山楂食用酵素抗氧化及對(duì)脂肪酶活性

聶俊蓮，蘇嘉燁，張存莉

1.西北農(nóng)林科技大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院（楊凌 712100）；2.陜西五丁生物科技有限公司，漢中市食用植物酵素研發(fā)與檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（寧強(qiáng) 724400）

食用植物酵素是以可用于食品加工的植物為主要原料，添加或不添加輔料，經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分可供人類食用的酵素產(chǎn)品[1]，2019年被國(guó)家發(fā)改委列入《產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整指導(dǎo)目錄》鼓勵(lì)類產(chǎn)業(yè)。但目前社會(huì)上對(duì)酵素產(chǎn)品爭(zhēng)議較大，褒貶不一。山楂（Crataegus pinnatifidaBunge）為薔薇科植物山里紅或山楂的干燥成熟果實(shí)，其含有豐富的黃酮、多糖、酚和有機(jī)酸等化合物，具有顯著的降脂減肥、降血糖、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗氧化等作用[2-6]，目前國(guó)內(nèi)對(duì)山楂酵素的研究多集中于發(fā)酵工藝研究[7-9]。因此，此次試驗(yàn)以山楂為原料，采用多菌種混合發(fā)酵，探究山楂發(fā)酵前后的抗氧化和對(duì)胰脂肪酶的活性作用，以期為山楂資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山楂，市售；葡萄酒高活性干酵母，安琪酵母有限公司產(chǎn)品；乳酸菌（植物乳桿菌），臺(tái)灣亞芯生物科技有限公司；醋酸菌，滬釀1.01號(hào)醋酸菌，上海佳民釀造食品有限公司；纖維素酶，廣東永信食品配料有限公司；脂肪酶、磷酸氫二鈉（分析純）、磷酸二氫鈉（分析純）、DPPH（分析純）、ABTS（分析純）、總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；水楊酸（分析純），天津市天力化學(xué)試劑有限公司；七水合硫酸亞鐵（分析純），廣東光華科技股份有限公司；橄欖油（分析純）、聚乙烯醇（分析純）、95%乙醇（分析純），上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1801型紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；LDZX-50KBS型高壓滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；DHP-9052B型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；BPG-9056A型精密鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；ME204E/02型精密和分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)材料

山楂酵素：取500 g山楂，按適當(dāng)比例加水，取纖維素酶酶解后的山楂漿，將活化好的酵母菌、乳酸菌和醋酸菌先后接種到待發(fā)酵液中，發(fā)酵90 d左右。

1.3.2 有效成分的測(cè)定

1.3.2.1 黃酮的測(cè)定

以空白試劑為對(duì)照，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定不同濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液吸光度，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。蘆丁濃度X與吸光度Y間的回歸方程為Y=11.391X+0.006 4，相關(guān)系數(shù)為0.999 9。

精密吸取2.0 mL樣品溶液，置于10 mL具塞試管中，加入0.3 mL 5% NaNO2溶液，反應(yīng)6 min，再加入0.3 mL 10% Al(NO3)3溶液，搖勻，反應(yīng)6 min，再加4 mL 1 mol/L NaOH溶液終止反應(yīng)，最后加入50%乙醇至10 mL，搖勻，以空白試劑為對(duì)照，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中總黃酮的濃度[10]。

1.3.2.2 粗多糖的測(cè)定

以空白試劑為對(duì)照，在620 nm波長(zhǎng)處測(cè)定不同濃度葡萄糖吸光度。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)Y，以對(duì)照品濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)X，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程Y=38.658X-0.002 4，相關(guān)系數(shù)為0.999 6。

精密吸取1.0 mL樣品溶液，置于10 mL具塞試管中，加入4 mL蒽酮試劑（0.2 g蒽酮溶于100 mL濃H2SO4），迅速置于冰水浴中冷卻。待各管加完后一起浸于沸水中煮沸10 min，取出后用流水冷卻，室溫放置10 min，搖勻，以空白試劑為對(duì)照，在620 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中多糖的含量[11]。

1.3.2.3 多酚的測(cè)定

按照GB/T 8313—2018[12]中規(guī)定的茶多酚的檢測(cè)方法測(cè)定。以空白試劑為對(duì)照，在765 nm波長(zhǎng)處測(cè)定不同濃度沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液吸光度，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)Y，以對(duì)照品取樣量（mg）為橫坐標(biāo)X，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程Y=0.001 6X+0.007 6，相關(guān)系數(shù)為0.999 1。

精密吸取1 mL樣品溶液，置于10 mL具塞試管中，加5 mL 10%福林酚試劑，搖勻。反應(yīng)3~8 min內(nèi)，加入4.0 mL 7.5% Na2CO3溶液，搖勻，室溫下放置60 min，以空白試劑為對(duì)照，在765 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中多酚的濃度。

1.3.2.4 總酸的測(cè)定

按GB/T 12456—2008[13]酸堿滴定法測(cè)定發(fā)酵液中總酸濃度。

1.3.3 抗氧化活性研究

1.3.3.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定

參考You等[14]的方法，準(zhǔn)確配制4×10-4mol/L的DPPH溶液，置于冰箱內(nèi)冷凍避光保存。將體積分?jǐn)?shù)100%的山楂果醋，分別按5%，10%，15%，20%，25%和30%的體積分?jǐn)?shù)加水稀釋，制備不同體積濃度的樣液。取0.5 mL樣液，準(zhǔn)確加入3 mL DPPH溶液，充分混勻后在避光的環(huán)境下放置30 min后，在517 nm條件下測(cè)定吸光度Ai。同時(shí)測(cè)定0.5 mL樣液與3 mL無水乙醇混合液的吸光度Aj，以及無水乙醇0.5 mL與3 mL DPPH溶液混合液的吸光度A0。按式（1）計(jì)算。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：依次配制50，100，150，200和250 μg/mL的VC標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述樣品測(cè)定方法測(cè)定吸光度，以VC濃度為橫坐標(biāo)，清除率縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，VC質(zhì)量濃度X與清除率Y間的回歸方程為Y=0.003 8X+0.035 8，相關(guān)系數(shù)為0.991 4。

1.3.3.2 ABTS自由基清除率的測(cè)定

參考閆亞美等[15]的方法，準(zhǔn)確稱取0.038 4 g的ABTS自由基和0.013 4 g的過硫酸鉀樣品，分別用純水定容至10 mL；之后按照1∶1混合均勻避光保存12 h，形成ABTS+工作液，使用前純水稀釋10倍。將體積分?jǐn)?shù)100%的山楂果醋，分別按5%，10%，15%，20%，25%和30%的體積濃度加水稀釋，制備不同體積濃度的樣液。在樣品管中加入200 μL稀釋好的樣液和3 mL ABTS+溶液靜置6 min，在734 nm處測(cè)定溶液的吸光度Ai。同時(shí)測(cè)定200 μL樣品液和3 mL超純水的吸光度Aj，以及200 μL蒸餾水和3 mL ABTS混合溶液的吸光度A0。按式（2）計(jì)算。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：依次配制50，100，150，200和250 μg/mL的VC標(biāo)準(zhǔn)液，按照上述樣品測(cè)定方法測(cè)定A值，以VC濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，VC質(zhì)量濃度X與清除率Y間的回歸方程為Y=0.004X-0.033 6，相關(guān)系數(shù)為0.995 8。

1.3.3.3 總抗氧化能力測(cè)定

依據(jù)北京索萊寶科技有限公司總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒說明書，稍加改動(dòng)，首先將體積分?jǐn)?shù)100%的山楂果醋，分別按5%，10%，15%，20%，25%和30%的體積濃度加水稀釋，制備不同體積濃度的樣液。按照試劑盒規(guī)定的方法測(cè)定593 nm處的吸光度，計(jì)算ΔA=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白。以Fe2+濃度為橫坐標(biāo)X，ΔA為縱坐標(biāo)Y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程Y=11.186X-0.080 2，將A樣品帶入方程求得X（μmol/mL）。則總抗氧化能力（μmol/mL）按式（3）計(jì)算。

式中：X為Fe2+濃度，μmol/mL；V反總為反應(yīng)總體積，1.02 mL；V樣為反應(yīng)中樣本體積，0.03 mL。

1.3.4 胰脂肪酶活性測(cè)定

參考祁靜等[16]的方法，在干凈錐形瓶中準(zhǔn)確移入8 mL橄欖油乳液、5 mL 0.1 mol/L pH 7.2的PBS緩沖液，然后分別準(zhǔn)確移入3 mL提前調(diào)至pH 7.2的山楂果醋，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢杈鶆?，最后?zhǔn)確移入1 mL 0.20 mg/mL的胰脂肪酶液，再次充分?jǐn)嚢杈鶆?。將上述反?yīng)液置于37 ℃下的恒溫培養(yǎng)振蕩器中反應(yīng)1.5 h，然后加入15 mL 95%乙醇終止酶反應(yīng)。于反應(yīng)液中滴加2滴酚酞指示劑，使用0.02 mol/L NaOH滴定體系中產(chǎn)生的脂肪酸量。

對(duì)胰脂肪酶的活性進(jìn)行檢測(cè)，平行試驗(yàn)3次，胰脂肪酶的酶活計(jì)算采用胰脂肪酶的活力測(cè)定公式（4），胰脂肪酶的活性抑制率計(jì)算公式如式（5）所示。

式中：X為樣品的酶活，μmol/（min·mg）；V1為滴定樣品時(shí)消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V2為滴定空白時(shí)消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；CNaOH為NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；t為反應(yīng)時(shí)間，min；C酶為胰脂肪酶的質(zhì)量濃度，mg/mL；V酶為胰脂肪酶的添加體積，mL。

式中：抑制率為胰脂肪酶的活性抑制率，%；X1為對(duì)照組酶活，μmol/（min·mg）；X2為樣品組酶活，μmol/（min·mg）。

2 結(jié)果與分析

2.1 有效成分變化

山楂發(fā)酵前后有效成分變化如圖1所示。

圖1 山楂發(fā)酵前后有效成分含量變化

由圖1可知：山楂原液中黃酮、多酚、粗多糖和總酸質(zhì)量濃度分別為4.5，4.7，14.6和10.4 mg/mL；山楂酵素中它們的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為7.4，6.7，13.7和36 mg/mL，其中黃酮、多酚、總酸濃度分別提高了64%，43%和246%。

2.2 抗氧化性結(jié)果分析

將不同體積分?jǐn)?shù)（5%~30%）的山楂原液和山楂酵素進(jìn)行清除DPPH、ABTS清除率和總抗氧化能力進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如圖2所示。

由圖2（A）可知，不同體積分?jǐn)?shù)山楂原液和酵素對(duì)DPPH清除率均呈現(xiàn)先上升后逐漸平緩的趨勢(shì)，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為5%和10%時(shí)，酵素的清除率高于原液，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為30%時(shí)二者的清除率相差不大，在95%和97%左右，原液和酵素分別相當(dāng)于241和246 μg/mL VC的清除作用。說明山楂本身含有的有效成分和微生物發(fā)酵產(chǎn)生的代謝物對(duì)DPPH自由基的清除具有顯著作用，經(jīng)發(fā)酵后清除作用增強(qiáng)，隨著體積分?jǐn)?shù)增加，兩者清除作用趨于一致，由此可以看出發(fā)酵引起的成分變化對(duì)DPPH自由基影響不大。

由圖2（B）可知，體積分?jǐn)?shù)在5%~30%區(qū)間內(nèi)，山楂原液對(duì)ABTS自由基的清除率低于酵素，原液在25%~30%區(qū)間逐漸平穩(wěn)，清除率在85%左右，而酵素在20%時(shí)對(duì)ABTS的清除率達(dá)到最大值（99%左右），原液和酵素分別相當(dāng)于221和250 μg/mL左右VC的清除作用。說明微生物發(fā)酵后引起營(yíng)養(yǎng)成分變化，產(chǎn)生的代謝物在清除ABTS自由基方面優(yōu)于原液，且不會(huì)隨酵素體積分?jǐn)?shù)增加而變化。

由圖2（C）可知，在5%~30%范圍內(nèi)，山楂原液和酵素總抗氧化能力整體均呈逐漸上升趨勢(shì)，且酵素的總抗氧化能力明顯高于原液。當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為30%時(shí)，山楂原液和酵素的總抗氧化性分別為6.9和8.8 μmol/mL，酵素的總抗氧化性高于原液。說明微生物生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生的成分變化對(duì)總抗氧化能力T-AOC值影響顯著，山楂經(jīng)過多菌種發(fā)酵更有利于山楂中抗氧化活性成分的保持且隨著體積分?jǐn)?shù)的增加對(duì)總抗氧化能力的影響逐漸增大。

圖2 山楂原液和山楂酵素對(duì)DPPH自由基（A）、ABTS自由基（B）清除率和總抗氧化能力（C）

2.3 山楂酵素對(duì)脂肪酶活性測(cè)定結(jié)果分析

山楂原液和山楂酵素對(duì)脂肪酶活性研究如圖3所示。

圖3 山楂酵素和山楂原液對(duì)脂肪酶抑制率

由圖3可知，山楂酵素和原液均對(duì)脂肪酶有抑制作用，山楂酵素、原液對(duì)脂肪酶的抑制率分別為71.2%和64.7%，酵素的抑制率高于原液，說明經(jīng)混合菌種發(fā)酵后，產(chǎn)生的成分變化和代謝物能夠促進(jìn)對(duì)脂肪酶的抑制作用，提高對(duì)脂肪酶的抑制率。

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明：山楂酵素中黃酮、多酚、總酸濃度分別比原液提高了64%，43%和246%，對(duì)DPPH、ABTS自由基清除率、總抗氧化能力和體外對(duì)脂肪酶抑制率分別提高了2%，16.5%，27.5%和246%，差異顯著，表明山楂酵素的抗氧化能力和對(duì)脂肪酶抑制活性優(yōu)于山楂原液，與相關(guān)研究結(jié)論一致[17-19]。

酵素產(chǎn)品中主要有機(jī)酸為乳酸、乙酸、蘋果酸等[20]，山楂酵素總酸含量大幅上升的原因是體系中的酵母菌、乳酸菌利用可發(fā)酵的碳水化合物，轉(zhuǎn)化成乙醇和乳酸，醋酸菌利用體系中的乙醇將其轉(zhuǎn)化成乙酸；另外山楂本身也含有大量有機(jī)酸，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，有機(jī)酸逐漸溶出；山楂酵素黃酮類物質(zhì)含量上升的原因，可能是由于：①酵母菌發(fā)酵過程中能產(chǎn)生果膠酶；②前處理過程中加入纖維素酶，二者可破壞植物細(xì)胞壁，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)黃酮類物質(zhì)溶出[21-22]。酚類化合物含量上升，可能是由于乳酸菌產(chǎn)生的酶及有機(jī)酸能增加發(fā)酵液中的總酚含量，酵母菌、醋酸菌和乳酸菌的混菌體系在飲料發(fā)酵過程中可將大分子酚類物質(zhì)降解成小分子酚類物質(zhì)[23-24]；山楂發(fā)酵后，抗氧化活性明顯增強(qiáng)，可能是黃酮和多酚類物質(zhì)含量增加的原因，與相關(guān)研究一致[25]。對(duì)脂肪酶活性抑制增加，可能是體系中的黃酮類以及乙酸[26]、乳酸[27]等物質(zhì)含量增加所致，因?yàn)槿呔哂酗@著調(diào)節(jié)血脂的功效[28]。相比山楂原液，山楂酵素的抗氧化能力增強(qiáng)，可以降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而對(duì)肥胖、高血脂和糖尿病等代謝綜合征產(chǎn)生一定防治作用；抑制胰脂肪酶活性，可有效抑制脂質(zhì)代謝過程，降低人體對(duì)膳食脂肪的消化率和代謝產(chǎn)物的吸收率，從而控制血漿脂原濃度的升高，達(dá)到降血脂的功效[17]，這可能也就是2019年國(guó)家將食用酵素列為《產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整指導(dǎo)目錄》鼓勵(lì)類產(chǎn)業(yè)原因之一。