菊芋葉多酚的超聲輔助提取及抗氧化活性研究

馬 劍，張宏志，王 愈，梁明祥，邊道剛，馬艷弘,*

（1. 江蘇省農業(yè)科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014；2. 山西農業(yè)大學食品科學與工程學院，山西 晉中 030801；3. 南京農業(yè)大學資源與環(huán)境科學學院，江蘇 南京 210095；4. 徐州雙信食品有限公司，江蘇 徐州 221744）

菊芋（Helianthus tuberosusL.）俗稱洋姜、鬼子姜、五星草，為菊科（Compositae）向日葵屬（HelianthusL.）多年生草本植物，原產于北美洲，17 世紀傳入歐洲，后傳入中國，之后在我國大面積種植[1]。菊芋全身是寶，其塊莖營養(yǎng)豐富，富含菊糖、酚酸、倍半萜內酯類化合物等功能成分，具有降血糖、改善腸道微生物環(huán)境、調節(jié)免疫系統(tǒng)等功能[2-3]，在食品醫(yī)藥等領域被廣泛應用；其葉片富含黃酮、多酚、菊糖、綠原酸等生物活性物質[4-5]，具有抗氧化、殺蟲抑菌、抑制腫瘤細胞增殖等功效[6-10]。

我國菊芋資源豐富，有關菊芋的研究大多圍繞其塊莖進行，如制備乳酸菌飲料[11]、菊粉[12]、菊芋濃縮汁[13]等產品，對于菊芋葉的研究卻相對較少，造成了菊芋葉資源的極度浪費。袁曉艷等[4]報道了菊芋葉中含有豐富的酚類、黃酮、酚酸類化合物，具有極高的開發(fā)利用價值。本文以菊芋葉為原料，采用超聲輔助的方法提取菊芋葉中的多酚[14-15]，并通過響應面法設計優(yōu)化菊芋葉多酚的提取工藝[16-17]，同時對提取物的體外抗氧化活性進行研究，為菊芋的全價利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

菊芋葉：由江蘇碧青園海洋生物科技有限公司提供。

沒食子酸、無水乙醇、碳酸鈉、氫氧化鈉（均為分析純試劑）：購自南京壽德試驗器材有限公司；羥自由基試劑盒、抗超氧陰離子自由基試劑盒、2×10-4mol/L DPPH 溶液：均購自南京建成生物技術有限公司。

1.1.2 儀器與設備

D-B5 型紫外可見分光光度計：上海奧析科學儀器有限公司；TGL-16B 型臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；RE6000 型旋轉蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；ZD-F12 型真空冷凍干燥機：南京載智自動化設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菊芋葉多酚提取工藝流程

新鮮菊芋葉→烘干（60 ℃，24 h）→粉碎、過篩（80目）→菊芋葉干粉（含水量＜5%）→超聲輔助提?。?0%乙醇溶液）→離心（4 000 r/min，20 min）→提取液真空濃縮→AB-8 大孔樹脂純化→真空冷凍干燥→菊芋葉多酚凍干粉

1.2.2 菊芋葉多酚提取的單因素試驗設計

1.2.2.1 料液比對菊芋葉多酚得率的影響

以菊芋葉凍干粉為原料，分別以料液比為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL），使用50%乙醇溶液于500 W 超聲功率條件下提取50 min，考察料液比對菊芋葉多酚得率的影響。

1.2.2.2 乙醇濃度對菊芋葉多酚得率的影響

以菊芋葉凍干粉為原料，乙醇濃度分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%，以料液比1∶20（g/mL）于500 W 超聲功率條件下提取50 min，考察乙醇濃度對菊芋葉多酚得率的影響。

1.2.2.3 超聲時間對菊芋葉多酚得率的影響

以菊芋葉凍干粉為原料，使用50%乙醇溶液為提取劑，按照料液比1∶20（g/mL），以500 W 超聲功率分別提取10、20、30、40、50、60 min，考察超聲時間對菊芋葉多酚得率的影響。

1.2.2.4 超聲功率對菊芋葉多酚得率的影響

以菊芋葉凍干粉為原料，使用50%乙醇溶液為提取劑，按照料液比1∶20（g/mL），在超聲功率分別為200、300、400、500、600、700 W 條件下提取50 min，考察超聲功率對菊芋葉多酚得率的影響。

1.2.3 響應面優(yōu)化試驗設計

根據Box-Behnken 試驗設計原理，在單因素試驗的基礎上采用四因素三水平的響應面分析法進一步優(yōu)化多酚提取條件。以料液比、乙醇濃度、超聲時間、超聲功率為自變量，依次用X1、X2、X3、X4表示，并以-1、0、1 分別代表各自的低、中、高水平，以多酚得率Y（mg/g）為響應值，確定這4 個自變量對菊芋葉多酚得率的影響，同時得到菊芋葉多酚提取的最佳工藝條件。試驗因素及水平編碼見表1。

表1 因素及水平編碼表Table 1 Factors and levels for Box-Behnken design

1.2.4 菊芋葉多酚得率

配制濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL的沒食子酸標準溶液，分別吸取1 mL 上述標準溶液，加入5 mL 蒸餾水，1 mL 福林酚顯色劑，3 mL 質量分數7.5%的碳酸鈉溶液，混勻，在45 ℃水浴鍋中水浴90 min，最后在波長760 nm 處測定吸光度。以沒食子酸濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，求得回歸方程為：y=0.005 6x-0.035 3，R2=0.998 2。根據標準曲線計算多酚含量，再按照如下公式計算多酚得率。

式中：C 為比色杯中多酚質量濃度，mg/mL；V 為多酚提取液總體積，mL；m 為稱取的菊芋葉質量，g。

1.2.5 菊芋葉多酚抗氧化活性檢測

1.2.5.1 羥自由基（·OH）清除能力

根據參考姬妍茹等[18]和Shen 等[19]的方法，配制濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mg/mL 的樣品溶液，根據羥自由基測定方法，以無水乙醇為空白對照，將分光光度計調零，同時以相同濃度的VC 溶液作陽性對照，分別測定其吸光度?！H 清除率的計算公式如下：

式中：Ai為1 mL 硫酸亞鐵溶液+ 1 mL 水楊酸溶液+1 mL 樣品液+1 mL 0.5% H2O2溶液在526 nm 處的吸光度；Aj為1 mL 硫酸亞鐵溶液+ 1 mL 水楊酸溶液+1 mL 樣品液+1 mL 蒸餾水在526 nm 處的吸光度；A0為1 mL 硫酸亞鐵溶液+ 1 mL 水楊酸溶液+1 mL 蒸餾水+1 mL 0.5% H2O2溶液在526 nm 處的吸光度。

1.2.5.2 超氧陰離子自由基（O2·）清除能力

根據參考Ding 等[20]的方法，配制濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mg/mL 的樣品溶液，按照試劑盒說明書操作，以無水乙醇為空白對照，將分光光度計調零，同時以相同濃度的VC 溶液作陽性對照，分別測定其吸光度。超氧陰離子自由基清除能力計算公式為：

式中：A0為對照組在520 nm 處的吸光度；Ai為樣品在520 nm 處的吸光度；Aj為標準品在520 nm 處的吸光度；C 為標準品濃度，mg/mL。

1.2.5.3 DPPH 自由基（DPPH·）清除能力

根據參考Zhu 等[21]的方法，配制濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mg/mL 的樣品溶液，各取2 mL 于具塞試管中，再加入1 mL 2×10-4moL/L 的DPPH 溶液，搖勻后避光放置30 min。以無水乙醇為空白對照，將分光光度計調零，同時以相同濃度的VC溶液作陽性對照，分別測定550 nm 處的吸光度。

式中：Ai為2 mL 樣品溶液+ 2 mL DPPH 溶液在550 nm 處的吸光度；Aj為2 mL 樣品溶液+ 2 mL 無水乙醇在550 nm 處的吸光度；A0為2 mL DPPH 溶液+2 mL 無水乙醇溶液在550 nm 處的吸光度。

1.2.6 數據處理

每組試驗進行3 次重復，試驗數據采用Excel 2010 軟件作圖，Design-Expert 8.0.6 軟件進行響應面試驗設計，SPSS 2007 軟件計算菊芋葉多酚IC50值。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 料液比對菊芋葉多酚提取效果的影響

料液比是決定菊芋葉多酚得率的重要因素之一。由圖1 可知，隨著提取劑用量的增大，多酚得率也相應提高，當料液比達到1∶20（g/mL）之后多酚得率變化趨于平緩。由于提取劑用量較低時，菊芋葉中的多酚不能充分溶解；隨著提取劑用量的增大，溶劑對多酚的溶解逐漸趨于飽和，當料液比達到1∶20（g/mL）時，多酚得率接近最大值，為35.07 mg/g。與實際生產相聯系，選擇最佳料液比為1∶20（g/mL），既有利于菊芋葉多酚的提取，又有利于降低生產成本。

圖1 料液比對菊芋葉多酚得率的影響Fig.1 Effect of material-liquid ratio on polyphenol yield of jerusalem artichoke leaves

2.1.2 乙醇濃度對菊芋葉多酚提取效果的影響

由圖2 可知，當乙醇濃度在30%～50%時，多酚得率隨著乙醇濃度的增加而升高；當乙醇濃度為50%時，菊芋葉多酚得率達到最高，為20.85 mg/g；之后隨著乙醇濃度的增加，菊芋葉多酚得率逐漸降低，這是由于高濃度乙醇溶液會使蛋白質變性，影響多酚類物質的溶出，菊芋葉多酚得率降低。因此確定菊芋葉多酚最佳提取乙醇濃度為50%。

圖2 乙醇濃度對菊芋葉多酚的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on polyphenol yield of jerusalem artichoke leaves

2.1.3 超聲時間對菊芋葉多酚提取效果的影響

由圖3 可知，當超聲處理時間在10～50 min 時，菊芋葉多酚得率隨著超聲時間的延長而不斷升高；當超聲時間為50 min 時，多酚得率達到最大值，為50.65 mg/g；當超聲時間大于50 min 時，菊芋葉多酚得率開始降低。由于超聲時間的延長，超聲波會導致提取液溫度升高，使多酚穩(wěn)定性降低，得率減小。故選擇超聲時間50 min 作為最佳提取時間。

圖3 超聲時間對菊芋葉多酚得率的影響Fig.3 Effect of ultrasound time on polyphenol yield of jerusalem artichoke leaves

2.1.4 超聲功率對菊芋葉多酚提取效果的影響

由圖4 可知，隨著超聲功率的增大，菊芋葉多酚得率先增大后減小。當超聲功率為500 W 時，菊芋葉多酚得率接近最大值，為34.31 mg/g；超聲功率大于600 W 之后，菊芋葉多酚得率降低。由于隨著超聲功率的增大，熱效應也在增強，很容易造成多酚分子結構的破壞，使得菊芋葉多酚得率降低。因此，確定超聲功率500 W 為最佳提取功率。

圖4 超聲功率對菊芋葉多酚得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on polyphenol yield of jerusalem artichoke leaves

2.2 響應面法優(yōu)化提取菊芋葉多酚

2.2.1 響應面試驗方案及結果

在單因素試驗的基礎之上，進行料液比（X1）、乙醇濃度（X2）、超聲時間（X3）、超聲功率（X4）與菊芋葉多酚得率之間的四因素三水平的響應面優(yōu)化試驗，結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

續(xù)表2 響應面試驗設計及結果Continue table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.2.2 響應面數學模型的建立與方差分析

使用Design-Expert 8.0.6 軟件對表2 中的響應面數據進行二次多項式回歸擬合，以料液比（X1）、乙醇濃度（X2）、超聲時間（X3）、超聲功率（X4）為自變量，菊芋葉多酚得率（Y）為響應值，建立二次多元回歸方程：Y=31.37-0.37X1+0.75X2-0.75X3-0.25X4-3.28X1X2-4.55X1X3+0.27X1X4+0.22X2X3-0.009 75X2X4-0.79X3X4-3.28X12-3.89X22-2.98X32-3.72X42。

對響應面回歸模型進行方差分析，結果見表3。

由表3 可知，該數學模型回歸極顯著（P＜0.000 1），失擬項P=0.577 3＞0.05，不顯著；試驗值與預測值有著高度的相關性（R2=0.995 2，R2adj=0.990 3），說明該數學模型與試驗擬合較好，試驗誤差較小，故可以用于菊芋葉多酚得率的理論推測。由F 檢驗可以判斷得到各個變量對菊芋葉多酚得率的影響大小順序為：超聲時間（X3）＞乙醇濃度（X2）＞料液比（X1）＞超聲功率（X4）。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for regression model

2.2.3 各因素交互作用分析

等高線可以直觀地反映各因素對菊芋葉多酚提取效果的交互作用程度，等高線呈圓形表示兩因素交互作用不顯著，而呈橢圓形則表示兩因素交互作用顯著。從表3 和超聲輔助提取菊芋葉多酚的等高線和響應面圖（圖5～7）可知，X1、X2、X3、X1X2、X1X3、X3X4、X12、X22、X32、X42對多酚得率的影響達到了極顯著水平（P＜0.01），X4對多酚得率的影響達顯著水平（P＜0.05）。表明料液比與乙醇濃度、料液比與超聲時間、超聲時間與超聲功率之間的交互作用極顯著（P＜0.01）。

圖5 料液比與乙醇濃度的交互作用對多酚得率影響的響應面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots of the effect of the interaction between material-liquid ratio and ethanol concentration on polyphenol yield

圖6 料液比與超聲時間的交互作用對多酚得率影響的響應面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots of the effect of the interaction between material-liquid ratio and ultrasonic time on polyphenol yield

圖7 超聲時間與超聲功率的交互作用對多酚得率影響的響應面圖和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots of the effect of the interaction between ultrasonic time and ultrasonic power on polyphenol yield

2.2.4 驗證試驗

根據Design-Expert 8.0.6 統(tǒng)計分析軟件得到，超聲輔助提取菊芋葉多酚的最佳提取條件為：料液比1∶19.52（g/mL），乙醇濃度51.36%，超聲時間49.57 min，超聲功率496.70W，在此條件下多酚得率為31.46mg/g。為了操作方便，修正最佳提取條件為：料液比1∶20（g/mL），乙醇濃度50%，超聲時間50 min，超聲功率500W，在此條件下，得到菊芋葉多酚得率為31.18mg/g，與模型預測值之間的相對誤差僅為0.89%，因此證明該模型合理，試驗結果較準確。

2.3 菊芋葉多酚抗氧化活性檢測結果

2.3.1 菊芋葉多酚的羥自由基清除能力

由圖8 可知，菊芋葉多酚具有一定的·OH 清除能力，其對·OH 的清除率隨著濃度的升高而增大，呈現量效關系，1.2 mg/mL 菊芋葉多酚對羥自由基的清除能力達90.39%；相同濃度下菊芋葉多酚對·OH的清除率略低于VC，菊芋葉多酚和VC 的IC50值分別為0.268 mg/mL 和0.211 mg/mL。

圖8 菊芋葉多酚對羥自由基的清除作用Fig.8 The removal of hydroxyl free radicals by jerusalem artichoke leaves polyphenols

2.3.2 菊芋葉多酚的抗超氧陰離子自由基能力

由圖9 可知，菊芋葉多酚具有較強的抗O2·能力，當菊芋葉多酚濃度從0.2 mg/mL 增大至1.2 mg/mL時，其抗O2·活力由10.62 U/L 提高到45.66 U/L，同一濃度菊芋葉多酚的抗O2·能力明顯高于VC。與VC 相比，1.2 mg/mL 菊芋葉多酚的抗O2·能力提高了59.26%?？梢?，菊芋葉多酚的抗O2·活力顯著高于VC（P＜0.05）。

圖9 菊芋葉多酚對超氧陰離子自由基的清除作用Fig.9 The removal of super-oxygen anions radicals (O2·) by jerusalem artichoke leaves polyphenols

2.3.3 菊芋葉多酚的DPPH 自由基清除能力

由圖10 可知，菊芋葉多酚對DPPH·有很強的清除作用，且其清除能力具有一定的量效關系，1.2 mg/mL菊芋葉多酚對DPPH·的清除能力達93.27%；在同一濃度下，菊芋葉多酚的DPPH·清除能力與VC 的DPPH·清除能力之間無顯著差異，二者的IC50值分別為0.014 mg/mL 和0.020 mg/mL。

圖10 菊芋葉多酚對DPPH·的清除作用Fig.10 The removal of DPPH free radicals by jerusalem artichoke leaves polyphenols

3 結論

本研究以菊芋葉為原料，采用超聲輔助法提取菊芋葉中的多酚，在單因素試驗的基礎上，通過響應面設計優(yōu)化了菊芋葉多酚的提取工藝，并且測定其抗氧化能力。結果表明，各因素對菊芋葉多酚得率影響的大小順序為：超聲時間（X3）＞乙醇濃度（X2）＞料液比（X1）＞超聲功率（X4）；菊芋葉多酚的最佳提取工藝條件為：料液比1∶20（g/mL），乙醇濃度50%，超聲時間50 min，超聲功率500 W，在此工藝條件下，菊芋葉多酚得率為31.18 mg/g；菊芋葉多酚有較強的抗氧化能力，1.2 mg/mL 菊芋葉多酚的·OH、DPPH·清除率以及抗O2·活力分別達90.39%、93.27%、45.66 U/L，尤其是其抗O2·能力，與同濃度的VC 相比提高了59.26%?？梢?，超聲輔助提取菊芋葉多酚具有得率高、抗氧化能力強等優(yōu)點，可為菊芋葉的綜合利用提供理論依據和技術參數。