基于miR-93-5p/PTEN軸利拉魯肽對MI/R大鼠心肌細胞氧化應激的影響

劉 娜 劉 斌 曹廣林

心肌缺血再灌注(myocardial ischemia reperfusion，MI/R)損傷造成的氧化應激、炎性反應等，可導致心肌細胞凋亡、心肌纖維化，引起心功能障礙[1,2]。利拉魯肽(liraglutide，LIR)是一種人胰高糖素樣肽-1類似物，LIR可降低氧化應激水平，抑制高糖誘導的髓核細胞凋亡，還可抑制內(nèi)皮細胞炎性反應，改善內(nèi)皮功能障礙[3,4]。在MI/R中LIR具有抑制心肌細胞凋亡、改善心功能障礙的作用[5]。miR-93是一種微小核糖核酸(microRNA，miRNA)，在心肌梗死模型中具有促進血管再生、抑制心肌細胞凋亡和心肌纖維化、改善心功能障礙的作用[6]。但LIR能否通過miR-93發(fā)揮心臟保護作用仍需進一步研究，本研究建立MI/R大鼠模型，探討LIR抗心肌損傷作用，為臨床治療提供參考。

材料與方法

1.實驗動物和細胞系：SPF級雄性SD大鼠，60只，8周齡，體質量180～200g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物許可證號：SYXK(京)2017-0033；H9C2心肌細胞系購自美國ATCC公司。

2.試劑和儀器：LIR(丹麥諾和諾德制藥公司)；anti-miR-93-5p和miR-93-5p mimic(美國RiboBio公司)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)，肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme-MB，CK-MB)，心肌肌鈣蛋白I(cardiac troppnin I，cTnI)試劑盒(英國朗道公司)；兔抗大鼠第10號染色體缺失的磷酸酶張力蛋白同源物基因(phosphate and tension homology deleted on chromosome ten，PTEN)，磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)，蛋白絲/蘇氨酸激酶(serine/threonine protein kinase B，Akt)、p-Akt抗體(英國Abcam公司)；小動物呼吸機(中國瑞沃德生命科技有限公司)。

3. 分組與給藥：60只大鼠隨機分sham組、MI/R組、LIR組、anti-miR-93-5p組和anti-miR-93-5p+LIR組，每組12只。LIR組和anti-miR-93-5p+LIR組皮下注射LIR 70μg/kg，1次/天，連續(xù)8天，sham組、MI/R組和anti-miR-93-5p組皮下注射0.9%氯化鈉注射液；第5天，anti-miR-93-5p組和anti-miR-93-5p+LIR組心肌內(nèi)注射anti-miR-93-5p 200μl，sham組、MI/R組和LIR組大鼠注射0.9%氯化鈉溶液。第8天給藥后2h，除sham組外，其余大鼠結扎左冠狀動脈前降支，以ST段抬高、左心室前壁變蒼白為結扎成功，60min后松開結扎線灌注4h。sham組大鼠僅在左冠狀動脈前降支相同部位掛線，但不結扎，其余操作同上。

4.ELISA法檢測心肌損傷指標：分別在冠狀動脈結扎前、結扎60min后、灌注4h后3個時間點檢測心肌損傷指標，結扎前及結扎60min后兩個時間點采取內(nèi)眥靜脈血，灌注4h后主動脈采血，3000r/min，離心15min，收集上清。根據(jù)ELISA試劑盒說明書進行上樣、孵育、洗滌、顯色，加入終止液后將96孔板置于酶標儀上，450nm波長處讀取吸光度(A)值，根據(jù)標準品制作標準曲線，計算血清中LDH、CK-MB、cTnI含量。

5.TUNEL染色檢測心肌細胞凋亡：采血完畢，取部分心肌組織，4%多聚甲醛固定24h，脫水、包埋、切片，二甲苯透明，脫水，蛋白酶K室溫孵育20min，3%H2O2孵育10min，TUNEL混合液37℃孵育1h。50μl POD標記的抗熒光素抗體37℃孵育30 min，DAB顯色、蘇木精復染，脫水、透明、封片后光學顯微鏡下觀察。隨機選取6個視野，計算心肌細胞凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)，AI(%)=(陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù))×100%。

6.氧化應激指標測定：取部分心肌組織，剪碎，加入抑肽酶后煮沸10min，4℃ 3000r/min離心15min，收集上清液。黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，硫代巴比妥酸法測定MDA含量，均按照試劑盒說明書進行。于波長550nm處測定A值并計算SOD活性，波長532nm處測定A值并計算MDA含量。

7.RT-PCR檢測miR-93-5p水平：取部分心尖組織，液氮研磨。Trizol法提取總RNA，測定RNA濃度和純度，反轉錄cDNA，反應體系：Taq酶10μl，上下游引物各0.8μl，以cDNA為模板 2μl進行qPCR，反應條件：95℃ 5min，95℃ 15s，60℃ 1min，40個循環(huán)。以U6為內(nèi)參，實驗數(shù)據(jù)采用2-△△CT法。引物序列詳見表1。

表1 PCR反應引物序列

8.雙熒光素酶報告基因測定PTEN和miR-93-5p的靶向關系：分析預測miR-93-5p的靶基因及兩者結合位點，擴增miR-93-5p和PTEN的結合片段，并將該片段插入pcDNA中，構建野生(wt)型和突變(mut)型質粒PTEN質粒，與miR-93-5p mimic、NC共轉染H9C2心肌細胞。按照Luciferase報告基因試劑盒說明書檢測各組熒光素酶活性。

9.蛋白印跡法檢測心肌組織中PTEN、PI3K、p-Akt蛋白表達：取40mg左右心肌組織，勻漿，RIPA裂解。4℃ 12000r/min離心10min，離心半徑為10cm，收集上清。BCA法測定蛋白濃度，加入溴酚藍后煮沸使蛋白變性。120V恒壓電泳1.5h，每孔上樣20μl，TBST洗膜3次，每次5min，封閉2h，PTEN、PI3K、Akt、p-Akt一抗(1∶1000)4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次5min，二抗(1∶5000)室溫孵育2h后，TBST洗膜3次，每次5min，ECL顯色法顯色。Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH蛋白條帶灰度值的比值，作為目的蛋白相對表達水平。

結 果

1.LIR減輕MI/R大鼠心肌損傷：冠狀動脈結扎前、結扎60min后及再灌注4h后，ELISA法檢測血清中心肌損傷指標的含量。冠狀動脈結扎前CK-MB、LDH、cTnI組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結扎60min后及再灌注4h后，與sham組比較，MI/R組CK-MB、LDH、cTnI均升高(P<0.05)；與MI/R組比較，LIR組CK-MB、LDH、cTnI均降低，anti-miR-93-5p組CK-MB、LDH、cTnI均升高(P<0.05)；與LIR組比較，anti-miR-93-5p+LIR組CK-MB、LDH、cTnI均升高(P<0.05)；與anti-miR-93-5p組比較，anti-miR-93-5p+LIR組CK-MB、LDH、cTnI均降低(P<0.05，表2)。

2.LIR降低MI/R大鼠心肌細胞AI：冠狀動脈左前降支結扎60min再灌注4h后，TUNEL染色檢測心肌細胞凋亡情況。與sham組比較，MI/R組心肌細胞AI升高(P<0.05)；與MI/R組比較，LIR組心肌細胞AI降低，anti-miR-93-5p組心肌細胞AI升高(P<0.05)；與LIR組比較，anti-miR-93-5p+LIR組心肌細胞AI升高(P<0.05)；與anti-miR-93-5p組比較，anti-miR-93-5p+LIR組心肌細胞AI降低(P<0.05，表3)。

表3 心肌細胞AI比較

3.LIR降低MI/R大鼠心肌組織氧化應激水平：冠狀動脈左前降支結扎60min再灌注4h后，檢測心肌組織中氧化應激指標。與sham組比較，MI/R組MDA含量升高，SOD活性降低(P<0.05)；與MI/R組比較，LIR組MDA含量降低，SOD活性升高，anti-miR-93-5p組MDA含量升高，SOD活性降低(P<0.05)；與LIR組比較，anti-miR-93-5p+LIR組MDA含量升高，SOD活性降低(P<0.05)；與anti-miR-93-5p組比較，anti-miR-93-5p+LIR組MDA含量降低，SOD活性升高(P<0.05,表4)。

表4 心肌組織中MDA含量和SOD活性比較

4.LIR提高MI/R大鼠miR-93-5p表達：冠狀動脈左前降支結扎60min再灌注4h后，PCR法檢測心肌組織中miR-93-5p的表達。與sham組比較，MI/R組miR-93-5p表達降低(P<0.05)；與MI/R組比較，LIR組miR-93-5p表達升高，anti-miR-93-5p組miR-93-5p表達降低(P<0.05)；與LIR組比較，anti-miR-93-5p+LIR組miR-93-5p表達降低(P<0.05)；與anti-miR-93-5p組比較，anti-miR-93-5p+LIR組miR-93-5p表達升高(P<0.05，表5)。

表5 心肌組織中miR-93-5p水平比較

5.miR-93-5p靶向作用于PTEN：將miR-93-5p mimic、NC、PTEN mut或PTEN wt轉染H9C2細胞后，雙熒光素酶報告基因檢測熒光素酶相對活性。結果顯示，轉染miR-93-5p mimic后PTEN wt的熒光素酶活性降低，而對PTEN mut的熒光素酶活性無影響(圖1，表6)。

圖1 PTEN和miR-93-5p結合位點

表6 熒光素酶相對活性比較

6.LIR對心肌組織中PTEN、p-Akt、PI3K蛋白的影響：冠狀動脈左前降支結扎60min再灌注4h后，蛋白印跡法檢測心肌組織中蛋白表達。與sham組比較，MI/R組PTEN蛋白表達升高，p-Akt、PI3K蛋白表達降低(P<0.05)；與MI/R組比較，LIR組PTEN蛋白表達降低，p-Akt、PI3K蛋白表達升高(P<0.05)，anti-miR-93-5p組PTEN蛋白表達升高，p-Akt、PI3K蛋白表達降低(P<0.05)；與LIR組比較，anti-miR-93-5p+LIR組PTEN蛋白表達升高，p-Akt、PI3K蛋白表達降低(P<0.05)；與anti-miR-93-5p組比較，anti-miR-93-5p+LIR組PTEN蛋白表達降低，p-Akt、PI3K蛋白表達升高(P<0.05)。Akt組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,表7，圖2)。

圖2 心臟組織中各蛋白檢測A.sham組；B.MI/R組；C.LIR組；D.anti-miR-93-5p組；E.anti-miR-93-5p+LIR組

討 論

MI/R時由于線粒體功能受損，氧化應激水平升高，進一步加重心肌損傷，導致心肌細胞凋亡，心臟收縮和舒張功能障礙[7,8]。miRNA參與調節(jié)細胞凋亡、細胞自噬、DNA修復等多種生理過程。LIR可降低糖尿病小鼠心肌細胞氧化應激水平、減輕高血壓小鼠心肌纖維化、抑制心肌細胞凋亡，改善心功能障礙[9,10]。LIR調節(jié)JAK/STAT信號通路在1型糖尿病中發(fā)揮抗炎作用，而且LIR通過下調miR-124a減輕非酒精性脂肪性肝病[11，12]。本研究通過建立MI/R大鼠模型，探討LIR是否作用于miR-93-5p，降低氧化應激水平，改善心肌損傷。

CK-MB、LDH、cTnI作為心肌損傷的標志物，已經(jīng)成為臨床上評估心肌損傷的金標準。本研究中冠狀動脈結扎前大鼠心肌損傷指標比較差異無統(tǒng)計學意義，冠狀動脈結扎60min后及再灌注4h后大鼠CK-MB、LDH、cTnI、AI均升高，LIR預處理降低血清中CK-MB、LDH、cTnI的含量及AI，表明LIR可改善MI/R大鼠心肌損傷。研究表明，細胞氧化應激水平升高常表現(xiàn)為MDA含量升高，SOD活性降低[13,14]。本研究MI/R時MDA含量升高，SOD活性降低，LIR可降低MDA含量，增強SOD活性，提示LIR降低MI/R大鼠心臟組織氧化應激水平。

miR-93具有促細胞再生、抗細胞凋亡的作用[15,16]。本研究MI/R大鼠心肌組織中miR-93-5p水平降低，應用LIR后miR-93-5p水平升高，說明LIR可能通過上調miR-93-5p，發(fā)揮心肌保護作用。研究發(fā)現(xiàn)，PTEN/PI3K/Akt信號通路激活具有抑制MI/R大鼠心肌細胞凋亡、減輕四氯化碳誘導的肝臟纖維化、改善心肌缺血造成的心功能障礙[17～19]。本研究結果顯示，MI/R大鼠心肌組織中PTEN/PI3K/Akt信號通路蛋白表達異常，LIR對該通路具有調節(jié)作用，為進一步了解LIR是否通過miR-93-5p調節(jié)PTEN/PI3K/Akt信號通路減輕MI/R大鼠心肌損傷，MI/R大鼠心肌內(nèi)注射anti-miR-93-5p后皮下注射LIR，雙熒光素酶報告基因法證明miR-93-5p與PTEN具有直接靶向關系，蛋白印跡法證明MI/R大鼠心肌組織中miR-93-5p表達下調時，PTEN蛋白表達降低，PI3K、p-Akt蛋白表達升高，給予LIR后逆轉miR-93-5p下調對PTEN、PI3K、p-Akt蛋白表達的影響，提示miR-93-5p可能參與LIR對PTEN/PI3K/Akt信號通路的調節(jié)。

綜上所述，LIR通過上調miR-93-5p，靶向調節(jié)PTEN，發(fā)揮抗氧化應激作用，從而改善MI/R大鼠心肌損傷，為臨床治療MI/R提供實驗依據(jù)。