基于基線等比增減設(shè)計(jì)法優(yōu)選牛膝白芍對帕金森病肝陽上亢證小鼠神經(jīng)保護(hù)作用的最佳配比研究

張靜艷 郭科東 金 明 榮 華 張曉杰

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)是中老年人群常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以肌肉強(qiáng)直、靜止性震顫等癥狀為主要臨床表現(xiàn)，其發(fā)生率逐年上升，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。PD的治療目前以外源性補(bǔ)充多巴胺(dopamine，DA)為主，雖然能夠改善疾病的癥狀，但由于缺乏神經(jīng)保護(hù)作用，不能阻止神經(jīng)元的變性、疾病進(jìn)展及致殘。因此需要進(jìn)一步研究有效治療PD的潛在新療法[2，3]。

鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯記載于《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》,臨床用于肝腎陰虧、肝陽上亢型PD療效顯著[4]。但大復(fù)方藥味復(fù)雜，不同成分疊加后的作用難以預(yù)測。牛膝與白芍是鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯的核心藥對，是治療帕金森病方劑中出現(xiàn)頻率較高的單味中藥，且筆者課題組前期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，牛膝與白芍有效組分配伍對PD多巴胺能神經(jīng)元具有協(xié)同保護(hù)作用，但其配伍的體內(nèi)研究尚未有報(bào)道[5，6]。本實(shí)驗(yàn)提取鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯的君藥牛膝和臣藥白芍為核心藥對，以基線等比增減設(shè)計(jì)法為基礎(chǔ)，牛膝與白芍2∶1為基線向兩側(cè)擴(kuò)展，直至擴(kuò)大到極點(diǎn)(0∶4、4∶0)，最后形成牛膝與白芍 0∶4、1∶4、1∶2、1∶1、2∶1、4∶1、4∶0配比組，探索其在體內(nèi)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的最佳配伍比例[7]。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料：8周齡C57BL/6雄性小鼠90只，體質(zhì)量為22±2g，由維通利華(北京)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006。附子(D4120201)購自黃岡金貴中藥發(fā)展有限公司，懷牛膝(801000130)、白芍(801001062)均購自北京同仁堂飲片有限公司，分別以相應(yīng)比例混合。所有藥材按傳統(tǒng)煎藥法制成含生藥附子0.2g/ml、牛膝白芍0.5g/ml藥液。MPTP(M 0896)購自美國Sigma公司，兔抗鼠TH抗體(2792S)購自美國CST公司,β-actin抗體(4967S)購自美國CST公司，羊抗兔IgG抗體(BA1054)購自武漢博士德生物工程公司。

2.動(dòng)物分組、造模及給藥：小鼠采用數(shù)字表法隨機(jī)分為對照組、模型組、牛膝白芍不同配比組，共9組，每組10只。除對照組外，各組小鼠給予附子湯[3g/(kg·d)]灌胃4周制備肝陽上亢證動(dòng)物模型[8]。灌胃結(jié)束后，牛膝白芍不同配比組連續(xù)14天灌胃相應(yīng)比例藥物[6.5g/(kg·d)，按小鼠平均體質(zhì)量23g計(jì)算即每天每只小鼠給藥量為150mg]，對照組、模型組給予等體積蒸餾水。于給予治療藥物第10天開始，模型組、牛膝白芍不同配比組小鼠腹腔注射MPTP[30mg/(kg·d)]連續(xù)5天制備PD肝陽上亢證結(jié)合模型[9]。灌胃及腹腔注射過程中死亡的小鼠直接予以剔除。

3.小鼠易激惹程度觀察及評(píng)分：Ⅰ級(jí)：捉持小鼠頭頸時(shí)出現(xiàn)尖叫、驚跳；Ⅱ級(jí)：捉持小鼠頭頸時(shí)咬人；Ⅲ級(jí)：小鼠被提尾時(shí)尖叫、驚跳或與同籠小鼠廝斗。Ⅰ～Ⅲ級(jí)均不出現(xiàn)者為0級(jí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束前測量1次[10]。

4.轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)檢測小鼠協(xié)調(diào)平衡能力：轉(zhuǎn)棒儀起始轉(zhuǎn)速為4r/min，最大轉(zhuǎn)速為40r/min，加速度為0.12r/min，測試時(shí)間為5min，記錄小鼠在轉(zhuǎn)棒上停留的時(shí)間，即掉落潛伏期[11]。

6.免疫組化法分析TH陽性神經(jīng)元平均光密度：黑質(zhì)區(qū)石蠟包埋切片，進(jìn)行脫蠟、抗原修復(fù)、封閉。PBS漂洗后滴加按1∶200稀釋的TH一抗。PBS清洗后滴加二抗(1∶100),進(jìn)行DAB顯色，蘇木精復(fù)染,PBS返藍(lán)，脫水封片。使用Image-Pro Plus 6.0軟件測定TH陽性蛋白的表達(dá),根據(jù)其累積吸光度計(jì)算各組的平均吸光度(MOD)。

7.Western blot法檢測黑質(zhì)TH蛋白表達(dá)：冰上取鼠腦黑質(zhì)，BCA法進(jìn)行蛋白定量，SDS凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入TH抗體(1∶1000)4℃過夜；二抗(1∶6000)孵育；TBST清洗后進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，凝膠成像系統(tǒng)顯影，并用AlphaEase FC圖像分析軟件對免疫印跡條帶進(jìn)行密度掃描，以TH/β-actin比較各組蛋白相對表達(dá)水平。

結(jié) 果

1.小鼠易激惹程度的比較:與對照組比較，模型組小鼠易激惹程度明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，牛膝白芍1∶4、1∶2、1∶1、2∶1組小鼠易激惹程度明顯降低(P<0.05)，而牛膝白芍0∶4、4∶1、4∶0組小鼠易激惹程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。

表1 小鼠易激惹程度的比較

2.小鼠轉(zhuǎn)棒掉落潛伏期的比較:與對照組比較，模型組小鼠掉落潛伏期明顯縮短(P<0.05)；與模型組比較，牛膝白芍各配比組小鼠掉落潛伏期明顯延長(P<0.05，表2)。

表2 小鼠轉(zhuǎn)棒掉落潛伏期的比較

3.聯(lián)合指數(shù)法對牛膝與白芍聯(lián)用協(xié)同作用的分析:等效線圖顯示所有配比組聯(lián)合用藥數(shù)據(jù)點(diǎn)均在等效線下方，CI值均<1，提示兩藥在不同比例配伍時(shí)均具有協(xié)同增效作用。其中在牛膝與白芍以1∶2比例配伍時(shí)，聯(lián)合指數(shù)(CI=0.860)最小，效應(yīng)值(Fa=0.235)最大，即協(xié)同增效作用最佳(圖1、表3)。

圖1 牛膝白芍不同配比等效線圖1.牛膝白芍1∶4組；2.牛膝白芍1∶2組；3.牛膝白芍1∶1組；4.牛膝白芍2∶1組；5.牛膝白芍4∶1組

表3 牛膝白芍不同配比聯(lián)合指數(shù)及效應(yīng)值

4.小鼠TH免疫組化結(jié)果比較:與對照組比較，模型組小鼠黑質(zhì)TH平均吸光度值顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，牛膝白芍各配比組黑質(zhì)TH平均吸光度值均明顯增高(P<0.05或P<0.01)，而其中以牛膝白芍1∶2組增高更為明顯(P<0.01，圖2、表4)。

圖2 各組小鼠TH表達(dá)水平(免疫組化法，×400)A.對照組;B.模型組;C.牛膝白芍0∶4組;D.牛膝白芍1∶4組;E.牛膝白芍1∶2組;F.牛膝白芍1∶1組;G.牛膝白芍2∶1組;H.牛膝白芍4∶1組;I.牛膝白芍4∶0組

表4 各組小鼠黑質(zhì)TH平均吸光度比較

5.小鼠腦組織TH蛋白相對表達(dá)量的比較:與對照組比較，模型組小鼠黑質(zhì)TH蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.01)；與模型組比較，牛膝白芍不同配比組小鼠黑質(zhì)TH蛋白表達(dá)均明顯增加(P<0.05)，而其中以1∶2組蛋白表達(dá)增加更為明顯(P<0.01，圖3)。

圖3 各組小鼠腦組織TH蛋白相對表達(dá)水平A.TH免疫印跡圖；B.TH統(tǒng)計(jì)直方圖。與對照組比較,*P<0.01；與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01

討 論

PD發(fā)病的根本原因?yàn)楹谫|(zhì)DA能神經(jīng)元的進(jìn)行性缺失，DA類藥物替代療法仍是西醫(yī)臨床常用的治療手段。由于神經(jīng)退行性疾病的治療藥物多具有一定的毒性及不良反應(yīng)，中醫(yī)藥對PD的研究越來越受到廣泛關(guān)注[14]。牛膝白芍是臨床治療帕金森病幾十余首方劑的常用配伍藥對，牛膝補(bǔ)益肝腎、引火下行，白芍滋陰生津、緩急止痙[15,16]。兩藥配伍，補(bǔ)腎柔肝，潛陽熄風(fēng)。鑒于中藥大復(fù)方藥味的復(fù)雜性，藥對的比例及作用難以在方劑中研究與確定，本實(shí)驗(yàn)在前期體外研究的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)牛膝與白芍的不同配比，探討其在體內(nèi)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的最佳配伍比例。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，附子煎液灌服可制備PD肝陽上亢證模型[8]。附子辛溫大熱，久用耗傷精血，致肝腎陰虛、肝氣上逆于腦，故鼠出現(xiàn)煩躁易怒(易激惹)癥狀。MPTP是PD研究中常用的神經(jīng)毒素，可選擇性損傷DA能神經(jīng)元并誘導(dǎo)動(dòng)物出現(xiàn)震顫、行動(dòng)遲緩等行為[17]。本實(shí)驗(yàn)采用附子煎液灌服結(jié)合MPTP腹腔注射復(fù)制PD肝陽上亢證小鼠模型,小鼠激惹程度明顯增高，并且出現(xiàn)弓背、抽搐、肌肉強(qiáng)直等癥狀，說明人類肝陽上亢型PD的癥狀在本實(shí)驗(yàn)中得到了較好的模擬。

易激惹實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，牛膝白芍1∶4、1∶2、1∶1、2∶1組小鼠易激惹程度較模型組明顯降低，表明牛膝白芍兩藥以該比例配伍可使PD小鼠肝陽上亢癥狀得到較好的緩解。轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，牛膝白芍各配比組小鼠掉落潛伏期均較模型組明顯增加，表明牛膝白芍不同比例配伍均可使PD肝陽上亢證小鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力的損傷得到緩解。由于運(yùn)動(dòng)障礙是帕金森病的主要臨床表現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)采用轉(zhuǎn)棒行為學(xué)數(shù)據(jù)，應(yīng)用Compusyn軟件分析牛膝白芍不同比例配伍的聯(lián)合作用。結(jié)果表明，牛膝白芍各比例配伍均具有協(xié)同作用，1∶2為其協(xié)同增效作用的最佳比例。

TH是腦內(nèi)DA能神經(jīng)元的特異性標(biāo)志蛋白，其含量間接反映DA能神經(jīng)元的損傷情況[18]。免疫組化及Western blot法實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，牛膝白芍各配比組TH陽性神經(jīng)元及蛋白表達(dá)均較模型組明顯增加，說明其可以有效減輕神經(jīng)毒素對小鼠黑質(zhì)DA能神經(jīng)元造成的損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，且以1∶2比例配伍時(shí)這種神經(jīng)保護(hù)作用更加明顯，這與由行為學(xué)實(shí)驗(yàn)計(jì)算的聯(lián)合指數(shù)最佳配伍比例結(jié)果相一致。

綜上所述，牛膝與白芍兩藥聯(lián)用對PD肝陽上亢證小鼠DA能神經(jīng)元具有協(xié)同增效的神經(jīng)保護(hù)作用，1∶2為最佳配伍比例。筆者后續(xù)重點(diǎn)將圍繞兩藥配伍后協(xié)同增效作用的機(jī)制展開研究，為其指導(dǎo)臨床用藥、精簡復(fù)方提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。