shì)菌門(mén)與環(huán)境因子的相關(guān)分析結(jié)果顯示,變形菌(Proteobacteria)的含量與pH呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；綠彎菌(Chloroflexi)與硫酸鹽、亞硝酸鹽和磷酸鹽均呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),而藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)與之相反,呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；放線(xiàn)菌(Actinobacteria)與硫酸鹽和磷酸鹽呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；酸桿菌(Acidobacteria)與銨鹽濃度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；擬桿菌(Bacteroidetes)與銨鹽呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。鹽度、硝酸鹽濃度與優(yōu)勢(shì)菌門(mén)相關(guān)性不顯著(P>0.05)。說(shuō)明沉積物的理化性質(zhì)對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)具有重要影響。

表3 環(huán)境因子與細(xì)菌群落分析中前兩個(gè)排序軸間的相關(guān)系數(shù)

表4 多樣性和豐富度與環(huán)境因子的相關(guān)系數(shù)矩陣

Table 4 Correlation coefcient matrix of Chao 1, Shannon and environmental factors

表4 多樣性和豐富度與環(huán)境因子的相關(guān)系數(shù)矩陣

α多樣性指數(shù)Alpha diversity index鹽度SalinitypH硫酸鹽Sulfate銨鹽 Ammonium salt硝酸鹽Nitrate亞硝酸鹽Nitrite磷酸鹽PhosphateChao 1-0.787?-0.253-0.561-0.799?0.411-0.797?-0.685Shannon-0.757?-0.165-0.830?-0.5390.294-0.900??-0.839??

*: 在0.05級(jí)別(雙尾),相關(guān)性顯著; **: 在0.01級(jí)別(雙尾),相關(guān)性顯著

2.6 PICRUSt功能預(yù)測(cè)分析

為了解表層有植被和表層無(wú)植被沉積物中細(xì)菌群落功能的不同以及其在垂直方向上的變化,使用PICRUSt對(duì)兩個(gè)區(qū)域不同深度沉積物樣品的細(xì)菌群落進(jìn)行功能預(yù)測(cè)(圖7)。結(jié)果共注釋到6條KEGG一級(jí)通路,其中相對(duì)豐度大于1.0%的功能基因有環(huán)境信息處理(Environmental Information Processing)、代謝(Metabolism)、遺傳信息處理(Genetic Information Processing)和細(xì)胞轉(zhuǎn)化(Cellular Processes)4種。注釋到41條KEGG二級(jí)代謝通路,其中在所有樣品中相對(duì)豐度在1.0%以上的通路有19個(gè),如膜運(yùn)輸(Membrane Transport)、氨基酸代謝(Amino Acid Metabolism)和碳水化合物代謝(Carbohydrate Metabolism)在兩個(gè)區(qū)域的相對(duì)豐度均較高,超過(guò)10%；復(fù)制和修復(fù)(Replication and Repair)與能量代謝(Energy Metabolism)兩種通路的相對(duì)豐度也高于5%。相比較而言,膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程、氨基酸和碳水化合物代謝過(guò)程在有植被區(qū)域更為活躍,而核酸復(fù)制和修復(fù)、能量代謝過(guò)程則在無(wú)植被區(qū)域更加活躍。

表5 細(xì)菌與環(huán)境因子的相關(guān)系數(shù)矩陣

Table 5 Correlation coefcient matrix of bacteria and environmental factors

表5 細(xì)菌與環(huán)境因子的相關(guān)系數(shù)矩陣

細(xì)菌Bacteria鹽度SalinitypH硫酸鹽Sulfate銨鹽Ammonium salt硝酸鹽Nitrate亞硝酸鹽Nitrite磷酸鹽Phosphate變形菌Proteobacteria0.2870.775?0.2280.4220.1390.4010.696綠彎菌Chloroflexi-0.486-0.424-0.745?-0.189-0.211-0.747?-0.909??放線(xiàn)菌Actinobacteria0.3350.2550.723?0.258-0.2880.7060.786?酸桿菌Acidobacteria-0.523-0.357-0.244-0.823?0.575-0.552-0.475擬桿菌Bacteroidetes0.5920.396-0.0810.922??-0.3960.2620.222硝化螺旋菌Nitrospirae0.134-0.6920.069-0.137-0.065-0.126-0.387藍(lán)細(xì)菌Cyanobacteria0.5210.280.810?0.375-0.2870.792?0.875??

*:在0.05級(jí)別(雙尾),相關(guān)性顯著; **:在0.01級(jí)別(雙尾),相關(guān)性顯著

圖7 PICRUSt預(yù)測(cè)的KEGG第二等級(jí)分布圖Fig.7 The secondary grade distribution map of KEGG predicted by PICRUSt

3 討論

3.1 黃河口潮間帶沉積物中細(xì)菌豐度分布特征

植物對(duì)土壤微生物的影響是非常重要的[13]。本研究發(fā)現(xiàn)有植被覆蓋沉積物中細(xì)菌豐度高于無(wú)植被覆蓋沉積物,這與丁浩[14]等的研究結(jié)果相一致。一般看來(lái),表層覆蓋植被的土壤環(huán)境能為微生物提供適宜的棲息場(chǎng)所,特別是植物死亡后的殘?bào)w進(jìn)入沉積土壤中,可以為異養(yǎng)細(xì)菌提供豐富有效的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),促進(jìn)細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖。因此相較無(wú)植被區(qū)域,覆蓋植被的土壤中細(xì)菌豐度更高[15- 16]。本研究沉積物中細(xì)菌豐度在垂直方向上整體呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì),中層豐度最高。潮水的漲落使得潮間帶表層沉積物受到海陸理化因子的交互作用[17],不穩(wěn)定的環(huán)境條件不利于微生物的生存,因此表層細(xì)菌群落豐度較低。隨著深度的增加,環(huán)境條件趨于穩(wěn)定,有機(jī)質(zhì)逐漸累積,為細(xì)菌提供了良好的生存環(huán)境,細(xì)菌的數(shù)量也隨之增多。而更深層次的沉積物雖然環(huán)境條件穩(wěn)定,但是由表層沉積下來(lái)的可供細(xì)菌利用的碳源、氮源等逐層消耗而減少,細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖受到了限制,因此其豐度又逐漸降低。

3.2 黃河口潮間帶沉積物中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征

對(duì)黃河口潮間帶沉積物中微生物的研究一直受到國(guó)內(nèi)學(xué)者的關(guān)注。劉芳等[7]利用克隆文庫(kù)方法和T-RFLP技術(shù)在黃河口濕地發(fā)現(xiàn)大量功能菌,如硫酸鹽還原菌、光合細(xì)菌和好氣分解細(xì)菌等；王凱等[9]通過(guò)PCR-DGGE方法發(fā)現(xiàn)黃河口潮灘春季的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌有變形菌(Proteobacteria)、酸桿菌(Acidobacteria)和一些未分類(lèi)的微生物類(lèi)群。本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)黃河口潮間帶有植被和無(wú)植被區(qū)域沉積物中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有植被區(qū)域沉積物中細(xì)菌群落豐富度和多樣性低于無(wú)植被區(qū)域,這與兩個(gè)區(qū)域豐度結(jié)果相反?？赡苁且?yàn)橐粋€(gè)環(huán)境中,優(yōu)勢(shì)菌的豐度較高,會(huì)對(duì)其它非優(yōu)勢(shì)菌群的生存產(chǎn)生壓迫,以致該環(huán)境細(xì)菌群落豐富度和多樣性較低。本研究發(fā)現(xiàn)黃河口的優(yōu)勢(shì)菌有變形菌、放線(xiàn)菌(Actinobacteria)、綠彎菌(Chloroflexi)和酸桿菌等,這些均是海洋沉積物中常見(jiàn)的細(xì)菌類(lèi)群。變形菌是細(xì)菌中最大的一個(gè)門(mén)類(lèi),通常在中國(guó)沿海潮間帶沉積物環(huán)境的微生物群落結(jié)構(gòu)中占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位,例如在對(duì)大連長(zhǎng)山群島海岸潮間帶沉積物[18]和秦皇島南部近海潮間帶沉積物[19]的微生物群落結(jié)構(gòu)中均發(fā)現(xiàn)變形菌占細(xì)菌群落的60%以上,為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌。變形菌中包含較多的固氮細(xì)菌,能夠提升潮間帶氮循環(huán)[20]。放線(xiàn)菌在各類(lèi)土壤研究中也被廣泛地發(fā)現(xiàn),在濕地環(huán)境中相對(duì)豐度約2%—25%[21- 22]。本研究中放線(xiàn)菌在有植被區(qū)域表層沉積物樣品中豐度較高,而且其相對(duì)豐度與磷酸鹽含量呈顯著正相關(guān),是因?yàn)榉啪€(xiàn)菌中多數(shù)菌種為好氧腐生菌,且具有共生固氮和降解磷的作用[23],這樣更有利于分解表層土壤中的植物殘?bào)w,促進(jìn)物質(zhì)和能量的循環(huán)。兩個(gè)站位的表層樣品中藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)含量比其它層次樣品中的高,主要是因?yàn)樗{(lán)細(xì)菌含有葉綠素a,沉積物表層環(huán)境更適宜進(jìn)行光合作用,有利于其生存發(fā)展[24]。擬桿菌(Bacteroidetes)能夠降解高分子有機(jī)物[25],本研究發(fā)現(xiàn)擬桿菌在黃河口潮間帶各樣品中相對(duì)豐度較高,這樣有利于來(lái)自陸源的高分子有機(jī)污染物在潮間帶降解,減少對(duì)海洋的污染。綠彎菌(Chloroflexi)是本研究中相對(duì)豐度僅次于變形菌的第二大優(yōu)勢(shì)菌,有研究報(bào)道其在水合物貧乏、有機(jī)質(zhì)豐富的沉積物中為優(yōu)勢(shì)類(lèi)群,能夠促進(jìn)厭氧環(huán)境條件下的物質(zhì)循環(huán)[26]。

本研究在黃河口潮間帶沉積物中發(fā)現(xiàn)大量與生態(tài)修復(fù)相關(guān)的菌屬。如在表層樣品中含量豐富的蒼白桿菌屬(Ochrobactrum),其隸屬于α-變形菌,是一種好氧反硝化細(xì)菌[26],該菌具有耐金屬鎘的特性[27],而且在鹽堿條件下能夠降解多環(huán)芳烴[28],為黃河口潮間帶污染土壤的生物修復(fù)提供了一種思路；優(yōu)勢(shì)菌屬芽孢桿菌(Bacillus)是一種能形成孢子結(jié)構(gòu),具有很強(qiáng)的抗逆能力的菌屬,其在較高pH、低溫、高鹽度等惡劣環(huán)境下仍能生存,而且芽孢桿菌分泌的一種酶能夠分解一些難分解的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等物質(zhì),還能吸收環(huán)境中未被氧化的氨、銨鹽及硫化氫等,常被應(yīng)用于污水的生物處理中[29]；在有植被表層樣品中的優(yōu)勢(shì)菌屬——鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas),屬于變形菌門(mén)α變形菌綱,能夠降解芳香族化合物[30],促進(jìn)植物抵抗多種病原菌[31],是清理土壤污染物最有效的細(xì)菌之一。

濱海濕地土壤微生物具有獨(dú)特的功能和基因資源,在凈化污染物、維持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用[32]。通過(guò)PIRCUSt功能預(yù)測(cè)得知黃河口潮間帶沉積物菌群功能豐富,其中膜運(yùn)輸、碳水化合物代謝、氨基酸代謝功能最為活躍。推測(cè)是由于潮間帶沉積環(huán)境受到海水周期性淹沒(méi)的影響,只有具有活躍的膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)功能的細(xì)菌,通過(guò)調(diào)節(jié)胞內(nèi)外滲透壓,才能更好地在此生存[33]。碳水化合物是生命細(xì)胞結(jié)構(gòu)的主要成分,同時(shí)也是細(xì)胞呼吸的底物。碳水化合物代謝可以調(diào)控生物體內(nèi)碳水化合物的代謝形成、分解和相互轉(zhuǎn)化[34],該功能代謝旺盛說(shuō)明微生物生命活動(dòng)活躍。在有植被區(qū)域,植物根際會(huì)分泌有機(jī)物,其中包括碳水化合物、氨基酸和有機(jī)酸等[35],這些物質(zhì)會(huì)促進(jìn)微生物的相關(guān)代謝活動(dòng),因此有植被區(qū)域微生物碳水化合物代謝和氨基酸代謝功能較無(wú)植被區(qū)域更為活躍。無(wú)植被區(qū)域細(xì)菌群落在核酸復(fù)制和修復(fù)、能量代謝過(guò)程較有植被更為活躍,可能是由于無(wú)植被潮間帶沒(méi)有植被的保護(hù),相較有植被潮間帶環(huán)境復(fù)雜多變,優(yōu)勢(shì)細(xì)菌只有通過(guò)加強(qiáng)自身核酸復(fù)制和修復(fù)功能,加快能量代謝,讓其菌群保持活力,以確保其在惡劣環(huán)境中生存發(fā)展。本研究的不足之處是只利用PICRUSt對(duì)潮間帶表層有無(wú)植被沉積物中的細(xì)菌群落功能差異進(jìn)行了初步預(yù)測(cè),該方法具有一定的局限性。想要更全面了解潮間帶沉積物中細(xì)菌功能,可結(jié)合宏基因組分析進(jìn)行深入研究。

3.3 黃河口潮間帶沉積物環(huán)境因子對(duì)細(xì)菌群落的影響

土壤環(huán)境因子對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)有重要影響。姜雪薇等[36]發(fā)現(xiàn)土壤pH、含水量、總氮和總磷是影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的重要因素；王鵬等[37]認(rèn)為濕地土壤細(xì)菌群落主要受有機(jī)質(zhì)含量、總磷和銨態(tài)氮的影響；張小青[38]發(fā)現(xiàn)pH、TC和TN是影響荒漠土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主導(dǎo)因子。本研究結(jié)果顯示黃河口潮間帶鹽度、亞硝酸鹽、銨鹽以及磷酸鹽與細(xì)菌群落多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)表現(xiàn)出不同程度的相關(guān)性。鹽度是影響河口生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)的重要因素[39- 40],本研究中細(xì)菌多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)均與鹽度呈顯著負(fù)相關(guān),可能是由于土壤鹽度的增加和滲透壓的提高會(huì)使某些微生物物種消失,導(dǎo)致細(xì)菌群落多樣性下降。本研究中土壤pH與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的相關(guān)性均不顯著,與已有的研究結(jié)果不同[41],可能是由于選取的黃河口潮間帶研究區(qū)域pH變化范圍小,對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的影響不明顯。本研究結(jié)果顯示多個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)與亞硝酸鹽、磷酸鹽、銨鹽相關(guān)性顯著,如擬桿菌的相對(duì)豐度與銨鹽含量呈極顯著正相關(guān),因?yàn)閿M桿菌中含有多種固氮菌[42],能將空氣中氮?dú)夤潭?進(jìn)而轉(zhuǎn)化為銨鹽；綠彎菌與亞硝酸鹽、磷酸鹽含量呈顯著負(fù)相關(guān),是由于綠彎菌具有去除營(yíng)養(yǎng)鹽的功能[43]。這進(jìn)一步證實(shí)了土壤環(huán)境因子對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有重要影響。

4 結(jié)論

(1)黃河口潮間帶沉積物中細(xì)菌豐度在不同深度差異較大,總體表現(xiàn)為隨深度的增加細(xì)菌豐度先升高后降低的趨勢(shì)。有植被區(qū)域豐度為3.55×105—1.29×107拷貝數(shù)/g,無(wú)植被區(qū)域?yàn)?.76×102—4.23×106拷貝數(shù)/g,表明植被及沉積物深度是影響沉積物中細(xì)菌豐度的重要因素。

(2)黃河口潮間帶有植被區(qū)域檢測(cè)到50個(gè)細(xì)菌門(mén),無(wú)植被區(qū)域檢測(cè)到56個(gè)細(xì)菌門(mén),優(yōu)勢(shì)菌門(mén)有變形菌、放線(xiàn)菌、酸桿菌等。屬水平上優(yōu)勢(shì)菌Ochrobactrum和Sphingomonas獨(dú)特的代謝功能能夠降解鹽堿沉積物中的有機(jī)污染物,可以通過(guò)微生物培養(yǎng)方法將其應(yīng)用到潮間帶生態(tài)系統(tǒng)修復(fù)工程中。