自噬和鐵死亡在動脈粥樣硬化中的研究進(jìn)展

彭 琪 關(guān)秀茹

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是一種隨年齡增長呈漸增性的病變,由AS引起的心腦血管疾病依然是全球人類最主要的死亡原因,嚴(yán)重威脅著人們的健康和生命[1]。迄今為止,國內(nèi)外進(jìn)行大量關(guān)于細(xì)胞死亡途徑在AS中作用的研究，其中鐵死亡和自噬是近年來研究的熱點。鐵死亡一開始被認(rèn)為是一種區(qū)別于其他程序性死亡的鐵依賴性死亡，且有研究表明，鐵死亡在AS中發(fā)揮了重要的作用。Bai等[2]在載脂蛋白E敲除(apolipoprotein E-/-,APOE-/-)的小鼠中，對高脂飲食(high-fat diet，HFD)喂養(yǎng)的小鼠施用鐵死亡抑制劑ferrostatin-1，結(jié)果表明，ferrostatin-1可以減輕HFD喂養(yǎng)的APOE-/-小鼠的AS病變。中醫(yī)學(xué)也有研究發(fā)現(xiàn)，二陳湯合桃紅四物湯能明顯改善APOE-/-小鼠的AS進(jìn)展情況，其機(jī)制可能與其調(diào)控抗氧化因子介導(dǎo)的抗氧化損傷及抑制細(xì)胞鐵死亡有關(guān)[3]。此外，鐵死亡激活劑Erastin可增加人血管內(nèi)皮細(xì)胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生繼而發(fā)生鐵死亡，血管內(nèi)皮細(xì)胞的死亡在推動AS進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用[4]。上述實驗結(jié)果都有力地證實了鐵死亡對AS進(jìn)展的影響是至關(guān)重要的。

自噬是一種有利于細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)周轉(zhuǎn)的亞細(xì)胞過程，其對于抵抗應(yīng)激環(huán)境、提供細(xì)胞代謝需要具有重要作用。而其失調(diào)則涉及多種疾病，如自噬缺陷或異常與AS斑塊的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。有研究表明，敲除自噬相關(guān)基因5(autophagy related gene 5,ATG5)和自噬相關(guān)基因7(ATG7)可降低細(xì)胞內(nèi)鐵水平和脂質(zhì)過氧化從而抑制鐵死亡激活劑Erastin誘導(dǎo)的鐵死亡，所以在特定的環(huán)境下鐵死亡被認(rèn)為是一種自噬依賴性死亡[5]。本文將通過介紹自噬和鐵死亡的機(jī)制引出自噬依賴性鐵死亡的機(jī)制，從而進(jìn)一步說明自噬和鐵死亡在AS中的作用。

一、自噬的機(jī)制

自噬是細(xì)胞內(nèi)一種正常的代謝過程，自噬通過降解細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器及相關(guān)蛋白質(zhì)，將分解產(chǎn)生的產(chǎn)物釋放，以便這些物質(zhì)的再次利用，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。尤其是在應(yīng)激的環(huán)境下，自噬作用可以幫助細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境的變化，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，從而保護(hù)細(xì)胞免受損害和死亡。細(xì)胞自噬的過程起始于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體囊泡將細(xì)胞質(zhì)中的線粒體、內(nèi)吞體、過氧化物酶體等細(xì)胞器包被，并最終形成初始自體吞噬泡，胞內(nèi)體與初始自體吞噬泡融合后形成中間自體吞噬泡，接著溶酶體再與初始自體吞噬泡融合，最終形成降解自體吞噬泡，初始自體吞噬泡中的內(nèi)容物和內(nèi)膜被溶酶體內(nèi)各種酶降解，最終完成細(xì)胞自噬[6]。

細(xì)胞內(nèi)的自噬可以區(qū)分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬。巨自噬是由雙層膜結(jié)構(gòu)包繞受損細(xì)胞器和蛋白質(zhì)而構(gòu)成的自噬體，隨后其與溶酶體的結(jié)合是一個“自食”的過程。微自噬是一種比較復(fù)雜的通過液泡與溶酶體對受損細(xì)胞器進(jìn)行選擇性降解的過程。分子伴侶介導(dǎo)的自噬是一種具有強(qiáng)特異性的選擇性自噬，并且被選擇的可溶性蛋白需逐個進(jìn)入溶酶體，從而在溶酶體內(nèi)被消化掉。最初，自噬被認(rèn)為是細(xì)胞面對應(yīng)激時的一種良性反應(yīng)，自噬的缺陷可以促進(jìn)腫瘤、代謝性疾病等多種疾病的進(jìn)展。但是最近有越來越多的研究表明，不僅自噬的缺陷會導(dǎo)致疾病的進(jìn)展，過度自噬以及一些選擇性自噬也會通過不同的途徑導(dǎo)致疾病的進(jìn)一步發(fā)展。

二、鐵死亡的機(jī)制

1.鐵蓄積：鐵元素是人體物質(zhì)合成和代謝不可或缺的，機(jī)體內(nèi)的鐵以3價鐵(Fe3+)和2價鐵(Fe2+)兩種氧化態(tài)存在，血清中Fe3+與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合后被轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(transferrin receptor/transferrin receptor 1，TFRC/TFR1)識別從而轉(zhuǎn)運到細(xì)胞內(nèi)，F(xiàn)e3+在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被金屬還原酶(six-transmembrane epithelial antigen of the prostate3,STEAP3)還原為Fe2+，然后由溶質(zhì)載體家族11成員2(solute carrier family 11member 2,SLC11A2)釋放到細(xì)胞質(zhì)的不穩(wěn)定鐵池內(nèi)，多余的Fe2+與鐵蛋白輕鏈(ferritin light chain,FTL)和鐵蛋白重鏈1(ferritin heavy chain1,FTH1)結(jié)合。這些鐵相關(guān)蛋白的代謝和功能異?？蓪?dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鐵超負(fù)荷，過量的游離鐵會與過氧化氫產(chǎn)生芬頓反應(yīng)生成羥自由基和ROS，從而誘導(dǎo)鐵死亡[7]。鐵穩(wěn)態(tài)的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子鐵結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白2(iron responsive element binding protein 2,IREB2)可顯著增加儲鐵蛋白FTL和FTH1的表達(dá)，從而抑制Erastin誘發(fā)的鐵死亡。使用不同類型的鐵死亡激活劑時,細(xì)胞內(nèi)鐵水平會增高，用細(xì)胞內(nèi)鐵螯合劑去鐵胺則可阻止鐵死亡的發(fā)生[8]。上述研究進(jìn)一步證明了鐵蓄積是引起細(xì)胞鐵死亡的主要原因。

2.脂質(zhì)過氧化：胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運體(cysteine/glutamate antiporter system，System Xc-)是細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)運體，它可使被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的胱氨酸還原為半胱氨酸，然后半胱氨酸可以參與谷胱甘肽(glutathione,GSH)的產(chǎn)生，GSH為機(jī)體內(nèi)重要的還原性物質(zhì)，可以參與體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物等氧化物的還原反應(yīng)。Sun等[9]研究發(fā)現(xiàn)，核因子NF-E2相關(guān)因子(nuclear-factor erythroid 2-related factor 2，NRF2)可以通過促進(jìn)System Xc-的表達(dá)，從而在阻斷氧化損傷介導(dǎo)的鐵死亡中起重要作用。此外，溶質(zhì)載體家族7成員11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)參與System Xc-的組成,自噬相關(guān)基因BECN1通過結(jié)合SLC7A11可以降低System Xc-的合成，從而降低了System Xc-的抗氧化特性促進(jìn)了鐵死亡的發(fā)生[10]。

谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)是介導(dǎo)脂質(zhì)過氧化物還原反應(yīng)的關(guān)鍵酶，其在鐵死亡過程中起關(guān)鍵作用。谷胱甘肽過氧化物酶4抑制劑RSL3(ras-selective-lethal compound 3)通過與GPX4的共價結(jié)合抑制GPX4的活性，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物的積累及鐵死亡。此外，轉(zhuǎn)錄激活因子4(activating transcription factor 4,ATF4)激活熱休克蛋白5(heat shock protein 5,HSP5)，HSP5與GPX4的結(jié)合阻止了GPX4的消除從而抑制了鐵死亡[11]。由此可見，脂質(zhì)過氧化作用是引起鐵死亡的重要機(jī)制。

三、自噬與鐵死亡的關(guān)聯(lián)性

自噬是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵因子，適度的自噬可以增加細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下的存活率，但高水平的自噬尤其是選擇性自噬以及溶酶體活性受損會促進(jìn)鐵死亡的發(fā)生。自噬驅(qū)動鐵死亡的機(jī)制詳見圖1。

圖1 自噬驅(qū)動鐵死亡的機(jī)制

1.NCOA4相關(guān)的自噬與鐵死亡：鐵自噬(ferritinophagy)屬于一種選擇性自噬，它是由核受體共激活因子4(nuclear receptorcoactivator 4,NCOA4)所介導(dǎo)的[12]。研究表明，NCOA4作為選擇性貨物受體將鐵蛋白遞送到自噬溶酶體，使鐵蛋白降解釋放出游離鐵，從而促進(jìn)鐵死亡[13]。NCOA4的豐度通過自噬和泛素蛋白酶體系雙重控制,過量鐵促進(jìn)泛素依賴性NCOA4轉(zhuǎn)換，并涉及NCOA4與E3泛素連接酶2(the herc domain and rcc-1 like domain2，HERC2)之間的鐵依賴性相互作用[14]。研究表明，鐵自噬介導(dǎo)的鐵死亡在許多疾病中都發(fā)揮了重要的作用[15]。

2.RAB7A相關(guān)的自噬與鐵死亡：雖然鐵死亡是以鐵蓄積和脂質(zhì)過氧化為主的細(xì)胞死亡形式，但Bai等[16]提出脂滴在細(xì)胞死亡過程中起到抗氧化作用，細(xì)胞內(nèi)脂滴的自噬降解，促進(jìn)肝細(xì)胞中RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡。而腫瘤蛋白D52(tumor protein D52，TPD52)可上調(diào)脂滴的形成，從而抑制鐵死亡激活劑RSL3的作用。RAS相關(guān)蛋白7a(ras associated protein 7a，RAB7A)是RAS癌基因家族的成員,可促進(jìn)脂滴在溶酶體募集，使脂滴發(fā)生自噬降解。抑制ATG5和RAB7A依賴性脂質(zhì)降解可防止RSL3誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致的鐵死亡。

3.SQSTM1相關(guān)的自噬與鐵死亡：鐘表性自噬(clockophagy)是 Liu等[17]研究發(fā)現(xiàn)的一種選擇性自噬類型，即有生物鐘調(diào)節(jié)劑芳香烴受體核轉(zhuǎn)位因子樣蛋白(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like,ARNTL)參與的降解過程，在ARNTL降解過程中選擇性結(jié)合分子1(sequestosome-1,SQSTM1/P62)為運載ARNTL進(jìn)行自噬降解的載體受體，ARNTL降解后可阻礙缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)介導(dǎo)的細(xì)胞對脂肪酸以及脂質(zhì)的吸收，這些脂類的吸收可以導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化引發(fā)的鐵死亡。部分鐵死亡促進(jìn)劑可激活運載ARNTL降解的貨物受體，導(dǎo)致ARNTL含量減低從而引發(fā)鐵死亡。此外，Yang等[18]在細(xì)胞和動物模型中的研究表明，ARNTL通過抑制egl-9家族缺氧誘導(dǎo)因子2(egl nine homolog 2,EGLN2/PHD1)的轉(zhuǎn)錄來轉(zhuǎn)錄激活因子HIF-1α從而抑制鐵死亡的發(fā)生。

4.BECN1相關(guān)的自噬與鐵死亡：BECN1與Ⅲ類磷脂酰肌醇3-激酶的結(jié)合是組成BECN1相關(guān)性自噬的基礎(chǔ)。BECN1是調(diào)節(jié)自噬的關(guān)鍵因子，腺苷酸活化蛋白激酶(amp-activated protein kinase，AMPK)觸發(fā)的BECN1的磷酸化不止可以促進(jìn)自噬，還可以與SLC7A11結(jié)合，導(dǎo)致System Xc-合成受阻，抑制System Xc-活性從而導(dǎo)致鐵死亡[19]。這表明BECN1相關(guān)性自噬在調(diào)節(jié)鐵死亡中發(fā)揮了一定作用。

5.自噬不足——啟動NRF2介導(dǎo)的鐵死亡：NRF2在以往的研究中一直被視為抗氧化的主要調(diào)節(jié)劑，NRF2可通過促進(jìn)鐵的儲存，減少鐵的吸收和ROS的產(chǎn)生來抑制鐵死亡[20]。Zang等[21]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病會導(dǎo)致心肌細(xì)胞自噬不足，從而關(guān)閉NRF2介導(dǎo)的抗氧化防御作用，同時啟動NRF2操縱的鐵沉積和脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致鐵死亡的發(fā)生。并且鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin抑制了自噬通量，表明自噬抑制作用可能在NRF2介導(dǎo)的鐵死亡中發(fā)揮了重要作用。

四、自噬和鐵死亡在AS中的作用

1.自噬對AS的雙重調(diào)控：AS是由血管內(nèi)皮下脂質(zhì)堆積及泡沫細(xì)胞形成而造成的慢性炎癥性疾病。代謝應(yīng)激、缺氧、炎性細(xì)胞因子和氧化脂質(zhì)等可促進(jìn)動脈粥樣硬化斑塊(atherosclerotic plaque,AP)中細(xì)胞的死亡以及死亡細(xì)胞清除的缺陷。早在幾十年前人們通過電鏡分析及自噬標(biāo)志物的表達(dá)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)自噬可發(fā)生于AP的巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中。

最初人們對AS中自噬的認(rèn)識局限于其可阻礙疾病進(jìn)程的有利一面。有研究表明，在AP形成早期，自噬由炎癥、氧化應(yīng)激等多種因素作用被激活，其作為一種保護(hù)機(jī)制，通過降低AS中泡沫細(xì)胞內(nèi)脂滴的積累和ROS水平、促進(jìn)損傷后細(xì)胞成分的降解維持細(xì)胞的正常存活、抑制炎性反應(yīng)和促進(jìn)膽固醇流出而起到抗AS的作用。

近年來大量研究證實，自噬在AS進(jìn)程中對AS的調(diào)控具有雙向性作用[1]?；A(chǔ)水平的自噬保護(hù)AP的細(xì)胞，使其免受各種應(yīng)激環(huán)境的影響。而AS晚期時自噬失調(diào)以及過度水平的自噬可以促進(jìn)AP的形成及破裂。在AS晚期，嚴(yán)重應(yīng)激時可以引起自噬體的形成缺陷或自噬體與溶酶體融合降解過程中的缺陷，自噬缺陷會破壞脂質(zhì)代謝平衡, 促使脂質(zhì)在血管壁沉積, 顯著增加AP形成。然而，過度自噬可以導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子的釋放和嚴(yán)重的氧化應(yīng)激以及自噬蠟樣體的形成，自噬蠟樣體是由氧化脂質(zhì)和蛋白質(zhì)結(jié)合的復(fù)合體，其無法被溶酶體消化，還會使自噬體與溶酶體的結(jié)合受限，使平滑肌細(xì)胞膠原纖維合成減少導(dǎo)致纖維帽變薄，使內(nèi)皮細(xì)胞死亡促進(jìn)血栓形成以及使巨噬細(xì)胞死亡增加AP的負(fù)荷及不穩(wěn)定性。尤其是過度的選擇性自噬還可以介導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，加重AS的進(jìn)展。

2.鐵死亡促進(jìn)AS的進(jìn)展：鐵死亡是鐵依賴性脂質(zhì)過氧化引起的非凋亡性程序性細(xì)胞死亡，其可以導(dǎo)致非酒精性脂肪性肝炎、心肌病、腎缺血-再灌注和神經(jīng)退行性疾病等復(fù)雜疾病的發(fā)展。最近鐵死亡被證實是AS中細(xì)胞死亡形式的其中一種，其特征在于鐵依賴性脂質(zhì)過氧化物的積累達(dá)到細(xì)胞致死水平，它可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等AS相關(guān)細(xì)胞的泡沫化和死亡。血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和死亡與多種血管疾病如AS等有關(guān)。有研究表明，鐵超載可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞遭受 ROS和脂質(zhì)過氧化的損傷，Erastin導(dǎo)致的GPX4下調(diào)和ACSL4上調(diào)使AS中內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，加重了AS的發(fā)展[4]。此外，鐵過載還可通過促進(jìn)AS中泡沫細(xì)胞形成和炎性反應(yīng)，損傷平滑肌細(xì)胞等作用加重AS斑塊的形成和不穩(wěn)定性[22]。有研究發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,OX-LDL)處理的小鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(mouse aortic endothelial cells，MAECS)中，ferrostatin-1抑制了鐵過載狀態(tài)和脂質(zhì)的過氧化，并且增強(qiáng)了SLC7A11和GPX4的活性，提高了細(xì)胞的活力并且減少了細(xì)胞的死亡[2]。然而，鐵螯合劑去鐵蛋白原(desferricoprogen,DFC)抑制了斑塊脂質(zhì)的氧化減少了致AS飲食的APOE-/-小鼠中的斑塊形成[23]。上述研究都說明了鐵死亡在AS中的重要作用，所以通過減弱AS中的鐵蓄積和脂質(zhì)過氧化作用，從而抑制鐵死亡來減輕AS有望成為治療AS的新靶點。

3.自噬和鐵死亡在AS中的關(guān)聯(lián)性：p62是一種多功能的支架蛋白，其在選擇性自噬中把泛素化的蛋白攜帶到自噬小體上進(jìn)行降解，同時自身也被降解。來自AS小鼠的主動脈和來自人類動脈內(nèi)膜切除術(shù)樣品的斑塊顯示，與斑塊巨噬細(xì)胞共定位的p62和多泛素化蛋白的豐度增加，表明富含p62的蛋白聚集體是AS的特征[24]。研究表明，巨噬細(xì)胞中加入大量的OX-LDL可以阻斷自噬通量，導(dǎo)致p62聚集， 然后p62 通過依賴于NF-κB的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)參與基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)基因的表達(dá)，從而具有AP的新斑塊易損性特征。然而，這一過程中p62的豐度的增加也極有可能導(dǎo)致p62介導(dǎo)的鐘表性自噬的增強(qiáng)，這種選擇性自噬會使ARNTL降解增加，促進(jìn)脂質(zhì)過氧化和隨后的鐵死亡，從而導(dǎo)致斑塊穩(wěn)定向下降，加快AS的進(jìn)展。

自噬調(diào)節(jié)基因BECN1是可以通過泛素化修飾對自噬進(jìn)行調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子。有證據(jù)表明，BECN1在AS的內(nèi)皮細(xì)胞中是發(fā)揮保護(hù)作用的，敲低BECN1可以抑制OX-LDL處理的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的自噬，使細(xì)胞的生存率減低，加重AP的不穩(wěn)定性[25]。BECN1被敲低還可以增強(qiáng)System Xc-的合成和抗氧化作用，從而抑制鐵死亡的發(fā)生，所以BECN1對AS的保護(hù)作用也體現(xiàn)在其對細(xì)胞自噬和鐵死亡的調(diào)控作用上。

NRF2在心血管系統(tǒng)中普遍表達(dá)，NRF2是通過抑制氧化應(yīng)激來維持心血管穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。但在AS晚期，血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生自噬缺陷，自噬缺陷能夠引發(fā)NRF2的非經(jīng)典激活導(dǎo)致NRF2的持續(xù)活化，NRF2的異常激活會加重細(xì)胞炎性反應(yīng)、促進(jìn)細(xì)胞死亡，具有致病性[26]。綜上所述，自噬依賴性鐵死亡相關(guān)因子在AS中發(fā)揮了重要的作用，有望在疾病中將自噬和鐵死亡聯(lián)系起來成為AS治療的新靶點。

五、展 望

迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多細(xì)胞死亡途徑，它們可以相互配合以維持機(jī)體動態(tài)平衡。闡明它們的分子機(jī)制和每種途徑之間的串?dāng)_不僅有利于對細(xì)胞死亡途徑的全面了解，還為相關(guān)疾病治療開辟了新的方法。本文重點介紹了自噬和鐵死亡的機(jī)制以及其與AS之間的聯(lián)系，證實自噬與鐵死亡對AP穩(wěn)定性的維持有重要的影響。筆者研究發(fā)現(xiàn)自噬和鐵死亡之間存在串?dāng)_作用，鐵死亡實際上是一種自噬依賴性死亡方式，并且列舉了其在AS中具有潛力的研究方向。然而，對自噬依賴性鐵死亡的分子機(jī)制和病理基礎(chǔ)的認(rèn)識仍然不夠系統(tǒng)和全面，所以自噬介導(dǎo)鐵死亡的具體機(jī)制還需進(jìn)一步探究。此外，如何定義何種閾值程度的自噬會導(dǎo)致鐵死亡是一個值得思考的難題。雖然有研究表明自噬與鐵死亡以及聯(lián)系二者的部分細(xì)胞因子在AS中都發(fā)揮了重要作用，但其確切機(jī)制還有待進(jìn)一步探究。