高溫木質(zhì)纖維素降解菌的篩選鑒定及其堆肥應(yīng)用

武肖莎 李再興 黃亞麗 馬駿 韓學(xué)濱 張凡

摘要 為解決畜禽糞便堆肥發(fā)酵啟動(dòng)難、木質(zhì)纖維素降解不充分等問(wèn)題，篩選能在高溫（50～70 ℃）堆肥中高效降解木質(zhì)纖維素的高溫降解菌株，并評(píng)估其在牛糞-秸稈堆肥應(yīng)用效果。從高溫時(shí)期堆肥樣品中篩選能在50、60和70 ℃高溫下生長(zhǎng)、產(chǎn)酶的高溫降解菌株。通過(guò)水解圈、秸稈崩解、纖維素酶活測(cè)試試驗(yàn)，篩選出BS40-4菌株，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和16S rRNA測(cè)序法，確定為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis。該菌株的堆肥應(yīng)用效果結(jié)果表明，接種BS40-4菌株的處理具有發(fā)酵啟動(dòng)快、升溫迅速、高溫持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、木質(zhì)纖維素降解充分等優(yōu)勢(shì)，可有效提高堆肥發(fā)酵效率。

關(guān)鍵詞 木質(zhì)纖維素;高溫降解菌;篩選鑒定;堆肥發(fā)酵;應(yīng)用效果

中圖分類號(hào) S 141.4? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2021）20-0068-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.20.019

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Screening， Identification and Its Composting Application of High-temperature Strain for Degrading Lignocellulose

WU Xiao-sha? LI Zai-xing? HUANG Ya-li2 et al

（1. Hebei Haoyuan Environmental Engineering Coporation Ltd.， Shijiazhuang，Hebei 050011;2. School of Environmental Science and Engineering， Hebei University of Science and Technology， Shijiazhuang，Hebei 050018）

Abstract To solve these problems of difficult start-up and insufficient degradation of lignocellulose during livestock and poultry manure composting， this study screened high-temperature strains that could efficiently degrade lignocellulose during high-temperature （50-70 ℃） composting， and evaluated its application effect in cow manure-straw composting. High-temperature compost samples were used to screen high-temperature degrading strains that could grow and produce enzymes at 50， 60 and 70 ℃.BS40-4 strain was screened through these experiments of hydrolysis loop， straw disintegration， and cellulase activity testing， and determined to be Bacillus subtilis by morphological observation and 16S rRNA sequencing. The application effects of BS40-4 strain in composting showed that inoculating BS40-4 strain treatment had the advantages of fast fermentation start， rapid heating， long high temperature duration and sufficient lignocellulose degradation， which could effectively improve the composting efficiency.

Key words Lignocellulose;High-temperature degrading strain;Screening and identification;Composting fermentation;Application effect

基金項(xiàng)目 河北省省級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目（19227306D）。

作者簡(jiǎn)介 武肖莎（1993—），女，河北邯鄲人，助理工程師，碩士，從事固體廢物資源化研究。*通信作者，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事水污染控制和固體廢物資源化研究。

收稿日期 2021-02-25

隨著我國(guó)城市化速度不斷加快以及人民對(duì)美好生活的追求，奶制品和肉制品的需求量與日俱增，這推動(dòng)著畜禽養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)在養(yǎng)殖模式上不斷革新，養(yǎng)殖規(guī)模也不斷擴(kuò)大。與此同時(shí)，來(lái)自養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的畜禽糞便污染和資源不合理利用成為阻礙畜禽養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展和控制農(nóng)業(yè)面源污染的重要因素。好氧堆肥由于其在經(jīng)濟(jì)和生物學(xué)上的優(yōu)勢(shì)，成為一種管理和利用畜禽糞便的環(huán)境友好型生物技術(shù)[1]。好氧堆肥技術(shù)利用不同微生物和相應(yīng)酶將不穩(wěn)定和有害的有機(jī)物轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定且安全的復(fù)雜化合物（如腐殖質(zhì)）的過(guò)程，從而實(shí)現(xiàn)有機(jī)質(zhì)礦質(zhì)化、穩(wěn)定化、腐殖化以及病原微生物無(wú)害化[2]。

堆肥物料中富含結(jié)構(gòu)復(fù)雜、微生物可利用性差的木質(zhì)纖維素，嚴(yán)重阻礙堆肥化進(jìn)程[3]。木質(zhì)纖維素主要由半纖維素、纖維素和木質(zhì)素組成，由于木質(zhì)素的致密三維網(wǎng)狀芳環(huán)結(jié)構(gòu)和纖維素的高結(jié)晶度等特點(diǎn)，使得木質(zhì)纖維素很難被酶解或微生物降解[4]。因此，堆肥實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中普遍存在啟動(dòng)緩慢、周期較長(zhǎng)、高溫期停留時(shí)間短、木質(zhì)纖維素降解不充分等問(wèn)題。如何有效提高堆肥過(guò)程中木質(zhì)纖維素的降解效率成為堆肥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

在堆肥中利用外源微生物強(qiáng)化手段以優(yōu)化微生物群落結(jié)構(gòu)，提高微生物產(chǎn)酶活性，可有效改善堆肥效率低、木質(zhì)纖維素降解難、周期長(zhǎng)等問(wèn)題[5]。羅曉莎等[6]研究表明在豬糞-木屑堆肥中接種嗜熱側(cè)孢霉可加快堆肥升溫，提高纖維素類和木質(zhì)素降解的關(guān)鍵酶活性，促進(jìn)有機(jī)質(zhì)分解和轉(zhuǎn)化。張喜慶等[7]從自然發(fā)酵的牛糞中分離獲得的高效纖維素分解菌在堆肥發(fā)酵方面具有較大的應(yīng)用潛力。王順利等[8]在牛糞堆肥中接種木質(zhì)纖維素分解復(fù)合菌劑，提高了堆肥升溫速度和高溫持續(xù)期溫度，促進(jìn)了堆肥快速腐熟，減少了養(yǎng)分損失。因此，通過(guò)在堆肥中接種微生物是加速木質(zhì)纖維素物質(zhì)降解、提高堆肥效率、促進(jìn)堆肥腐熟的關(guān)鍵方法。

堆肥高溫期的過(guò)高溫度會(huì)降低木質(zhì)纖維素降解菌的活性、豐度和多樣性，從而降低了其降解木質(zhì)纖維素的效率，因此，在堆肥過(guò)程中添加高溫木質(zhì)纖維素降解菌可以有效解決此類問(wèn)題。該研究從牛糞-秸稈堆肥高溫時(shí)期樣品中篩選出高溫（50～70 ℃）下能高效降解木質(zhì)纖維素的菌株并進(jìn)行鑒定，將其接種于牛糞-秸稈堆肥發(fā)酵過(guò)程中，探究其堆肥應(yīng)用效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 堆肥樣品。

高溫木質(zhì)纖維素降解菌篩選所需高溫時(shí)期的堆肥樣品來(lái)源于河北省某堆肥企業(yè)。

1.1.2 堆肥原料。

新鮮牛糞來(lái)自河北省某奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)，玉米秸稈來(lái)自河北省石家莊市近郊農(nóng)戶。2種原料的理化性質(zhì)見表1。

1.1.3 培養(yǎng)基。

該研究主要采用4種培養(yǎng)基：①富集培養(yǎng)基，用于高溫降解菌初步富集篩選[9];②羧甲基纖維鈉（CMC-Na）培養(yǎng)基和剛果紅平板培養(yǎng)基，用于高溫降解菌分解木質(zhì)纖維素相關(guān)的酶活性檢測(cè)[10];③秸稈降解培養(yǎng)基，用于高溫降解菌株的復(fù)篩。以上所用的培養(yǎng)基在試驗(yàn)前應(yīng)進(jìn)行121 ℃高壓滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 高溫降解菌株的培養(yǎng)與初篩。

稱取5 g高溫時(shí)期的堆肥樣品接入50 mL無(wú)菌水的150 mL三角瓶中，25 ℃、150 r/min條件下振蕩1 h，靜置30 min吸取1 mL懸濁液加入100 mL富集培養(yǎng)基中，分別置于50、60、70 ℃下150 r/min振蕩培養(yǎng)7 d。將50、60、70 ℃的富集培養(yǎng)液用蒸餾水稀釋濃度梯度為10-3～10-8的懸濁液，將其涂布于CMC-Na培養(yǎng)基上，分別置于50、60、70 ℃篩選溫度下培養(yǎng)48 h，用1 g/L剛果紅染液染色30 min，棄去染液，加入1 mol/L NaCl反復(fù)沖洗，挑選有水解圈的菌株分離純化。將目標(biāo)菌株的單菌落點(diǎn)接至剛果紅平板培養(yǎng)基上，分別置于50、60、70 ℃篩選溫度下培養(yǎng)48 h，根據(jù)透明圈直徑（D）和菌落直徑（H）比值大小初步判斷菌株產(chǎn)纖維素酶能力，D/H值大表示菌株水解羧甲基纖維素的能力強(qiáng)。

1.2.2 高溫降解菌株的復(fù)篩。

將D/H值大的目標(biāo)菌株分別接種至富集培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d后，用無(wú)菌水制成菌懸液，取5 mL菌懸液接種于秸稈降解培養(yǎng)基中，分別置于50、60和70 ℃下150 r/min培養(yǎng)15 d后，取出秸稈，依次用蒸餾水、稀酸溶液、蒸餾水沖洗，80 ℃烘干至恒重后稱質(zhì)量，通過(guò)失重法計(jì)算秸稈降解率（%）。CMC酶、FPA酶、β-葡萄糖苷酶等木質(zhì)纖維素酶活采用DNS法測(cè)定。通過(guò)秸稈降解率和木質(zhì)纖維素關(guān)鍵酶活2個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)高溫降解菌株復(fù)篩。

1.2.3 高溫降解菌株的鑒定。

對(duì)“1.2.2”復(fù)篩的目標(biāo)菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定，由生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 堆肥應(yīng)用效果試驗(yàn)。

以新鮮牛糞和玉米秸稈為原料，新鮮牛糞與玉米秸稈濕物質(zhì)量比5∶ 調(diào)節(jié)初始含水率為60%，C/N值為25。未接種菌劑的處理命名為CK，接種3‰目標(biāo)菌株菌劑的處理命名為BS，接種3‰ EM菌劑（市場(chǎng)銷售）的處理命名為EM。堆肥設(shè)備為反應(yīng)器堆肥裝置，發(fā)酵周期為35 d，通風(fēng)方式為連續(xù)通風(fēng)，通風(fēng)速率以0.4 L/（kg·min），在第0天、第35天采集堆肥樣品，并根據(jù)處理將其命名為CK-0、CK-35、BS-0和BS-35等。堆肥期間對(duì)發(fā)酵溫度和環(huán)境溫度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。堆肥樣品中纖維素、半纖維素、木質(zhì)素含量采用Van Soest分析法測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫降解菌株的分離與初篩

在50、60、70 ℃篩選溫度條件下，通過(guò)稀釋涂布平板法，對(duì)高溫時(shí)期的堆肥樣品進(jìn)行了反復(fù)分離與純化，獲得10株具有木質(zhì)纖維素降解能力的高溫降解菌，其中包括50 ℃下分離得到5株（BS40-1～BS40-5），60 ℃下分離得到3株（BS40-6～BS40-8），70 ℃分離得到2株（BS40-9～BS40-10）。菌株剛果紅平板透明圈直徑（D）、菌落直徑（H）和D/H的數(shù)據(jù)如圖1所示。D值和D/H值越大，產(chǎn)纖維素酶能力越強(qiáng)，透明圈出現(xiàn)也越早。水解圈試驗(yàn)結(jié)果表明，篩選溫度不同，分離得到的菌株的木質(zhì)纖維素降解能力差異顯著。50、60和70 ℃篩選溫度下分離得到的菌株D/H值分別為2.63～5.14、2.25～4.63、1.81～4.31。因此，D/H值大小與篩選溫度的高低存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。經(jīng)剛果培養(yǎng)基初步篩選出3株不同溫度下具有明顯降解優(yōu)勢(shì)的高溫降解菌株，其中包括50 ℃分離得到的BS40- 60 ℃分離得到的BS40-6，70 ℃分離得到的BS40-9。

2.2 高溫降解菌株的復(fù)篩

由于不同菌株的生長(zhǎng)速度、產(chǎn)酶周期、菌落大小等方面存在差異性，D/H值的大小不能準(zhǔn)確代表實(shí)際菌株纖維素酶活大小。因此，為了進(jìn)一步驗(yàn)證10株菌對(duì)木質(zhì)纖維素的降解能力，將10株菌株分別接入秸稈降解培養(yǎng)基中，計(jì)算玉米秸稈降解率。從圖2可以看出，不同溫度下的高溫降解菌株對(duì)玉米秸稈降解能力具有顯著差異，具體為50、60和70 ℃溫度下分離得到的菌株的秸稈降解率分別為5.56%～30.83%、10.76%～27.72%和2.73%～13.41%。秸稈降解試驗(yàn)篩選出不同溫度下的玉米秸稈降解明顯的菌株與剛果紅培養(yǎng)基結(jié)果保持一致。玉米秸稈降解率的大小與篩選溫度的高低也存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。其中，接種BS40-4的玉米秸稈降解率達(dá)30.83%，顯著高于其他菌株的秸稈降解率。這可能由于BS40-4菌株具有較高的木質(zhì)纖維素酶活，因此對(duì)玉米秸稈降解效果較好。

以CMC-Na為碳源，獲取10株菌株的粗酶液。圖3展示了10種菌株的粗酶液中CMC酶、FPA酶和β-葡萄糖苷酶活性。纖維素酶是一種復(fù)合酶，主要包括CMC酶、FPA酶和β-葡萄糖苷酶，3種酶活性的高低在一定程度代表著菌株降解纖維素的能力。由于纖維素的降解是多種酶活協(xié)同作用的結(jié)果，因此3種酶的總活性高低用于評(píng)價(jià)菌株降解纖維素的能力大小。綜合來(lái)看，菌株BS40-4的3種酶活力及總活力均高于其他菌株，該菌株的β-葡萄糖苷酶活為19.42 U/mL，CMC酶活為32.89 U/mL，F(xiàn)PA酶活為27.38 U/mL。

綜合水解圈、秸稈降解試驗(yàn)、木質(zhì)纖維素酶活性的試驗(yàn)結(jié)果，選擇高溫降解菌株BS40-4進(jìn)行鑒定和下一步的堆肥應(yīng)用效果研究。

2.3 高溫降解菌株BS40-4鑒定

從高溫降解菌株BS40-4電鏡結(jié)果（圖4）可以看出，菌株BS40-4在電鏡下呈桿狀，有鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。

提取細(xì)菌BS40-4的16S rRNA基因組并由生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序。在NCBI blast數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。圖5顯示，該菌株BS40-4與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）顯示的序列同源性最高。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和16S rRNA序列分析，最終鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis，命名為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）BS40-4。BS40-4菌株已保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No.19757。

2.4 接種BS40-4的高溫堆肥應(yīng)用效果

發(fā)酵溫度是評(píng)估堆肥腐熟效果的重要物理指標(biāo)之一，反映出微生物的活躍程度。堆肥發(fā)酵溫度變化遵循一般規(guī)律，即堆肥依次經(jīng)歷了升溫階段、高溫階段、降溫階段和腐熟階段（圖6）。由于堆肥原料中高溫降解菌較少，CK處理升溫慢且高溫期持續(xù)較短，高溫期最高溫度也明顯低于EM和BS處理。以EM處理為對(duì)照，BS處理發(fā)酵溫度升溫更快，高溫期持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，能充分殺死堆肥中的病原微生物和蟲卵等。這說(shuō)明該研究篩選的高溫降解菌株BS40-4在高溫下微生物活性更旺盛，酶活性更強(qiáng)，木質(zhì)纖維素降解反應(yīng)快，使得堆肥體系維持較長(zhǎng)的高溫期。因此，高溫降解菌BS40-4在提高堆肥發(fā)酵效率具有優(yōu)越的應(yīng)用潛力。

木質(zhì)纖維素的降解是堆肥過(guò)程中的關(guān)鍵控制環(huán)節(jié)，可以體現(xiàn)堆肥的穩(wěn)定化和腐殖化進(jìn)程。在堆肥過(guò)程中木質(zhì)纖維素的降解效果見圖7。經(jīng)過(guò)堆肥發(fā)酵后，牛糞-秸稈混合物質(zhì)的木質(zhì)纖維素含量均有所下降。堆肥發(fā)酵后，BS處理堆肥后的木質(zhì)纖維素含量比堆肥初始值下降了34.0%，高于CK處理（23.7%）和EM處理（28.6%）。這說(shuō)明接種BS40-4菌株的處理在堆肥中半纖維素、纖維素和木質(zhì)素的降解更為充分更迅速，堆肥后三者分別下降13.6%、23.5%和7.1%。因此，高溫降解菌株BS40-4可在畜禽糞便堆肥中有效提高木質(zhì)纖維素的降解效率和能力。

3 結(jié)論

（1）該研究從高溫時(shí)期堆肥樣品中篩選能在50、60和70 ℃高溫下生長(zhǎng)、產(chǎn)酶的高溫降解菌株，結(jié)合水解圈、秸稈崩解、纖維素酶活測(cè)試試驗(yàn)結(jié)果，篩選出高溫降解菌株BS40- 通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和16S rRNA測(cè)序法，確定為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis。

（2）BS40-4菌株的堆肥應(yīng)用效果表明，對(duì)比未接種或接種EM菌劑的處理，接種BS40-4菌株的處理具有發(fā)酵啟動(dòng)快、升溫迅速、高溫持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、木質(zhì)纖維素降解充分等優(yōu)勢(shì)，從而提高堆肥發(fā)酵效率。

參考文獻(xiàn)

[1] AWASTHI M K，SARSAIYA S，WAINAINA S，et al.A critical review of organic manure biorefinery models toward sustainable circular bioeconomy：Technological challenges，advancements，innovations，and future perspectives[J].Renewable and sustainable energy reviews，2019，111：115-131.

[2] GAO X T，TAN W B，ZHAO Y，et al.Diversity in the mechanisms of humin formation during composting with different materials [J].Environmental science & technology，2019，53（7）：3653-3662.

[3] 徐杰，許修宏，門夢(mèng)琪，等.木質(zhì)纖維素降解菌劑DN-1促進(jìn)堆肥腐熟度的評(píng)估[J].中國(guó)土壤與肥料，2016（6）：146-151.

[4] 朱晨杰，張會(huì)巖，肖睿，等.木質(zhì)纖維素高值化利用的研究進(jìn)展[J].中國(guó)科學(xué)：化學(xué)，2015，45（5）：454-478.

[5] 李榮華，涂志能，ALI AMJAD，等.生物炭復(fù)合菌劑促進(jìn)堆肥腐熟及氮磷保留[J].中國(guó)環(huán)境科學(xué)，2020，40（8）：3449-3457.

[6] 羅曉莎，王明明，宋頎，等.接種嗜熱側(cè)孢霉對(duì)堆肥木質(zhì)纖維素降解的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，202 49（2）：63-67，71.

[7] 張喜慶，勾長(zhǎng)龍，婁玉杰，等.高效纖維素分解菌的分離鑒定及堆肥效果研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2016，35（2）：380-386.

[8] 王順利，劉克鋒，李榮旗，等.木質(zhì)纖維素分解復(fù)合菌劑強(qiáng)化牛糞堆肥工藝[J].農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào)，201 45（4）：201-207.

[9] 余培斌，杜晶，陳建新.高溫好氧堆肥過(guò)程中芽孢桿菌的篩選、鑒定及應(yīng)用[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2020，46（12）：199-205，212.

[10] 金迪，彭清靜，易浪波，等.一株纖維素降解細(xì)菌的篩選、鑒定及產(chǎn)酶條件分析[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2010，22（4）：289-29 295.