早孕因子的研究現(xiàn)狀及進(jìn)展

鐘永怡 周泉 王家驥

【摘要】早孕因子（Early Pregnancy Factor，EPF）是一種存在于哺乳動(dòng)物妊娠過(guò)程中的免疫抑制因子，目前認(rèn)為是分子伴侶10（Cnp10）的同源物質(zhì)，是最早作為明確妊娠的一批生化指標(biāo)之一。本文對(duì)EPF的發(fā)展歷程、來(lái)源、本質(zhì)和特性及其分離、純化、檢測(cè)和應(yīng)用進(jìn)行闡述，說(shuō)明國(guó)內(nèi)外的研究現(xiàn)狀及進(jìn)展，并加以總結(jié)，了解到EPF不僅在超早期妊娠檢測(cè)中具有重要作用，在治療腫瘤和免疫相關(guān)疾病、胚胎移植、人工授精甚至在畜牧業(yè)中也起到重要作用。EPF的提純和檢測(cè)方面在近幾年取得明顯的成果，使EPF能運(yùn)用于更廣泛的領(lǐng)域。

【關(guān)鍵詞】早孕因子、檢測(cè)方法、應(yīng)用

早孕因子 （early pregnancy factor，EPF）是在妊娠早期哺乳動(dòng)物血清中存在的一種分泌蛋白，由澳大利亞學(xué)者M(jìn)orton等在1974年尋找一種用于移植的天然生物模型的實(shí)驗(yàn)中意外發(fā)現(xiàn)。由于它在受精后6～14小時(shí)即能從母體血清中檢測(cè)到，因此被認(rèn)為是確定妊娠的最早的生化指標(biāo)之一。

1 ?早孕因子本質(zhì)

早孕因子（EPF）是一種具有免疫抑制、耐熱、耐透析和較強(qiáng)耐酸堿性質(zhì)的糖蛋白，且無(wú)物種特異性，大部分動(dòng)物EPF相對(duì)分子質(zhì)量約在10 000～450 000[1]。1991年Clarke[2]等研究認(rèn)為EPF活性的表達(dá)是由硫氧還原蛋白（thioredoxin，TRX）與孕婦血清共同作用除去RITS抗體，引起EPF活性的表達(dá)，從而證明EPF在試驗(yàn)中只起到調(diào)節(jié)作用。Aranha[3]通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)得孕婦淋巴細(xì)胞中存在EPF活性，認(rèn)為在孕婦懷孕期間EPF可能是FC受體樣分子。2004年Cheng等[4]首次在孕婦宮頸粘液中發(fā)現(xiàn)EPF活性，血清中觀察到的平行變化，可能是用于評(píng)估胚胎活力的另一個(gè)有用的指標(biāo)。往后的眾多實(shí)驗(yàn)表明，EPF的活性并非由單一因素引起，而是通過(guò)各種早孕因子影響要素共同作用產(chǎn)生的生物活性。

1994年Cavanagh[5]通過(guò)研究確定EPF是熱休克分子家族的成員，并執(zhí)行細(xì)胞外分子伴侶的作用。Morton等[6]認(rèn)為EPF與細(xì)胞外伴侶蛋白10（Cpn10）屬于同源物質(zhì)。Cpn10是在小鼠線粒體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種起著分子伴侶作用修飾其他蛋白質(zhì)的物質(zhì)，但是并不能通過(guò)花環(huán)抑制試驗(yàn)，2000年Kawamura等[7]通過(guò)檢測(cè)不同階段的Cpn10和Cpn60mRNA在卵母細(xì)胞和胚胎中的表達(dá)，用花環(huán)抑制試驗(yàn)對(duì)大鼠Cpn10的EPF活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果提示每個(gè)階段卵母細(xì)胞和胚胎中均檢測(cè)到Cpn10和Cpn60的相同mRNA表達(dá)水平，而在正常細(xì)胞的CPN 10中沒有檢測(cè)到EPF活性。由于使用多克隆抗體免疫沉淀CPN 10不影響孕鼠血清EPF活性，所以證明Cpn10與EPF并非相同的物質(zhì)。

2 ?早孕因子來(lái)源

EPF最初是從孕鼠受精后4～6小時(shí)的血清中發(fā)現(xiàn)，1974年Morton等[8]科學(xué)家首次發(fā)現(xiàn)在孕鼠交配后6h產(chǎn)生的一種具有生長(zhǎng)因子性質(zhì)的蛋白質(zhì)，且能使T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生玫瑰花環(huán)的過(guò)程受阻，由此產(chǎn)生了檢測(cè)EPF的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法——玫瑰花環(huán)抑制試驗(yàn)（RIT）。隨后也在豬受精后4小時(shí)，綿羊6小時(shí)，牛24～26小時(shí)的血清中發(fā)現(xiàn)EPF，1983年Rolfe等[9]在所有11例非感染性腫瘤患者和10例精原細(xì)胞瘤患者中，檢測(cè)到tEPF或其自由組分tEPF-A和tEPF-B。在健康男性對(duì)照組和非生殖細(xì)胞腫瘤或良性睪丸疾病患者的血清中未檢測(cè)到，推測(cè)EPF可能是生殖細(xì)胞瘤的一個(gè)腫瘤標(biāo)志物。1997年Lash等[10-11]通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，胚胎條件培養(yǎng)基、血小板活化因子和皮質(zhì)顆粒釋放培養(yǎng)基都可以通過(guò)雌性小鼠卵巢和輸卵管刺激早期妊娠因子的產(chǎn)生，這種刺激被血小板激活因子受體拮抗劑的存在完全阻斷，實(shí)驗(yàn)表明血小板活化因子是受精卵釋放的卵因子，啟動(dòng)早孕因子合成。

3 ?EPF的分離、純化和檢測(cè)

3.1 EPF分離、純化

在EPF發(fā)現(xiàn)后的這么多年里，至今未發(fā)現(xiàn)成功高效分離純化EPF的例子。但是在近幾年EPF的純化率比起以前有了提高。目前EPF活性物質(zhì)大多數(shù)是從妊娠母體的血清中獲取。但由于EPF的來(lái)源、實(shí)驗(yàn)室條件等限制，EPF的特性也各不相同，分離和純化的方法也有所區(qū)別，目前天然EPF主要純化方法仍以層析和過(guò)濾為主。2012年溫志峰等[12]對(duì)正常早孕婦女血清中早孕因子（EPF）的分離純化過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化，采用兩步法，依次使用DEAE Fast Flow 離子交換色譜和 Heparin Fast Flow 親和色譜，從妊娠 12 周內(nèi)的正常早孕婦女混合血清中提純EPF，明顯提高了純化效率。隨著基因工程的發(fā)展，EPF的氨基酸序列已經(jīng)被破解，已經(jīng)有人通過(guò)基因工程制備出重組EPF，其性質(zhì)與天然提取的EPF并無(wú)區(qū)別。2002年Morton等[6]分別用重組原核和真核表達(dá)系統(tǒng)制備重組EPF，以兩種產(chǎn)品和天然EPF比較生物活性，他們發(fā)現(xiàn)兩者免疫抑制性質(zhì)無(wú)顯著差異。吳曉亮、鄭瑋璐[13-14]利用基因工程技術(shù)制備EPF重組蛋白。練玉銀、杜曉明、劉云等[15-17]利用基因工程技術(shù)克隆出了EPF 基因，從而獲得了大量具有良好生物學(xué)特性的 EPF 重組蛋白，有利于更好的幫助了解母體對(duì)胚胎是否產(chǎn)生免疫耐受。吳曉亮[13]、劉云[17]和劉靜靜[18]分別以小鼠、奶牛和綿羊?yàn)閷?shí)驗(yàn)對(duì)象利用基因工程制備出EPF單克隆抗體，為早孕診斷試劑的開發(fā)和某些惡性腫瘤的早期診斷奠定基礎(chǔ)。

3.2 EPF檢測(cè)

對(duì)于EPF活性的檢測(cè)大部分人一直沿用最初的RIT法，但是此法缺點(diǎn)十分明顯：實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜、需要條件不易控制且耗時(shí)長(zhǎng)，最重要的是所得結(jié)果人為主觀性較強(qiáng)，因此人們一直探尋更好的檢測(cè)方法。1997年Fan等[19]通過(guò)實(shí)驗(yàn)明確超早期妊娠可以通過(guò)檢測(cè)孕婦血清中排卵后2天的EPF活性，精度為88.6%，這為妊娠期婦女意外終止妊娠或意外懷孕的婦女提供了診斷依據(jù)，有助于計(jì)劃生育。2000年Ohnuma等[20]將玫瑰花環(huán)試驗(yàn)應(yīng)用于馬，并提出此方法是有用的馬懷孕診斷標(biāo)準(zhǔn)。2000年張冬云等[21]采用DEAE 纖維素離子交換層分析，S-Sepharosefastflow離子交換層析，ConA-SepharoseCl4B親和層析，Heparin-SepharoseCl6B親和層析等方法進(jìn)行純化，利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳和等電聚焦電泳法分別檢測(cè)肽圖和等電點(diǎn)，結(jié)果與國(guó)內(nèi)外報(bào)道的從孕婦血清中提取的EPF活性一致。2003年孫文東等[22]采用硫酸銨分級(jí)沉淀、DEAE-Sepharose、CM-Sepharose柱層析、玫瑰花環(huán)抑制滴度試驗(yàn)、SDS- PAGE和等電聚焦等技術(shù)對(duì) EPF進(jìn)行生化特性的研究，結(jié)果與國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究一致。盡管檢測(cè)方法在眾多學(xué)者研究下的不斷成熟完善，但仍需不斷尋找更優(yōu)越、簡(jiǎn)便和實(shí)用的方法。

4 ?EPF的應(yīng)用研究

4.1 臨床應(yīng)用

4.1.1 超早期妊娠診斷

由于能夠在動(dòng)物受精后較短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)出EPF活性，這比檢測(cè)到人絨毛膜促性腺激素升高的時(shí)間要早很多，F(xiàn)an等[23]通過(guò)研究得出利用RIT試驗(yàn)檢測(cè)EPF，陽(yáng)性率為 88.6%，假陽(yáng)性率為 17.1%，假陰性率為 3.4%，而檢測(cè)此時(shí)的HCG水平則很低，并且EPF在血液循環(huán)中活性相對(duì)更明顯。因此EPF適合于超早期妊娠的診斷，能提前確認(rèn)妊娠情況和對(duì)胚胎進(jìn)行觀察，有針對(duì)性的對(duì)孕婦進(jìn)行保健服務(wù)。且在近幾年制備出的EPF單克隆抗體使得EPF的準(zhǔn)確檢測(cè)提供可能。

4.1.2 腫瘤的早期診斷

1997年Fan[23]研究表明，診斷惡性滋養(yǎng)層的腫瘤可通過(guò)檢測(cè)EPF樣活動(dòng)以及精度91.3%EPF樣活動(dòng)可以作為區(qū)分良性和惡性腫瘤滋養(yǎng)層的指標(biāo)。目前可以通過(guò)RIT試驗(yàn)測(cè)定 EPF的值，可以診斷膀胱癌、黑色素瘤、絨癌、惡性葡萄胎等 4 種腫瘤血清和惡性葡萄胎清宮人流血及黑色素瘤[14]，因此用檢測(cè)EPF活性來(lái)對(duì)早期腫瘤及判斷是否為惡性腫瘤是可行的，且具有較高準(zhǔn)確率。

4.1.3 腫瘤的治療

1990年Quinn等[24]通過(guò)在接種 MCA-2 腫瘤細(xì)胞的小鼠的體內(nèi)每天注射四次抗EPF IGM，每次500ug，發(fā)現(xiàn)13天后EPF及tEPF的特異性抗體能清除所有tEPF活性腫瘤細(xì)胞，提出EPF是培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的產(chǎn)品。除此，也有人提出利用熒光標(biāo)記后的EPF單克隆抗體攜帶治療藥物，直接作用于癌癥病灶。因此，利用EPF的特性治療相關(guān)腫瘤具有廣闊的前景。

4.2 其他應(yīng)用

2015年卜建華[25]認(rèn)為可以將EPF應(yīng)用于畜牧業(yè)，用于發(fā)現(xiàn)奶牛屢配不孕的難題，能提前知曉是卵巢疾病還是公牛精子的原因?qū)е虏辉?。若是配種后發(fā)現(xiàn)無(wú)EPF活性，這說(shuō)明是由于受精導(dǎo)致不孕，若是配種后EPF升高，隨后降低至陰性水平，提示死胎。除此以外，EPF可應(yīng)用于潰瘍、類風(fēng)濕、胚胎移植和人工受精方面的治療。

參考文獻(xiàn)

[1] Cavanagh A C. Identification of early pregnancy factor as chaperonin 10：implications for understanding its role [J]. Rev Reprod.

[2] Clarke F M， Orozco C， Perkins A V， et al. Identification of molecules involved in the 'early pregnancy factor' phenomenon.[J]. Journal of Reproduction & Fertility， 1991， 93（2）：525.

[3] Aranha C， Bordekar A， Shahani S. Isolation and Purification of an Early Pregnancy Factor–like Molecule from Culture Supernatants Obtained from Lymphocytes of Pregnant Women： II. Identification of the Molecule as a FC-Receptor–like Molecule： A Preliminary Report[J]. Journal of Assisted Reproduction and Genetics， 1998， 15（10）：619-24.

[4] Cheng S J， Zheng Z Q. Early pregnancy factor in cervical mucus of pregnant women.[J]. American Journal of Reproductive Immunology， 2004， 51（2）：102-105.

[5] Cavanagh A C， Morton H. The purification of early-pregnancy factor to homogeneity from human platelets and identification as chaperonin 10.[J]. European Journal of Biochemistry， 1994， 222（2）：551.

[6] Morton H， Mckay D A， Murphy R M， et al. Production of a recombinant form of early pregnancy factor that can prolong allogeneic skin graft survival time in rats[J]. Immunology & Cell Biology， 2000， 78（6）：603-7.

[7] Kawamura K， Fukuda J， Itoh H， et al. Chaperonin 10 in the rat oocytes and early embryos： its expression and activity for early pregnancy factor[J]. American Journal of Reproductive Immunology， 2000， 44（4）：242.

[8] Morton H， Hegh V， Clunie G J. Immunosuppression detected in pregnant mice by rosette inhibition test.[J]. Nature， 1974， 249（456）：459.

[9] Rolfe B E， Morton H， Cavanagh A C， et al. Detection of an Early Pregnancy Factor-Like Substance in Sera of Patients With Testicular Germ Cell Tumors[J]. American Journal of Reproductive Immunology， 1983， 3（2）：97-100.

[10] Lash G E， Legge M. Induction of early pregnancy factor activity in vitro by platelet-activating factor in mice.[J]. J Reprod Fertil， 1997， 109（2）：187-91.

[11] Ito K， Takahashi M， Kawahata K， et al. Supplementation effect of early pregnancy factor-positive serum into bovine in vitro fertilization culture medium[J]. American Journal of Reproductive Immunology， 1998， 39（6）：356-61.

[12] 溫志鋒， 練玉銀， 王家驥，等. 早孕因子分離純化方法的優(yōu)化[J]. 免疫學(xué)雜志， 2012（12）：1073-1076.

[13] 吳曉亮. 腫瘤源性早孕因子單克隆抗體制備及鑒定[D]. 廣州醫(yī)學(xué)院， 2011.

[14] 鄭瑋璐， 劉為民， 陳芳，等. Hela細(xì)胞早孕因子基因的克隆與原核表達(dá)[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展， 2015， 36（5）：11-15.

[15] 練玉銀， 王家驥. 重組早孕因子（EPF）的表達(dá)、純化及鑒定[J].生殖與避孕， 2012， 32（3）： 156-160.

[16] 杜曉明， 張改平， 王麗， 等. 重組人早孕因子的表達(dá)與純化[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2011， 27（14）： 40-44.

[17] LIU Yun， JIA Bin， SHI Feng，等. 奶牛早孕因子重組蛋白的原核表達(dá)、純化及多克隆抗體的制備[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī)， 2015， 42（4）：877-882.

[18] 劉靜靜， 劉月琴. 綿羊早孕因子單克隆抗體的制備及鑒定[C]// 全國(guó)養(yǎng)羊生產(chǎn)與學(xué)術(shù)研討會(huì). 2015.

[19] Fan X G， Zheng Z Q， Fan X G， et al. A Study of Early Pregnancy Factor Activity in Preimplantation[J]. American Journal of Reproductive Immunology， 1997， 37（5）：359-64.

[20] Ohnuma K， Yokoo M， Ito K， et al. Study of early pregnancy factor （EPF） in equine （Equus caballus）.[J]. American Journal of Reproductive Immunology， 2000， 43（3）：174-9.

[21] 張冬云， 王家驥， 林麗白，等. "人流血"中早孕因子的分離、純化及鑒定[J]. 中國(guó)生物制品學(xué)雜志， 2000， 13（3）：151-153.

[22] 孫文東， 吳瑞英， 鄧雁如，等. 孕牛血清中早孕因子的生化特性研究[J]. 新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2003， 26（3）：222-223.

[23] Fan X， Yan L， Jia S， et al. A Study of Early Pregnancy Factor Activity in the Sera of Women with Trophoblastic Tumor[J]. American Journal of Reproductive Immunology， 1999， 41（3）：204-208.

[24] Quinn K A， Athanasas-Platsis S， Wong T Y， et al. Monoclonal antibodies to early pregnancy factor perturb tumour cell growth.[J]. Clinical & Experimental Immunology， 1990， 80（1）：100-8.

[25]卜建華， 雷靜， 李艷艷，等. 奶牛早期妊娠診斷研究進(jìn)展[J]. 寧夏農(nóng)林科技， 2015， 56（11）：54-55.

作者簡(jiǎn)介

鐘永怡（1993-），女，漢族，廣東清遠(yuǎn)，碩士研究生，廣州華立科技職業(yè)學(xué)院， 511325 ，公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué)。

本文系：醫(yī)養(yǎng)結(jié)合技術(shù)研究所（HLZ142010）;