快速凍融睪丸精子在無精子癥患者中應用的潛在影響

董 競 趙激浪 歐陽杰 張 偉 馬 猛 王田田 羅沛琦 陸詩佳 彭 惠 李 斌

無精子癥的患病率在男性人群中約為1%，在不育男性人群中約為10%～15%[1]。胞質內單精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)技術的引入開啟了無精子癥患者治療的新紀元[2]。睪丸精子提取(testicular sperm extraction，TESE)和ICSI的結合成為無精癥男性的有效治療手段[3,4]。雖然無精子癥患者可以在配偶取卵日進行睪丸穿刺手術后直接行新鮮睪丸精子ICSI，但是即使診斷性睪穿時有活動精子存在，再次重復進行的TESE也不能確保取卵日可以得到可用活動精子[5]。因此，睪丸精子的提前冷凍保存是非常有必要的。睪丸精子的提前凍存可以避免因取精失敗導致的ICSI周期取消和再次ICSI周期的重復睪丸活檢[6,7]。

無精子癥患者通過手術獲取的少量精子極其珍貴，常規(guī)精液冷凍保存程序中離心和清洗不僅會導致精子的丟失而且容易造成精子損傷。研究顯示，常規(guī)精液冷凍睪丸精子的復蘇回收率只有1%[8]。TESE獲得的精子頭部DNA不夠穩(wěn)定，細胞膜也未完全成熟，常規(guī)方式冷凍精子復蘇率低[9]。本研究采用快速微量精子冷凍方法，避免了常規(guī)冷凍程序中離心洗滌造成的精子丟失。已有研究表明對于稀少精子使用快速精子冷凍法冷凍保存非常有效[10,11]。

當前，關于凍融睪丸精子在臨床上的應用效果尚未達成一致。一些研究發(fā)現(xiàn)，凍融睪丸精子行ICSI后的受精率顯著低于新鮮睪丸精子，并且種植率和活產率也顯著降低[12,13]。Madureira等[14]研究也發(fā)現(xiàn),新鮮睪丸精子注射后的受精率和臨床妊娠率比凍融睪丸精子更高。但是，也有研究者報道睪丸精子冷凍保存不會損害活動精子的可用性，凍融睪丸精子與新鮮睪丸精子ICSI的結局比較，差異無統(tǒng)計學意義[15～17]。甚至還有研究報道了凍融睪丸精子行ICSI的妊娠率和著床率顯著優(yōu)于新鮮睪丸精子[18]。除此之外，女方因素也是影響無精子癥治療成功與否的重要因素，而現(xiàn)有的研究卻常常忽略了其潛在影響[17]。

基于上述可能存在的問題，本研究將通過傾向性評分匹配法消除兩組女方因素差異的條件下，對比分析快速凍融睪丸精子組和新鮮睪丸精子組的無精子癥患者的臨床治療結局，進一步確認快速冷凍保存的睪丸精子在輔助生殖治療中的應用是否會給患者的臨床妊娠帶來不利影響。

對象與方法

1.研究對象：回顧性分析了用傾向性評分匹配法收集的272例睪丸精子抽吸術(testicular sperm aspiration，TESA)取精后行ICSI的無精子癥患者：新鮮睪丸精子組(對照組)為136例取卵日用新鮮睪丸精子行ICSI的患者；快速凍融睪丸精子組(研究組)為136例取卵日使用凍融睪丸精子行ICSI的患者，其在進行診斷性睪穿時，使用快速微量精子冷凍法提前對睪丸精子進行了冷凍保存。患者納入標準：①首次體外受精(in vitro fertilization,IVF)周期患者；②女方年齡<43歲；③基礎卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)<10；④竇卵泡數(shù)≥5；⑤男方在TESA前均進行多次的精液常規(guī)檢查，并經精液離心沉淀證實為無精子癥，且經診斷性睪穿證實睪丸內存在成熟精子。遺傳分析顯示，所有患者的核型均正常。排除標準：①夫婦雙方先天性或遺傳性疾??；②女方有明顯宮腔畸形；③嚴重的內外科系統(tǒng)性疾病不適宜接受促排卵治療及不能耐受妊娠患者。對照組與研究組根據(jù)年齡、不孕年限和體重指數(shù)等基本資料進行1∶1傾向性評分匹配[19]。傾向性評分匹配是一種工具，由Rosenbaum和Rubin于1983年首次提出，用于調整非隨機研究中被測混雜因素的治療效果，可以有效降低混雜偏倚，并且在整個研究設計階段，得到類似隨機對照研究的效果[20,21]。本研究嚴格遵守《赫爾辛基宣言》并得到醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會的審核和批準，參與對象均簽署知情同意書。

2.超促排卵及取卵：本研究未對不孕癥患者的促排卵方案做限定，所用方案包括：孕激素方案、拮抗劑方案、長方案、短方案、微刺激和黃體期促排[22，23]。簡言之，卵泡期促排的患者從月經周期的第3～5天開始促排；黃體期促排的患者則在排卵后的第1～3天，對卵泡<8mm的患者開始促排。當有1個以上卵泡的直徑達到20mm或者3個以上的卵泡直徑達到18mm以上時扳機，扳機34～36h后在陰道超聲引導下行取卵術。

3.TESA：取男性患者截石位，會陰部常規(guī)消毒、鋪巾。用2%利多卡因注射液約2ml對術側陰囊行精索封閉。麻醉起效后，以陰囊皮膚無血管分布區(qū)作為穿刺點，在睪丸實質內鉗取適量睪丸組織，置于添加了10%血清的配子準備液(modified HTF medium，MHTF，美國Irvine Scientific公司)中，在解剖顯微鏡下用無菌BD注射器針頭將睪丸組織撕碎，倒置顯微鏡下觀察有無活動精子。如有活動精子則行微量精子快速冷凍，在取卵日解凍行ICSI；若采用新鮮睪丸精子行ICSI，如上方法操作，倒置顯微鏡下觀察到有活動精子后，用配子準備液MHTF洗滌離心，留取沉淀，置于室溫下備用。

4.睪丸精子快速冷凍與復蘇：本研究中采用Strawtop快速微量精子凍融法進行睪丸精子的冷凍保存。簡言之，即將等量的精子冷凍保護劑(丹麥Origio公司)逐滴加入含有精子的睪丸組織懸液中，每加1滴后都小心將溶液混勻，室溫放置10min。精子冷凍管(法國CBS公司)的一端剪出開放性的凹槽，將混合樣品移入該凹槽中(約50微升/支)。將精子冷凍管在1min內由液氮表面約50cm處緩慢降低至剛剛離開液氮表面，然后保持直至觀察到冷凍溶液凝固后裝入冷凍支架，投入液氮罐進行保存。取卵日，從液氮罐中取出相應的精子冷凍管，將盛有精子的一端浸入37℃預溫的油中待液滴溶解后，將其移入精子操作滴內，備后續(xù)ICSI操作。

5.授精、胚胎培養(yǎng)與觀察：所有患者行常規(guī)ICSI授精后約16～18h觀察受精情況，72h觀察胚胎卵裂情況。采用Cummins′標準對第3天胚胎進行評級[24]。其中Ⅰ級和Ⅱ級胚胎作為優(yōu)質胚胎進行冷凍保存；Ⅲ級和Ⅳ級胚胎繼續(xù)培養(yǎng)至囊胚期。囊胚采用Gardner和Schoolcraft評分系統(tǒng)進行評級。胚胎冷凍根據(jù)既有方法采用Cryotop進行[25]。

6.胚胎移植與妊娠結果判斷：筆者醫(yī)院常規(guī)采用凍融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer，F(xiàn)ET)，胚胎移植的內膜準備主要有自然周期、微刺激和激素替代3種方式，均按常規(guī)進行[22]。胚胎移植操作均在超聲監(jiān)測下進行，移植后14天行尿hCG檢測，陽性為生化妊娠，再經14天行陰道超聲檢查，見孕囊者為臨床妊娠。

結 果

1.患者基本資料：經過傾向性評分匹配后共入選272例患者，其中研究組和對照組各136例。匹配后兩組患者的年齡、不孕年限、體重指數(shù)、基礎FSH、基礎黃體生成素(luteinizing hormone，LH)和成熟卵數(shù)等基本資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表1)。

表1 患者的基本資料

2.睪丸精子快速凍融對胚胎早期發(fā)育的影響:兩組中患者的異常受精率、優(yōu)胚率、有效囊胚形成率和卵子利用率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但研究組中患者的受精率和正常受精率顯著低于對照組(P<0.05)，詳見表2。

表2 睪丸精子快速凍融對胚胎早期發(fā)育的影響 [%(n/N)]

3.睪丸精子快速凍融對患者妊娠結局的影響:研究組和對照組的患者在臨床妊娠率、宮外孕率、流產率、種植率、活產率、早產率、累積活產率、孕周等方面比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。研究組中新生兒的出生體重和出生缺陷率與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，詳見表3。

表3 睪丸精子快速凍融對患者妊娠結局的影響

討 論

隨著輔助生殖技術的發(fā)展，傳統(tǒng)意義的無精子癥患者可以通過經睪丸或附睪穿刺取精，再聯(lián)合ICSI技術實現(xiàn)正常生育。然而30%～50%的非梗阻性無精子癥患者的睪丸組織中沒有精子[26]。目前也沒有可靠的術前指標可以有效預測睪丸穿刺手術能否獲得可用精子[27]。由于生精小管中的精子分布不均，即使是先前的睪丸活檢也沒有統(tǒng)計學意義的預測價值[28]。冷凍保存睪丸精子可以將取卵手術和睪丸活檢手術分割開來，可有效避免因無可用精子導致周期取消。但是，無精子癥患者通過手術獲取的精子通常很少，常規(guī)精液冷凍保存程序中離心和清洗會導致精子的回收率和復蘇率低[8，9]。精子快速冷凍法由于快速越過冰晶形成的溫度，且省去了離心的步驟，可最大限度保存精子。但是，目前關于使用凍融睪丸精子行ICSI后的治療結果尚存在一些問題，有研究發(fā)現(xiàn)，使用凍融或新鮮睪丸精子可以獲得相似的受精率、種植率和臨床妊娠率[15]。另有研究發(fā)現(xiàn)，使用凍融精子會損害睪丸精子的受精能力，并引起種植率和活產率降低[12]。

基于上述的這些爭議，我們有必要進一步確認快速冷凍保存的睪丸精子在輔助生殖治療中的應用是否會給患者的臨床妊娠帶來不利影響。在本研究中，通過對快速凍融睪丸精子組與新鮮睪丸精子組的治療結果進行比較，筆者發(fā)現(xiàn)快速凍融睪丸精子組中患者的受精率和正常受精率顯著性低于新鮮睪丸精子組(分別為90.71% vs 93.10%，87.87% vs 90.49%，P<0.05)。

De Croo等[12]和Madureira等[14]采用麥管液氮蒸汽熏蒸法冷凍睪丸精子的研究也發(fā)現(xiàn),凍融睪丸精子獲得的受精率低于新鮮睪丸精子獲得的受精率。筆者推測潛在的原因可能是：(1)由于睪丸精子不成熟，凍融會導致部分精子活動力和受精能力下降[13]。(2)冷凍、解凍和冷凍保護劑暴露期間精子的結構和功能會發(fā)生顯著變化，精子的凍結可引起精子頂內膜和質膜的膨脹和破裂。(3)在冷卻和解凍過程中，氧自由基的產生均增加，導致繼發(fā)于質膜脂質過氧化的自由基損傷。除此之外，筆者的研究結果顯示，快速凍融睪丸精子組的患者可以獲得與新鮮睪丸精子組患者相似的優(yōu)胚率(50.68% vs 53.98%)、卵子利用率(35.59% vs 38.35%)、臨床妊娠率(60.57% vs 58.51%)及活產率(54.29% vs 49.47%)比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，這與既往研究結果相一致[15]。本研究結果提示，雖然快速凍融睪丸精子可能導致了精子受精能力的下降，但并沒有進一步影響受精后合子的早期發(fā)育。

為了進一步確認快速凍融睪丸精子的應用是否會給患者的子代帶來潛在的影響，筆者詳細分析比較了兩組患者的多種臨床妊娠指標。研究結果顯示，患者行FET后的宮外孕率、流產率和早產率等指標比較，差異均無統(tǒng)計學意義(1.89% vs 0.91%，8.49% vs 14.55%，18.95% vs 15.05%，P>0.05)，提示睪丸精子的快速凍融不會增加不良的產科結局。此外，進一步比較兩組的新生兒情況,結果顯示，兩組中新生兒的出生孕周和出生體重均沒有顯著區(qū)別(38.08±2.10周 vs 37.91±2.34周，2999.88±611.00g vs 2980.00±605.19g，P>0.05)。兩組中新生兒的先天缺陷發(fā)生率比較，差異也無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，其中快速凍融睪丸精子組中出現(xiàn)了5例先天缺陷的新生兒，新鮮睪丸精子組中未發(fā)現(xiàn)有先天缺陷的新生兒。已有報道顯示，正常受孕情況下發(fā)現(xiàn)的先天畸形率，加拿大約為4.2%、南澳大利亞州約為5.8%。與此相比，研究組中新生兒的出生缺陷率(4.10%)處在正常水平，并沒有增加。因此，本研究結果提示，快速凍融睪丸精子行ICSI是一種簡便且安全的無精子癥男性不育患者的臨床治療方案，通過手術取精獲得的精子都應考慮提前冷凍保存，即使對于只取出很少精子的患者也是建議的。

臨床治療無精子癥患者時，TESA-ICSI的治療結局可能會受到男女雙方多種因素的影響，如男方因素(年齡、精子質量等)和女方因素(如年齡、卵巢儲備等)?，F(xiàn)有的研究常常忽略了女方因素的影響[17]。針對此問題，本研究采用了傾向性評分匹配法控制了女性人群特征數(shù)據(jù)的影響，包括女方年齡、不孕年限、體重指數(shù)、基礎激素水平、獲卵數(shù)等。當然，本研究也存在不足：本研究是一個單中心的回顧性研究，雖然筆者用傾向性評分匹配來盡量消除組間可能存在的差異，但回顧性偏倚仍不能完全避免。活產和子代安全是評估不同治療方法的金標準，但它涵蓋兩個周期(取卵和移植)，包含了很多混淆因素。今后筆者將繼續(xù)積累相關數(shù)據(jù)并在研究設計上優(yōu)化，進一步在更單純的背景和更多的樣本量下進行分析研究，給臨床診療提供更精準的信息。條件成熟時，也將考慮開展RCT的研究，以期得到更高質量的研究結果。

綜上所述，雖然快速凍融睪丸精子與新鮮睪丸精子行ICSI的受精率有顯著性差異，但是受精后合子的早期發(fā)育，移植后的臨床妊娠率、活產率以及子代出生孕周、體重和先天缺陷率比較，差異均無統(tǒng)計學意義?？焖賰鋈诓G丸精子行ICSI可以獲得和新鮮睪丸精子相似的臨床結局，睪丸精子的微量快速冷凍是一種簡便且安全的無精子癥男性不育患者的臨床治療方案，可避免患者的反復睪丸活檢，有利于患者臨床治療的安排。