不同碘攝入水平對(duì)子代大鼠學(xué)習(xí)記憶及運(yùn)動(dòng)能力的影響

黃 佳 王琛琛 祝宇銘 郜振國(guó) 樊玉娟 馬品江

碘是人體合成甲狀腺激素的必須微量元素。生命早期的神經(jīng)細(xì)胞遷移、髓鞘形成和突觸傳遞過(guò)程均離不開甲狀腺激素的作用[1～3]。孕期碘缺乏引起的低甲狀腺素血癥可能會(huì)導(dǎo)致胎兒不同程度的腦損傷，同時(shí)還會(huì)增大流產(chǎn)、死產(chǎn)的發(fā)生率[4,5]。反之,孕期過(guò)量碘攝入會(huì)增加孕婦患甲狀腺疾病尤其是亞甲減的風(fēng)險(xiǎn)，并影響新生兒的甲狀腺功能[6,7]。因此妊娠期間適宜的碘攝入量對(duì)母體甲狀腺激素的合成和維護(hù)正常胎兒的大腦發(fā)育是必不可少的。本研究通過(guò)建立不同碘攝入量的大鼠動(dòng)物模型，定量評(píng)價(jià)個(gè)體碘營(yíng)養(yǎng)的狀況，在此基礎(chǔ)上結(jié)合平衡木實(shí)驗(yàn)、鋼絲夾持實(shí)驗(yàn)、轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，探討母體不同碘攝入水平對(duì)子代學(xué)習(xí)和運(yùn)動(dòng)能力的影響。

對(duì)象與方法

1.主要儀器與試劑：Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)(ZS-001，北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司)，疲勞轉(zhuǎn)棒儀(ZB-200，成都泰盟軟件有限公司)，平衡木及鋼絲夾持實(shí)驗(yàn)裝置(課題組自制)，紫外可見分光光度計(jì)(UNICO UV-4802型，上海尤尼柯儀器有限公司)，碘化鉀(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào):20180412)，尿中碘的砷鈰催化分光光度測(cè)定方法配套試劑盒(武漢眾生生化技術(shù)有限公司，批號(hào):04202085)，低碘動(dòng)物飼料(北京科澳協(xié)力飼料有限公司)。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選擇斷乳2周的SPF級(jí)Wistar大鼠，雌性150只，雄性50只，大鼠被安置在24±1℃的溫度下，并保持在每天12h光照/12h黑暗中，依次循環(huán)。本次研究所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由新疆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(新)2016-0001，實(shí)驗(yàn)在新疆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。

3.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理:(1)不同碘攝入水平大鼠模型的建立：雌鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量分層分為碘缺乏1組(SID組)、碘缺乏2組(MID組)、適碘對(duì)照組(NI組)、碘過(guò)量1組(MIE組)和碘過(guò)量2組(SIE組)，各組均給予低碘動(dòng)物飼料，低碘動(dòng)物飼料配制以GB14924.3-2010《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物配合飼料營(yíng)養(yǎng)成分》為參考，碘含量為50μg/kg，各組通過(guò)飲水加入碘酸鉀使大鼠攝入碘水平達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求，碘酸鉀濃度依次為0、50、183、2283和11617μg/L，根據(jù)大鼠每日飲食攝入量飼料30g、水30ml，5組大鼠的碘攝入量分別為1.5、3、7、70和350μg/d，干預(yù)3個(gè)月建立模型[8]。(2)模型判定：干預(yù)滿3個(gè)月將雌鼠放入代謝籠，收集24h尿液測(cè)定尿碘，尿碘采用《尿中碘的測(cè)定第一部分：砷鈰催化分光光度測(cè)定方法》(WS/T 107.1-2016)進(jìn)行測(cè)定，3組尿碘值依次增高并差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義為建模成功。(3)動(dòng)物處理：3個(gè)月后，雌性大鼠與正常雄性大鼠(雄鼠正常飼養(yǎng)條件)交配(雌性∶雄性=3∶1)。陰道塞出現(xiàn)當(dāng)天被確定為妊娠日第1天(gestational day, GD0)。從GD0到產(chǎn)后(postnatal，PN)第21天(PN21)，懷孕大鼠與孕前喂養(yǎng)條件相同直至生產(chǎn)。子代大鼠在PN14和PN21時(shí)每組各取12只(均為雌雄各半)子代大鼠，進(jìn)行運(yùn)動(dòng)能力及行為學(xué)測(cè)試。

4.運(yùn)動(dòng)能力測(cè)試：(1)平衡木實(shí)驗(yàn)：在兩個(gè)平臺(tái)之間放置一個(gè)固定在地板上方30cm的長(zhǎng)木梁(長(zhǎng)100cm，直徑1.5cm)。啟動(dòng)平臺(tái)被照亮，以觸發(fā)大鼠的移動(dòng)，記錄穿越光束所需的時(shí)間。最大潛伏期為120s。(2)鋼絲夾持實(shí)驗(yàn)：每只大鼠的前爪懸掛在離地面上方30cm的鋼絲上(長(zhǎng)40cm，直徑2mm)，記錄從鋼絲上掉下來(lái)之前的延遲時(shí)間。大鼠休息60s進(jìn)行下次測(cè)量，測(cè)量2次取平均值。(3)轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)：使用疲勞轉(zhuǎn)棒儀每天對(duì)大鼠進(jìn)行轉(zhuǎn)棒訓(xùn)練3次，使大鼠在5min內(nèi)基本能夠隨轉(zhuǎn)棒而做相應(yīng)的運(yùn)動(dòng)，以10r/min的速度迫使大鼠在棒上運(yùn)動(dòng)，記錄其在轉(zhuǎn)棒上的停留時(shí)間，測(cè)量2次取平均值。

5.Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)分為定位航行階段和空間探索階段:(1)定位航行實(shí)驗(yàn)：將受試大鼠按順時(shí)針方向依次自第1、2、3、4象限(除去平臺(tái)所在象限)入水點(diǎn)順序放入水中，記錄60s內(nèi)尋找平臺(tái)的時(shí)間(逃逸潛伏期)，以大鼠逃逸潛伏期的長(zhǎng)短來(lái)評(píng)價(jià)大鼠的空間學(xué)習(xí)能力。(2)空間探索實(shí)驗(yàn)：定位航行實(shí)驗(yàn)全部結(jié)束后，次日進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，撤去平臺(tái)，然后在第1象限相同的入水點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水中，記錄大鼠在60s內(nèi)穿越原平臺(tái)區(qū)域的次數(shù)，以及大鼠在平臺(tái)各象限停留的時(shí)間及游動(dòng)距離，以此判斷大鼠空間記憶存儲(chǔ)及提取再現(xiàn)的能力。

結(jié) 果

1.不同碘攝入大鼠模型尿碘水平：干預(yù)3個(gè)月后，5組大鼠尿碘中位數(shù)分別為3.540、51.410、286.801、644.192、2368.701μg/L，詳見表1。隨著飲水碘干預(yù)劑量的升高大鼠尿碘中位數(shù)呈倍數(shù)增加，經(jīng)非參數(shù)Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)，5組間大鼠尿碘含量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=94.791，P<0.05)。經(jīng)多重檢驗(yàn)，各組大鼠與NI組尿碘含量比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-5.416、-5.416、-5.361、-5.410，P<0.05)。

表1 不同水碘劑量干預(yù)組大鼠尿碘水平及比較[M(Q1,Q3)]

2.不同碘攝入水平對(duì)子代大鼠運(yùn)動(dòng)能力的影響：子代大鼠運(yùn)動(dòng)能力測(cè)試實(shí)驗(yàn)結(jié)果詳見表2。5個(gè)劑量組平衡木通過(guò)時(shí)間及在平衡木上發(fā)生打滑次數(shù)、在鋼絲上的懸掛時(shí)間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.640，χ2=11.873，F(xiàn)=3.178，P<0.05)。5個(gè)劑量組轉(zhuǎn)棒持續(xù)時(shí)間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.741，P>0.05)。

3.不同碘攝入水平對(duì)子代大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響：(1)定位航行實(shí)驗(yàn)：子代大鼠在第2天和第3天各組逃避潛伏期均數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.816、8.538，P<0.05)，各劑量組均比適碘對(duì)照組長(zhǎng)且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表3)。(2)空間探索實(shí)驗(yàn)：各組子代大鼠有效區(qū)域運(yùn)動(dòng)時(shí)間均比適碘對(duì)照組短，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.032，P<0.05)，穿過(guò)平臺(tái)的次數(shù)也比NI組少且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z1=-2.469，Z2=-2.373，Z4=-2.692，Z5=-3.319，P<0.05，表4)。

表4 不同碘攝入水平對(duì)子代大鼠空間搜索時(shí)間的影響

討 論

碘是機(jī)體必需的微量元素，碘缺乏及碘過(guò)量均會(huì)影響子代的海馬神經(jīng)元發(fā)育，降低其學(xué)習(xí)記憶能力[8～10]。既往研究多集中于嚴(yán)重的碘缺乏及碘過(guò)量，但在實(shí)際生活中，這種極端的碘營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)是不常見的，而多見于超出適宜量的輕度碘缺乏及碘過(guò)量，該狀態(tài)是否已經(jīng)對(duì)機(jī)體及子代產(chǎn)生影響存在爭(zhēng)議，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

本實(shí)驗(yàn)中按照碘適宜組大鼠碘攝入水平的1/4、1/2、10倍、50倍建立不同碘攝入水平大鼠模型,對(duì)其子代大鼠進(jìn)行運(yùn)動(dòng)能力測(cè)試時(shí)孕期嚴(yán)重碘缺乏會(huì)導(dǎo)致子代大鼠運(yùn)動(dòng)能力降低，輕度缺碘(碘適宜量的1/2倍)、碘適宜量的10倍及50倍可能還未引起子代大鼠的運(yùn)動(dòng)能力損傷。本研究測(cè)試了出生21天子代大鼠(相當(dāng)于人的幼兒期)在水迷宮實(shí)驗(yàn)中的學(xué)習(xí)記憶能力。定位巡航實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著實(shí)驗(yàn)日的增加，到達(dá)平臺(tái)的潛伏期明顯縮短，說(shuō)明子代大鼠在水迷宮實(shí)驗(yàn)中有一定的學(xué)習(xí)記憶能力。第2天和第3天各劑量組子代大鼠逃避潛伏期時(shí)間均比NI組長(zhǎng)且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力受到影響，但這也不能完全排除可能是由于缺碘或高碘導(dǎo)致子代大鼠出現(xiàn)甲狀腺功能減退而致心率變慢、代謝減少、行動(dòng)能力下降，從而逃避潛伏期延長(zhǎng)。空間探索實(shí)驗(yàn)顯示，SID組和SIE組較NI組有效區(qū)域運(yùn)動(dòng)時(shí)間短，同時(shí)各組穿過(guò)目標(biāo)象限的次數(shù)均比NI組少，均提示孕期不同程度的碘缺乏和碘過(guò)量都會(huì)對(duì)子代學(xué)習(xí)記憶能力產(chǎn)生影響。

關(guān)于孕期輕度碘缺乏對(duì)子代神經(jīng)發(fā)育影響的報(bào)道各有差異，也是學(xué)者們的研究熱點(diǎn)。本研究提示孕期不同程度碘缺乏對(duì)子代學(xué)習(xí)記憶能力產(chǎn)生一定的影響,同聶珺妍等[11]的研究結(jié)果一致，其中嚴(yán)重缺碘組對(duì)子代大鼠運(yùn)動(dòng)能力產(chǎn)生一定的損傷，但其余各組未發(fā)現(xiàn)明顯的損傷作用。已有大量研究證實(shí)，高碘暴露會(huì)損害認(rèn)知功能[12，13]。本實(shí)驗(yàn)中碘過(guò)量1組和碘過(guò)量2組均未對(duì)子代大鼠運(yùn)動(dòng)能力有明顯的損傷，但學(xué)習(xí)記憶能力產(chǎn)生了明顯影響，這可能是由于各研究中定義高碘的碘酸鉀的劑量各不相同，本次研究只能提示超過(guò)碘適宜的10倍和50倍的碘攝入劑量未對(duì)子代的運(yùn)動(dòng)能力產(chǎn)生損傷，但對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力產(chǎn)生影響。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，碘缺乏和碘過(guò)量均會(huì)引起不同程度的神經(jīng)發(fā)育障礙，表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)能力和學(xué)習(xí)記憶能力的下降，其中學(xué)習(xí)記憶能力較為明顯，為孕期碘缺乏和碘過(guò)量致子代大鼠神經(jīng)發(fā)育的影響提供了依據(jù)。